CN105838616B

CN105838616B - 一种菰黑粉菌单倍体菌株uet1及其应用

Info

Publication number: CN105838616B
Application number: CN201610058044.9A
Authority: CN
Inventors: 张雅芬; 崔海峰; 叶子弘; 俞晓平
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2036-01-28
Also published as: CN105838616A

Abstract

一种菰黑粉菌单倍体菌株UET1及其应用，属于生物技术领域。该菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1，保藏号为：CGMCC No.11843。茭白人工育种需要两种性亲和单倍体菌株的共同侵染，该菌株可以作为茭白人工育种的母体菌株，通过筛选得到其性亲和的单倍体菌株后，通过人工接种方法即可以实现人工孕茭。同时该单倍体菌株可以进行基因工程改造从而为接下来的茭白品种改良，如提高茭白的环境适应性、控制结茭时间等茭白育种工作提供实施基础材料。

Description

一种菰黑粉菌单倍体菌株UET1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菰黑粉菌单倍体菌株UET1及其应用。

背景技术

菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是该专一性寄生的菰黑粉菌与茭白植株互相作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方式，人力物力投入较大，而且菰黑粉菌存在多个生理小种，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品种性状不稳定，退化明显。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。

研究表明菰黑粉菌的两个性亲和单倍体混合接种可以使正常开花的野茭植株孕茭，即植株茎基部发生膨大并且不再抽穗开花，而非性亲和单倍体菌株混合、双核菌丝或冬孢子接种均无法使野茭植株孕茭（近源的玉米瘤黑粉菌研究进展亦表明黑粉菌的侵染需要两个性亲和单倍体一起混合接种），因此，菰黑粉菌性亲和单倍体的获得是保障茭白人工育种的前提。而自然界中菰黑粉菌以二倍体冬孢子或者双核菌丝存在，没有单倍体菌株。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种菰黑粉菌单倍体菌株UET1及其应用的技术方案。

本发明提供的一种菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1能够促使茭白人工孕茭和茭白品种改良。该菌株于2015年12月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11843。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株具有以下性质：

形态特征：短杆状，成熟的孢子在15-20微米左右，单核无隔膜，进行芽殖（图2），似酵母菌，但比酵母菌大。

培养特性：固体培养（YEPS固体培养基：2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂糖）菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落。液体培养（YEPS液体培养基：2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉）后菌液均一，如细菌菌液。

生理代谢特性：该菌株偏好还原性糖（图4）和有机氮源（图5）作为其生长的碳氮源。

培养方法：可体外培养，适于在PDA或YEPS固体培养基上进行单菌落划线培养，在液体培养中培养容易降低该菌活性。另外该菌不适宜继代三次以上，不适宜7天以上的连续培养或低温放置，否则易造成活性降低或菌体降解，适宜在-80度20%甘油保藏。

繁殖方法：芽殖。

本发明的有益效果：茭白人工育种需要两种性亲和单倍体菌株的共同侵染，该菌株可以作为茭白人工育种的母体菌株，通过筛选得到其性亲和的单倍体菌株后，通过人工接种方法即可以实现人工孕茭。同时该单倍体菌株可以进行基因工程改造从而为接下来的茭白品种改良，如提高茭白的环境适应性、控制结茭时间等茭白育种工作提供实施基础材料。

附图说明

图1为UET1单倍体菌株获得途径示意图；

图2为核定位EGFP蛋白过表达的单倍体菌株芽殖形态图；

图3为单倍体菌株固体培养形态图；

图4为单倍体菌株在不同碳源培养基中的生长速率变化图；

图5为单倍体菌株在不同氮源培养基中的生长速率变化图；

图6为野茭植株人工接种菰黑粉菌后孕茭过程中茭白植株茎尖组织切片荧光显微观察图，其中左边图为接种液中含有UET1菌株，右边图为接种液中不含UET1菌株；

图7为菌种及交配型基因的PCR鉴定结果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：菌株筛选方法

1.收集冬孢子：从龙茭2号灰茭中（图1A）直接挑取冬孢子。

2.冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经4层灭菌纱布过滤，获得较纯的冬孢子悬液，最后再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为10³个孢子/mL。冬孢子形态如图1B所示。

