CN109370922A

CN109370922A - 一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用

Info

Publication number: CN109370922A
Application number: CN201811550172.0A
Authority: CN
Inventors: 张雅芬; 叶子弘; 殷淯梅; 夏文强; 俞晓平; 崔海峰
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: CN109370922B

Abstract

一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用，属于生物技术领域。该对菰黑粉菌包括菰黑粉菌单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌单倍体菌株UET2△Itd1，所述的菰黑粉菌单倍体菌株UET1△Itd1保藏号为CGMCC No.16723，所述的菰黑粉菌单倍体菌株UET2△Itd1保藏号为CGMCC No.16724。本发明通过人工选育的方法得到了性亲和的菰黑粉菌单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌单倍体菌株UET2△Itd1，利用该对菰黑粉菌接种于野茭中，能够成功孕出正常茭白，为茭白的人工接种提供了一种新思路。

Description

一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用。

背景技术

菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株与该专一性地寄生在体内的菰黑粉菌共同作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方式，人力物力投入较大。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。而目前已有的人工育种技术只能使野茭孕出灰茭。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用。

所述的一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌，其特征在于包括菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1于2018年11月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.16723，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1于2018年11月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.16724，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1在茭白人工孕茭中的应用。

所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1在共同侵染野茭孕出正常茭白中的应用。

本发明通过人工选育的方法得到了性亲和的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1，利用该对菰黑粉菌接种于野茭中，能够成功孕出正常茭白，为茭白的人工接种提供了一种新思路。

附图说明

图1 为基因克隆电泳图；

图2 为上下游敲除载体示意图；

图3为菌株UET1△Itd1和UET2△Itd1的普通PCR验证及Itd1基因表达量的验证；

图4 为菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1侵染野茭后，茭白孕茭表型图及茭白组织切片共聚焦显微镜观察图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：菰黑粉菌（Ustilago esculenta）Itd1基因的克隆

1. Itd1基因的克隆：通过正常茭白与灰茭的转录组数据的分析，并结合菰黑粉菌基因组三代测序数据，预测得到了与冬孢子形成相关的菰黑粉菌基因位点为g1449。利用NCBI的ORF Finder 功能，对g1449基因开放阅读框（ORF）序列进行预测，发现其开放阅读框长度为2670bp。以菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2 的基因组DNA为模板，并设计引物Itd1-F/R扩增Itd1基因序列,引物Itd1-UF/UR扩增Itd1基因上游启动子序列，引物Itd1-DF/DR扩增Itd1基因下游启动子序列。同时提取两个菌株的总RNA，通过PrimeScript™ II 1st strand cDNASynthesis Kit反转录获得cDNA第一链并作为模板，用引物Itd1-cF/cR扩增Itd1基因的cDNA序列。

PCR扩增反应体系（50μl）为：10×PCR缓冲液5μl，dNTP 4 μL，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA模板1μl，Taq酶0.5 μL，加 ddH₂O 至 50 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止，引物序列如下：

Itd1-F：5’-ATGGTTTCCCACCAAGTCGC-3’（如 SEQ ID NO.5所示）；

Itd1-R：5’-TCACGCCGCGGGTCTTGTCAA-3’ （如 SEQ ID NO.6所示）；

Itd1-UF：5’-GGTGCACGTCATTTGCCCAC-3’ （如 SEQ ID NO.7所示）；

Itd1-UR：5’-GTCGAGTGGCTGTGAGAAAC-3’ （如 SEQ ID NO.8所示）；

Itd1-DF：5’-TGCAGACGAATCAGGGCTGG-3’ （如 SEQ ID NO.9所示）；

Itd1-DR：5’-ACGTTTGCGGACCCAACCAT-3’ （如 SEQ ID NO.10所示）；

Itd1-cF：5’-ATGGTTTCCCACCAAGTCGCC-3’ （如 SEQ ID NO.11所示）；

Itd1-cR：5’-TCACGCCGCGGGTCTTGTCA-3’ （如 SEQ ID NO.12所示）。

将上述PCR产物经1.0%琼脂糖电泳后，回收特异性片段，并连接到PMD19-T 载体上，进行克隆。将克隆得到的阳性转化子进行测序，分别获得g1449基因组序列，该基因核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示，及其上下游和CDS序列（CDS序列如SEQ ID No.2所示），命名为Itd1基因。通过Clone Manager软件比对其基因组上的序列与cDNA序列，发现Itd1基因中有一个长度为111bp的内含子，用EditSeq 软件对Itd1cDNA序列进行蛋白翻译，发现该基因编码852个氨基酸，氨基酸序列如 SEQ ID No.3 所示。如图1为菰黑粉菌（Ustilago esculenta）Itd1基因克隆电泳图。