3.冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养约60h，以肉眼可见细小分散的单菌落（图1C）为标准。担孢子分离培养基（1 L）配方为：K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，KCl 0.5 g，葡萄糖18 g，(NH₄)₂SO₄ 5.28 g，琼脂10 g。

4.单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成10³个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子（图1D），将分离出的担孢子在YEPS（2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂粉）固体培养基上，28℃培养4 d。一个单菌落分离5个担孢子，取3个以上单菌落。担孢子培养后的菌落形态如图1E所示。

5.显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑（图1F）则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝（图1G），则舍弃。

6.性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号（图1E），并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD₆₀₀为2.0的菌液。通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定。融合反应实验如图1H，具体过程为：将1号菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 µL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数。之后将剩余的各菌液各取1 µL分别覆盖于1号菌株菌点上方，标记菌株号，于28℃培养箱中培养4 d。培养后对菌落形态进行肉眼观察，若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株。如图1H中所示，1号菌株与2、3、4、8或11号菌株可能为性亲和单倍体菌株。

7. PCR鉴定：通过对其交配型位点的克隆分析，发现菰黑粉菌中存在3个信息素受体pra基因，分别为pra1、pra2和pra3，pra1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。众所周知，一个单倍体菌株中只可能存在一个pra基因，而两个性亲和的单倍体菌株中pra基因不一样。因此设计特异性引物用于进一步对筛选得到的单倍体进行PCR验证并进一步确认彼此间的性亲和性。

以上述筛选到的12个单倍体菌株为例，提取各菌株的DNA，先通过引物ITS1和ITS4扩增ITS序列并测序进行菌种鉴定，PCR结果如图7D所示，测序结果经NCBI比对后表明均属于Ustilago esculenta。

接下来对各个菌株基因组DNA中的pra1，pra2和pra3进行PCR扩增，结果如图7A，B，C所示，表明2、4号菌株的信息素受体基因为pra3,3、8、11号菌株的信息素受体基因为pra2，其余菌株的信息素受体基因为pra1，即我们筛选得到的菌株1信息素受体基因为pra1，与2、3、4、8或11号菌株的基因型不一样，因此1号菌株与2、3、4、8或11号菌株为性亲和单倍体菌株。PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止，扩增片段长度均在600 bp上下，引物序列如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示），

pra1-F：5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示），

pra1-R：5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示），

pra2-F：5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示），

pra2-R：5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示），

pra3-F：5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示），

pra3-R：5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’（核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示）。

8.确定单倍体菌株：当采用引物pra1-F和pra1-R扩增后得到长度在600 bp上下扩增片段的菌株确定为单倍体菌株UET1。

该菌株具有以下性质：

培养特性：固体培养（YEPS固体培养基：2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂糖）菌落呈乳黄色，表面光滑，较湿润，比细菌菌落更大更厚，挑取时比细菌粘稠，类似酵母菌落（图3）。液体培养（YEPS液体培养基：2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉）后菌液均一，如细菌菌液。

繁殖方法：芽殖。

实施例2：人工孕茭试验

通过PEG介导的原生质体转化技术将过表达EGFP绿色荧光蛋白的载体转化菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1及其性亲和菌株（选取实施例1中的2号、3号），使其过表达EGFP绿色荧光蛋白，通过荧光显微镜可检测获得的过表达菌株，成功过表达EGFP绿色荧光蛋白的菌株可在荧光显微镜下看到绿色荧光信号，如图2所示。而后进行人工接种实验，具体人工接种过程如下：

1）将两个菰黑粉菌性亲和单倍体菌株在YEPS液体培养基中28℃摇菌至OD₆₀₀为1.0，离心收集菌体，用0.5×YEPS液体培养基稀释成终浓度为OD₆₀₀为3.0的菌液，将两菌液混合用于接菌；