实施例2：菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1的获得

1. 上下游敲除载体的克隆：利用同源重组的原理，以菌株UET1为模板，用引物Itd1-U2/U3扩增上游敲除片段，用引物Itd1-D1/D2扩增下游敲除片段，以质粒pUM1507质粒为模板，用引物hyg-F/3扩增潮霉素上游片段，用引物hyg-4/R扩增潮霉素下游片段，将基因上游片段与潮霉素上游片段用融合PCR的方法，并用引物Itd1-U2/hyg3获得上游敲除长片段，并连接T载体，转化大肠杆菌；将基因下游片段与潮霉素下游片段用融合PCR的方法，并用引物hyg4/Itd1-D2获得下游敲除长片段（图2为上下游敲除载体示意图），并连接T载体，转化大肠杆菌，用于替换Itd1基因序列的潮霉素（Hyg）基因序列如SEQ ID No.4 所示。引物序列如下：

Itd1-U2：5’ -CGCGTTCTCGACTCGATTG-3’ （如 SEQ ID No.13所示）；

Itd1-U3:5’-GTAGTTACCACGTTCGGCCAATCTAGTGAATGCGGCGAGAG-3’ （如 SEQ ID No.14所示）；

Itd1-D1：5’-TGTCAAACATGAGGCCTGAGTTGAAGATTGCGTGGCTCG-3’ （如 SEQ ID No.15所示）；

Itd1-D2：5’ -TTGCGGACCCAACCATTTC-3’ （如 SEQ ID No.16所示）；

Hyg3: 5’ -GGATGCCTCCGCTCGAAGTA-3’ （如 SEQ ID No.17所示）；

Hyg4: 5’ -CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3’ （如 SEQ ID No.18所示）。

2.原生质体的制备及转化：从-80℃保藏冰箱取出冻存的菰黑粉菌单倍体UET1和UET2并活化在YEPS 固体培养基，置于28℃培养箱2-3天，从 YEPS 固体培养基上挑取菰黑粉菌单倍体UET1和UET2的单菌落接种到 5-10 mL YEPS 液体培养基中，28℃ 180 r/min培养至OD _600nm 在 0.8-1.5 之间，取菌液 1 mL 重新接种到 50 mL YEPS 液体培养基中继续培养至 OD _600nm 为 0.6-0.8。显微观察确认无污染后，离心收集菌体，向菌体中加入10 mLSCS缓冲液，吹打混匀，室温3000 rpm离心2min，弃去上清；加入 900 μL 溶壁酶（15 mg/mL），100 μL 崩溃酶（15 mg/mL），轻轻吹打悬浮菌体，30℃ 110 r/min 酶解 15-20 min，显微观察酶解情况，待视野中出现 30%-40%球状菌株后即可进行下一步。向酶解产物中加入10 mL 预冷的 SCS 缓冲液，轻轻吹打混匀，4℃ 2400 rpm离心 5 min，弃去上清，于冰上重复上一个步骤；于冰上向沉淀中加入 6 mL 预冷的 STC 液，轻轻吹打混匀，4℃ 2400rpm离心 5 min，弃去上清；于冰上向沉淀中加入 1 mL 预冷的 STC 溶液，轻轻吹打混匀，按照每管 100 μL 进行分装，做好标记，-80℃保存。从-80℃冰箱充取出制备好的原生质体置于冰上 10 min；等待时倒含有100 μg/mL潮霉素的再生培养基，每个平皿上倒10-15mL；向解冻片刻的原生质体中加入 1 μL Heparin 溶液（15 mg/mL），再分别加入1-5 μg等量的上下游敲除载体线性 DNA，吹打混匀，冰水浴 10 min；加入 500 μL STC-PEG 溶液，吹打混匀，冰水浴 15 min；等待时在已凝固的抗性平板上倒再生培养基的第二层，每个平皿 10-15mL；取 200 μL 原生质体转化液均匀涂布于再生培养基上，晾干后倒置于28℃恒温培养箱中培养 5 天左右，挑取单菌落。

3.转化子的筛选及验证：挑取转化子至含有潮霉素的 YEPS 固体培养基上继代培养二次，然后再挑取单菌落在含潮霉素的 YEPS 固体培养基上扩大培养。并利用基因验证引物，Itd1-YZ-F/ Itd1-YZ-R,潮霉素验证引物，hyg-YZ-/FR,上游验证引物 Itd1-YZ-U/hyg-YZ-R，以及下游验证引物hyg-YZ-F/ Itd1-YZ-D；PCR扩增反应体系（15μl）为：rTaqNasemix 7.5μl，primer-F（10μM）0.6μl，primer-R（10μM）0.6μl，模板1 μL，加 ddH₂O 至15μL。PCR反应程序：预变性94℃ 4 min；94℃ 15 s，退火Tm 15 s，72℃ 延伸15 sec/kb，35个循环；72℃ 5 min；4℃ 终止。引物序列如下：

Itd1-YZ-F：5’-ACCGACGGCATGATCTGGAG-3’ （如 SEQ ID No.19所示）；

Itd1-YZ-R：5’-CGTTGCCGCTACTGACATGC-3’ （如 SEQ ID No.20所示）；

hyg-YZ-F: 5’-TCGTTATGTTTATCGGCACT-3’ （如 SEQ ID No.21所示）；

hyg-YZ-R: 5’-TCGGCGAGTACTTCTACACA-3’ （如 SEQ ID No.22所示）；

Itd1-YZ-U：5’-TCTAGCACTTGCACAGCGTC-3’ （如 SEQ ID No.23所示）；

Itd1-YZ-D：5’-TGCGACGAGTTGACAACACG-3’ （如 SEQ ID No.24所示）。

通过上述方法筛选得到敲除菰黑粉菌冬孢子形成相关基因UeItd1的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1。菌株UET1△Itd1和UET2△Itd1的普通PCR验证及Itd1基因表达量的验证如图3所示。

菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1具有以下性质：

形态特征：短杆状，成熟的孢子在15-20微米左右，单核无隔膜，进行芽殖，似酵母菌，但比酵母菌大。培养特性：固体培养菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落。液体培养液如细菌菌液。

生理代谢特性：该菌株偏好还原性糖和有机氮源作为其生长的碳氮源。

培养方法：可体外培养，适于在PDA或YEPS固体培养基上进行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上，不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘油保藏。

并将菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1进行保藏，保藏信息如下：

所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1于2018年11月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.16723，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议命名茭白黑粉菌Ustilago esculenta；所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1于2018年11月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.16724，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，建议命名茭白黑粉菌Ustilago esculenta。

实施例3：使茭白植株孕茭的人工接种方法

1）将菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1分别在YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD₆₀₀为0.8-1.0，离心收集菌体，用0.5×YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD₆₀₀为2.0-3.0的菌液，将该菌液两两混合用于接菌；

2）将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，温室培养15-20天，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；

3）将步骤1）得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；

4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，22-25℃温室黑暗放置12-24 h；

5）将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，22-25℃温室黑暗培养7 d，完成接种；

6）将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。

用实施例3中人工接种方法，首次实现了人工接种孕出正常茭白，接种后十天接种苗成活率为15±4.1%，基于成活率的基础上统计的孕茭率为87±14.1%。该接种方法成活率太低，不适宜运用于田间生产，为获得高效稳定的人工接种方法，我们对接种体系进行了优化。

实施例4：接种部位的选择

将菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1分别在YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD₆₀₀为2.0，以1:100的比例稀释至YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD₆₀₀为0.8-1.0，离心收集菌体，用纯水稀释成终浓度为OD₆₀₀为2.0的菌液，将UET1△Itd1和UET2△Itd1菌液等体积混合获得混合菌液。

以采自吴江的野茭管状根作为接种对象，根据接种部位的不同，分为苗叶、叶鞘、管状根；要求选择3-5叶期野茭幼苗的叶子，分成两段用超纯水清洗两次，铺在装有湿润滤纸的直径15 cm玻璃培养皿中，并用湿润的滤纸或棉花盖住叶片两端伤口处。处理一：用针尖在叶片上用针头轻微造成划痕，吸取6μl菌液覆盖在伤口表面便于病原菌的侵入；处理二：在叶片两端的伤口处用菌液沾湿的滤纸或棉花覆盖浸泡；处理三：直接将菌液覆盖在叶片上；对照：以叶片两端伤口用纯水沾湿的滤纸后棉花覆盖。在侵染之后将样品置于28℃培养箱中，避光培养3天后取样观察共聚焦，观察发现采用对叶片侵染的方法，不能使菰黑粉菌成功侵染茭白叶片。选择带有一到两节完整的管状根的3叶期野茭幼苗，将菌液注射进管状根直至菌液溢出并将处理部位于混合菌液浸置处理12 hr，接种3天后取样观察共聚焦发现无菰黑粉菌菌丝侵入，表明菰黑粉菌不能从管状根侵染野茭；选择单株的三叶期野茭幼苗，对苗基部注射混合菌液，并将处理部位与混合菌液中浸置处理12 hr，接种后3天取样观察可以观察到菰黑粉菌的侵入，并伴随着丰富有活力的菌丝，表明接种成功。10月份同一观察，发现仅有对苗基部接种的方法能使野茭孕出灰茭，其余接种方式接种后与对照无明显差异。统计发现，注射浸泡茎基部的方法植株成活率仅有13.3±2.2%，已成活的茭白苗中孕茭率达到91.6±7.8%。

实施例5：对茎基部处理的方法的优化

同样选择3叶期的单株野茭幼苗，分别进行3种接种方法的优化处理，处理一：用混合菌液注射幼苗茎基部，直至菌液从上方叶鞘溢出为止；处理二：将幼苗苗基部于混合菌液中浸置12 hr；处理三：用混合菌液住着幼苗茎基部直至菌液从上方叶鞘溢出，并将处理部位于混合菌液中浸置12 hr；10月份统一观察发现，处理一，处理三都能孕茭，处理二不能孕茭，此外，处理一的接种方法植株成活率（78.3±6.2%）高于处理三（20±4.08%），在已成活的茭白苗中处理一的孕茭率为79.5±9.6%，处理三的孕茭率为91.7±11.8%。由此我们筛选出注射野茭幼苗茎基部的方法可以较好的实现高成活率以及高孕茭率。

实施例6：基于注射茎基部的方法对菌液浓度的优化

利用实施例4混合菌液的获取方法，获得了OD₆₀₀分别为2.0，1.5, 1.0, 0.5, 0的混合菌液，采用实施例4中优化的注射茎基部的方法对野茭幼苗进行侵染，接种后3天取样观察激光共聚焦显微镜发现，用OD₆₀₀为2.0，1.5, 1.0混合菌液在侵染初期均能观察到侵入性菌丝，其余的菌液浓度不能观察到侵染菌丝，10月份统一观察发现：OD₆₀₀为2.0，1.5, 1.0的混合菌液接种的野茭幼苗成活率相似，基于成活率基础上的孕茭率分别为79.4±4.1%，11.6±4.5%，0 。由此我们能确定出注射OD₆₀₀为2.0的混合菌液，确为有效的接种菌液浓度。

实施例7：基于用OD₆₀₀为2.0的混合菌液注射茎基部的方法对不同苗龄的野茭幼苗进行优化

根据苗龄的不同，选择2叶期，3叶期，5叶期，8叶期四个不同叶期的幼苗，采用实施例4中筛选得出的优化的方法，进行注射菌液接种，接种后三天切片激光共聚焦显微镜观察发现，2叶期，3叶期，5叶期，8叶期均有菌丝形成，但8叶期的样品中，菌丝量显然弱于其余几个叶期，10月份统一观察发现，所有叶期的野茭苗均有孕茭，其成活率分别为51.6±4.7%，85±4.1%，91.6±2.3%，96.6±2.3%，表明随着苗龄越大，接种后的成活率也更高，基于成活率的基础上的孕茭率分别为72.05±11.9%，82.9±12.2%，90.8±5.3%，17.2±4.7%。由此得出选择3-5叶期的茭白苗进行侵染可较好的苗龄的选择。

实施例8：正常茭白的人工选育的应用

结合优化的高效的人工接种菰黑粉菌的方法，将该对突变的菰黑粉菌单倍体UET1△Itd1和UET2△Itd1混合菌液接种野茭幼苗。

1）将菰黑粉菌单倍体菌株UET1△Itd1和UET2△Itd1分别在YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD₆₀₀为2.0，以1:100的比例稀释至YEPS液体培养基中25-30℃摇菌至OD₆₀₀为0.8-1.0，离心收集菌体，用纯水稀释成终浓度为OD₆₀₀为2.0的菌液，将UET1△Itd1和UET2△Itd1菌液等体积混合用于接菌；

2）选择野茭管状根进行育苗，温室培育20-30天，并移栽至10×10cm的小盆，营养土轻微覆盖根部，并于相同条件的温室继续培育7-10天，选择3-5叶期的野茭幼苗作为接种对象；

3）对步骤1）得到的混合菌液用注射器注射苗基部，直至菌液从叶鞘上方溢出为止；

4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉；

5）将接种后的幼苗继续放在22-25℃温室过渡培养，两周后完成接种，即可移栽室外露天栽培；

6）移栽室外露天栽培的时间应控制在3-4月以及9-10月份，防止室外温度过高或过低不利于菌的生长，施肥参考正常茭白种植标准；

到秋季10月，接种幼苗成功孕茭，孕茭率达到87.3±6.7%，且为正常茭白，该茭白孕茭表型图及茭白组织切片共聚焦显微镜观察图，如图4所示。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2670

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)

<400> 1

atggtttccc accaagtcgc cacgtttcag ggctatgtgt atgttgattc ggctcggcac 60

catccgccct tctactgtcc agctttgtgc tgattggctg acaacttgaa tattcgacct 120

tctctatcgt cttccgttgt ttctcacagc cactcgactc gagatgcttt gcttatcttt 180

gaagcggtac ggcgcggaca actgcccaag atcacacgac gactccgcga cgatgagcgc 240

aagatgatcc aaagcggaac catctttgtg tttgatgagg ctgaatccag catcaagaga 300

tggaccgacg gcatgatctg gagtccaagt cgaatcctga acaactttct agtctatcgt 360

gaagtggaga aaaaggatcc gaagcctgcg accgaccaac ctgccttcgc cacatcgcac 420

tctagcttcg cgatgcaggg cgcagctctc aacagcagcc atccctcgca gcattcgtct 480

gtccgctctg tgcccctcac gctgatgccc aatgctatgg acgcggatgc acaaatgacg 540

cactacaagc aagagcacag tggctaccat tcggtcgagg gcgtctcttc ctcttccaat 600

cctggctact cggaacacga tggctttttt ggcggccatg ctcatcacca tcattccgcg 660

cacgcacaag cgcatgcgca agcagccggg ctggtaggtc tgttggacga aggcgccgca 720

tcttcgtcgg cggtcaaacg cgaagtagag ctggatagga cgatcgttgg aagcttgaca 780

agcagctacc catttgtgcg tgatggactg tgcaagaaga ccatctcgat ccaggtggaa 840

ggctccacac agcacctcat ttcgtactac aagatcgacg atgtgcacca tggacgtctg 900

acgattccat ccaaccttcc cgagctcttc tgttttagca tctcgcccat cttcctcaac 960

aagagcaact ttcgctaccc ccccatcgtc gagatgggtc ccgacggctt gccgaggtac 1020

gtgggcgaat caaccgacaa cgccatgcgt gcctcggggc atgtcagtag cggcaacgag 1080

agctactcgt ctgggtccga ggcgaggcac gaagggcttg gaagagccgc tagtcggtcg 1140

ctgtccatct actcgccagc tcttccctcc gatcctacgc acaacgagtt ctacagtagc 1200

agatacccgc accagatcgg cggggatggt atacttccga actcggctaa tttaccctcg 1260

tcatcgacct cttcgttgcc gtaccggagc aggcgctcat ccgacgctcc acgcagacga 1320

gctaattcga ggtacgagcc ataccagcag gcacctggct ttggccatgg gatggtgccc 1380

actcaacttt actcgaatag cccggcgatg gatcatggcc ccgtctcgcc atcggggcgc 1440

cgagcctttt tcccacctcc gcgtggctac agcgacgcgg aggcagcaca cgcatcagaa 1500

catacatcgt ttggaatgca tcgtcaagat gctgggttct tcgcgatcgg acaggtagat 1560

cacgcaagcg gtcagaatgg cgggcatctg aaccagcccc acgcttcgat ggaccaggtt 1620

gatcagcacg gcgatctaca gcagtcgttt cagccagggc ccgtgattcc ttttgtgcct 1680

agtcagccta gccgcagtca cacgagctac tcgacagggg ccgacttgat gcacggcagg 1740

tacgacgctg ttgggatgaa gcaggaacag gcggatccat ttcacttttc atcgcggctt 1800

gcgagaggaa gctgggactc gaaccagccg agccatccga atgttgtgca ccacgtgcag 1860

caacctcctg cgacgagcca gggcttgacg gcgatatcga tccacagtca gtccaacttt 1920

ggtgggcccg tgtatggccg tctggttggg tcgcctccca acacgagctc gtcgcacgac 1980

agccgccact cttacatggg cagcggaccc acacacgcga cgggtcgcat cggagagttg 2040

gtggatggcg tgcttccgac gacagcggct cggctcgagg aagcaaacta ctcgtcgcgc 2100

cccatgtctc gtgctggaga aggaggatac gtcggcgatc tggactcggc aggtgtggta 2160

caaacagggc cgttggaggc gctgcaagtt gattctgacc caaccagccc ctatgcgagg 2220

tctcaccagc atccattgca tgcatcgcat gcgcagcatc aaatactggg gaatgacgct 2280

gccggagtcg acggctacgg tcggcctgcc accgagatgg atgcacagcc gcctttctat 2340

ccgccaccgc agacgtcgta tccgccacag gaacatgacg gcgtccagct ggaccagcaa 2400

gctttcggtc gtcatgctca agacggctat gcatcgacgc aggcctacgc gtcgaacgga 2460

atcgtgcctg gatcggcgca taacgagcaa tcctggtcgg atccggtcca agagggcaac 2520

ggcgctacca cggcggatca atcatacccg tcgcggccgg ggacatccca cgatcaggct 2580

taccaccacc agtaccgcaa cgaaggcggt gacgccaatg cagacgaatc agggctggaa 2640

aaggtcatgt tgacaagacc cgcggcgtga 2670

<210> 2

<211> 2559

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)

<400> 2

atggtttccc accaagtcgc cacgtttcag ggctatgtcc actcgactcg agatgctttg 60

cttatctttg aagcggtacg gcgcggacaa ctgcccaaga tcacacgacg actccgcgac 120

gatgagcgca agatgatcca aagcggaacc atctttgtgt ttgatgaggc tgaatccagc 180

atcaagagat ggaccgacgg catgatctgg agtccaagtc gaatcctgaa caactttcta 240

gtctatcgtg aagtggagaa aaaggatccg aagcctgcga ccgaccaacc tgccttcgcc 300

acatcgcact ctagcttcgc gatgcagggc gcagctctca acagcagcca tccctcgcag 360

cattcgtctg tccgctctgt gcccctcacg ctgatgccca atgctatgga cgcggatgca 420

caaatgacgc actacaagca agagcacagt ggctaccatt cggtcgaggg cgtctcttcc 480

tcttccaatc ctggctactc ggaacacgat ggcttttttg gcggccatgc tcatcaccat 540

cattccgcgc acgcacaagc gcatgcgcaa gcagccgggc tggtaggtct gttggacgaa 600

ggcgccgcat cttcgtcggc ggtcaaacgc gaagtagagc tggataggac gatcgttgga 660

agcttgacaa gcagctaccc atttgtgcgt gatggactgt gcaagaagac catctcgatc 720

caggtggaag gctccacaca gcacctcatt tcgtactaca agatcgacga tgtgcaccat 780

ggacgtctga cgattccatc caaccttccc gagctcttct gttttagcat ctcgcccatc 840

ttcctcaaca agagcaactt tcgctacccc cccatcgtcg agatgggtcc cgacggcttg 900

ccgaggtacg tgggcgaatc aaccgacaac gccatgcgtg cctcggggca tgtcagtagc 960

ggcaacgaga gctactcgtc tgggtccgag gcgaggcacg aagggcttgg aagagccgct 1020

agtcggtcgc tgtccatcta ctcgccagct cttccctccg atcctacgca caacgagttc 1080

tacagtagca gatacccgca ccagatcggc ggggatggta tacttccgaa ctcggctaat 1140

ttaccctcgt catcgacctc ttcgttgccg taccggagca ggcgctcatc cgacgctcca 1200

cgcagacgag ctaattcgag gtacgagcca taccagcagg cacctggctt tggccatggg 1260

atggtgccca ctcaacttta ctcgaatagc ccggcgatgg atcatggccc cgtctcgcca 1320

tcggggcgcc gagccttttt cccacctccg cgtggctaca gcgacgcgga ggcagcacac 1380

gcatcagaac atacatcgtt tggaatgcat cgtcaagatg ctgggttctt cgcgatcgga 1440

caggtagatc acgcaagcgg tcagaatggc gggcatctga accagcccca cgcttcgatg 1500

gaccaggttg atcagcacgg cgatctacag cagtcgtttc agccagggcc cgtgattcct 1560

tttgtgccta gtcagcctag ccgcagtcac acgagctact cgacaggggc cgacttgatg 1620

cacggcaggt acgacgctgt tgggatgaag caggaacagg cggatccatt tcacttttca 1680

tcgcggcttg cgagaggaag ctgggactcg aaccagccga gccatccgaa tgttgtgcac 1740

cacgtgcagc aacctcctgc gacgagccag ggcttgacgg cgatatcgat ccacagtcag 1800

tccaactttg gtgggcccgt gtatggccgt ctggttgggt cgcctcccaa cacgagctcg 1860

tcgcacgaca gccgccactc ttacatgggc agcggaccca cacacgcgac gggtcgcatc 1920

ggagagttgg tggatggcgt gcttccgacg acagcggctc ggctcgagga agcaaactac 1980

tcgtcgcgcc ccatgtctcg tgctggagaa ggaggatacg tcggcgatct ggactcggca 2040

ggtgtggtac aaacagggcc gttggaggcg ctgcaagttg attctgaccc aaccagcccc 2100

tatgcgaggt ctcaccagca tccattgcat gcatcgcatg cgcagcatca aatactgggg 2160

aatgacgctg ccggagtcga cggctacggt cggcctgcca ccgagatgga tgcacagccg 2220

cctttctatc cgccaccgca gacgtcgtat ccgccacagg aacatgacgg cgtccagctg 2280

gaccagcaag ctttcggtcg tcatgctcaa gacggctatg catcgacgca ggcctacgcg 2340

tcgaacggaa tcgtgcctgg atcggcgcat aacgagcaat cctggtcgga tccggtccaa 2400

gagggcaacg gcgctaccac ggcggatcaa tcatacccgt cgcggccggg gacatcccac 2460

gatcaggctt accaccacca gtaccgcaac gaaggcggtg acgccaatgc agacgaatca 2520

gggctggaaa aggtcatgtt gacaagaccc gcggcgtga 2559

<210> 3

<211> 852

<212> PRT

<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)

<400> 3

Met Val Ser His Gln Val Ala Thr Phe Gln Gly Tyr Val His Ser Thr

1 5 10 15

Arg Asp Ala Leu Leu Ile Phe Glu Ala Val Arg Arg Gly Gln Leu Pro

20 25 30

Lys Ile Thr Arg Arg Leu Arg Asp Asp Glu Arg Lys Met Ile Gln Ser

35 40 45

Gly Thr Ile Phe Val Phe Asp Glu Ala Glu Ser Ser Ile Lys Arg Trp

50 55 60

Thr Asp Gly Met Ile Trp Ser Pro Ser Arg Ile Leu Asn Asn Phe Leu

65 70 75 80

Val Tyr Arg Glu Val Glu Lys Lys Asp Pro Lys Pro Ala Thr Asp Gln

85 90 95

Pro Ala Phe Ala Thr Ser His Ser Ser Phe Ala Met Gln Gly Ala Ala

100 105 110

Leu Asn Ser Ser His Pro Ser Gln His Ser Ser Val Arg Ser Val Pro

115 120 125

Leu Thr Leu Met Pro Asn Ala Met Asp Ala Asp Ala Gln Met Thr His

130 135 140

Tyr Lys Gln Glu His Ser Gly Tyr His Ser Val Glu Gly Val Ser Ser

145 150 155 160

Ser Ser Asn Pro Gly Tyr Ser Glu His Asp Gly Phe Phe Gly Gly His

165 170 175

Ala His His His His Ser Ala His Ala Gln Ala His Ala Gln Ala Ala

180 185 190

Gly Leu Val Gly Leu Leu Asp Glu Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ala Val

195 200 205

Lys Arg Glu Val Glu Leu Asp Arg Thr Ile Val Gly Ser Leu Thr Ser

210 215 220

Ser Tyr Pro Phe Val Arg Asp Gly Leu Cys Lys Lys Thr Ile Ser Ile

225 230 235 240

Gln Val Glu Gly Ser Thr Gln His Leu Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Asp

245 250 255

Asp Val His His Gly Arg Leu Thr Ile Pro Ser Asn Leu Pro Glu Leu

260 265 270

Phe Cys Phe Ser Ile Ser Pro Ile Phe Leu Asn Lys Ser Asn Phe Arg

275 280 285

Tyr Pro Pro Ile Val Glu Met Gly Pro Asp Gly Leu Pro Arg Tyr Val

290 295 300

Gly Glu Ser Thr Asp Asn Ala Met Arg Ala Ser Gly His Val Ser Ser

305 310 315 320

Gly Asn Glu Ser Tyr Ser Ser Gly Ser Glu Ala Arg His Glu Gly Leu

325 330 335

Gly Arg Ala Ala Ser Arg Ser Leu Ser Ile Tyr Ser Pro Ala Leu Pro

340 345 350

Ser Asp Pro Thr His Asn Glu Phe Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro His Gln

355 360 365

Ile Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Asn Ser Ala Asn Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ser Thr Ser Ser Leu Pro Tyr Arg Ser Arg Arg Ser Ser Asp Ala Pro

385 390 395 400

Arg Arg Arg Ala Asn Ser Arg Tyr Glu Pro Tyr Gln Gln Ala Pro Gly

405 410 415

Phe Gly His Gly Met Val Pro Thr Gln Leu Tyr Ser Asn Ser Pro Ala

420 425 430

Met Asp His Gly Pro Val Ser Pro Ser Gly Arg Arg Ala Phe Phe Pro

435 440 445

Pro Pro Arg Gly Tyr Ser Asp Ala Glu Ala Ala His Ala Ser Glu His

450 455 460

Thr Ser Phe Gly Met His Arg Gln Asp Ala Gly Phe Phe Ala Ile Gly

465 470 475 480

Gln Val Asp His Ala Ser Gly Gln Asn Gly Gly His Leu Asn Gln Pro

485 490 495

His Ala Ser Met Asp Gln Val Asp Gln His Gly Asp Leu Gln Gln Ser

500 505 510

Phe Gln Pro Gly Pro Val Ile Pro Phe Val Pro Ser Gln Pro Ser Arg

515 520 525

Ser His Thr Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Asp Leu Met His Gly Arg Tyr

530 535 540

Asp Ala Val Gly Met Lys Gln Glu Gln Ala Asp Pro Phe His Phe Ser

545 550 555 560

Ser Arg Leu Ala Arg Gly Ser Trp Asp Ser Asn Gln Pro Ser His Pro

565 570 575

Asn Val Val His His Val Gln Gln Pro Pro Ala Thr Ser Gln Gly Leu

580 585 590

Thr Ala Ile Ser Ile His Ser Gln Ser Asn Phe Gly Gly Pro Val Tyr

595 600 605

Gly Arg Leu Val Gly Ser Pro Pro Asn Thr Ser Ser Ser His Asp Ser

610 615 620

Arg His Ser Tyr Met Gly Ser Gly Pro Thr His Ala Thr Gly Arg Ile

625 630 635 640

Gly Glu Leu Val Asp Gly Val Leu Pro Thr Thr Ala Ala Arg Leu Glu

645 650 655

Glu Ala Asn Tyr Ser Ser Arg Pro Met Ser Arg Ala Gly Glu Gly Gly

660 665 670

Tyr Val Gly Asp Leu Asp Ser Ala Gly Val Val Gln Thr Gly Pro Leu

675 680 685

Glu Ala Leu Gln Val Asp Ser Asp Pro Thr Ser Pro Tyr Ala Arg Ser

690 695 700

His Gln His Pro Leu His Ala Ser His Ala Gln His Gln Ile Leu Gly

705 710 715 720

Asn Asp Ala Ala Gly Val Asp Gly Tyr Gly Arg Pro Ala Thr Glu Met

725 730 735

Asp Ala Gln Pro Pro Phe Tyr Pro Pro Pro Gln Thr Ser Tyr Pro Pro

740 745 750

Gln Glu His Asp Gly Val Gln Leu Asp Gln Gln Ala Phe Gly Arg His

755 760 765

Ala Gln Asp Gly Tyr Ala Ser Thr Gln Ala Tyr Ala Ser Asn Gly Ile

770 775 780

Val Pro Gly Ser Ala His Asn Glu Gln Ser Trp Ser Asp Pro Val Gln

785 790 795 800

Glu Gly Asn Gly Ala Thr Thr Ala Asp Gln Ser Tyr Pro Ser Arg Pro

805 810 815

Gly Thr Ser His Asp Gln Ala Tyr His His Gln Tyr Arg Asn Glu Gly

820 825 830

Gly Asp Ala Asn Ala Asp Glu Ser Gly Leu Glu Lys Val Met Leu Thr

835 840 845

Arg Pro Ala Ala

850

<210> 4

<211> 1884

<212> DNA

<213> 潮霉素基因(Hyg)

<400> 4

tggccgaacg tggtaactac cagcgagttc tgcaaacttc aaaaaaaaaa tctgggcacg 60

atgaaagttg agctaacgct gacgctcaca aatggcgtgg ctaaaggaag cgagacaatc 120

ggaaaattgt tctctcgggc accacaaagc tgttgttagt cgctgaagaa caattccaac 180

tgattccgcc gccttcctat tgcgtcagcc ttgtacctaa gctgccgagt aacgtcactc 240

aacctctctt ttcagactgc tttgctccgc gaatactttt cttctatgcg ctcaagaaaa 300

tgacacagca caccaagctc tgcaaacttt cttcgctaat ctgacgcgaa atgtgagcca 360

tttcttctcg cctgcaatgg caatgcgtct gtgcggcgat gagaatcacg atgcggaatg 420

ggtggctgga agttcataga gatgctgagt tgttggagcg acatggtaca taagcatgag 480

tctgtcctga tttccaccct cccgtctttc atcaactttc tcgtctgacc cttccgttgc 540

cagatcccgg ggggccatgg aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct 600

gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg 660

tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga 720

tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc 780

ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 840

acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt 900

cgcggaggcc atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 960

attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 1020

tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 1080

gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 1140

gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 1200

tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 1260

gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga 1320

gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta 1380

tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc 1440

aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc 1500

cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac 1560

tcgtccgagg gcaaaggaat agagcggccg cccggctgca gatcgttcaa acatttggca 1620

ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct 1680

gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg 1740

ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata 1800

gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atccgatgat 1860

aagctgtcaa acatgaggcc tgag 1884

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 5

atggtttccc accaagtcgc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 6

tcacgccgcg ggtcttgtca a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 7

ggtgcacgtc atttgcccac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 8

gtcgagtggc tgtgagaaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 9

tgcagacgaa tcagggctgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 10

acgtttgcgg acccaaccat 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 11

atggtttccc accaagtcgc c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 12

tcacgccgcg ggtcttgtca 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 13

cgcgttctcg actcgattg 19

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 14

gtagttacca cgttcggcca atctagtgaa tgcggcgaga g 41

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 15

tgtcaaacat gaggcctgag ttgaagattg cgtggctcg 39

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 16

ttgcggaccc aaccatttc 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 17

ggatgcctcc gctcgaagta 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 18

cgttgcaaga cctgcctgaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 19

accgacggca tgatctggag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 20

cgttgccgct actgacatgc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 21

tcgttatgtt tatcggcact 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 22

tcggcgagta cttctacaca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 23

tctagcactt gcacagcgtc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 24

tgcgacgagt tgacaacacg 20

Claims

1.一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌，其特征在于包括菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1保藏号为CGMCC No.16723，所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1保藏号为CGMCC No.16724。

2.如权利要求1所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1在茭白人工孕茭中的应用。

3.如权利要求1所述的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1△Itd1和菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET2△Itd1在共同侵染野茭孕出正常茭白中的应用。