2）将带有3个以上完整节间的野茭管状根进行育苗，25℃温室培养20天，以萌发有3个以上小苗期植株的管状根为接种对象，并对苗基部进行扎孔处理；

3）将步骤1）得到的混合菌液用注射器注射管状根，直到有菌液溢出为止；

4）将处理后的接种苗进行修剪，防止过多的蒸腾作用导致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，25℃温室放置12 h；

5）将浸菌后的野茭苗转移至带营养土的小盆中进行过渡接种，待土充分湿润后将混合菌液倒入土中，25℃温室培养7 d，完成接种；

6）将接种后的苗移植室外或培养箱中进行露天栽培，接种栽培时间控制在3月份，施肥参考正常茭白种植标准。

结果我们发现该菌株与其性亲和菌株3号一起侵染野生茭白植株可以使野生茭白植株茎基部膨大形成茭白，而2号和3号性亲和菌株混合（即缺失菌株UET1后）野生茭白植株茎基部不再膨大，即无法孕茭。对接种后两种表型的茭白植株茎尖生长点取样，进行组织切片后在荧光显微镜下观察发现：茎基部膨大的植株中可以明显观察到带有绿色荧光的菌丝，而未膨大的植株茎尖无绿色荧光信号（图6），表明该孕茭过程需要UET1的参与，即单倍体菌株UET1可应用于人工孕茭。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国计量学院

<120> 一种菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1及其应用

<130> 1

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1316

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌

<400> 1

atgcttgatc acgtttcgcc tttcctttca ttgctcgcca gtgttctagt ctttatgcca 60

cttgcttggc acgtcaagag tagaaacgtt ggtacgatag tcctttcgat ctggctcatc 120

cttggcaatc ttgataactt cattaattca atggtatggt ggaacaccac ggcgaataag 180

gctccaggct tttgcgaaat aagtaagctc acaatttatg aatcactcct catcggcatc 240

ctcgctcatt atgatttact ttgcgttgct attttacagg catccgattg cggcatgcgt 300

tgtttgtcgc catccctgcc tccaaccttg tcatcgcacg aaaattagag agcatagcat 360

cgaccagaca agttcgagcc agcgcagcag accgaaagaa gtcggtcatc atcgatctac 420

tcatatcggt tggcgtgcca gtcatttatg tctcgcttat gattgtaaat caatctaatc 480

gttacggtat cgtcgaggag gctggatgct ggcccattct tgtaccttct tgggtctggg 540

tcttgcttgt cgcggtacca gttgtcctca tatccctttg ctcggccgta tacagtggta 600

agtgcagctg atcgccccat cccctgggct ttgaaccttg caactctaaa ctgactggtt 660

cggtcaatca cagtcgtagc gttccgatgg ttttggattc gaaggcgtca atttcaagca 720

gtgctggcaa gcagcgcatc gacgatcaac aaatctcgtt atgtcaggct tctcatgctg 780

actgctatcg acatgttgct attcttcccg gtttatgtcg gagccatcgc aacggagatc 840

aagcatgcaa tcaccacacc gtatggctca tggtctagcg ttcattctgg cttcagtcag 900

gttctctcgt tcccggctgc ggccatagag atgcaaagta gtttcagaag aaaccttatc 960

ctgtctcgac tcgtctgccc tctatccgcc tacatcttct tcgcaatgtt cgggcttggc 1020

ctggaggcac gtcaaggtta caagaatgcc ttcggcaggc ttctggtctt ttttaagttg 1080

cgaaaggagt ccaagccagc agtacctgag taagtacaca gcaattgcaa aaacatctac 1140

cccgcattga ggtgctcggt tcactaactt ttgccctctt cccgtacaga cccatcgttg 1200

cagatattga ggttgttacc ttccagtctc atgatcctta tgccgttgct gagactagtc 1260

cgtactcgga gaagtccggt gccgacactc caaagtacga agactcttgg aagtaa 1316

<210> 2

<211> 1218

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌

<400> 2

atggtgtttt cagcagctga aaacgcctgt tacggcacac tctgtatatt gacagcatgt 60

cttcccacct tttcttttcc cgttcatttt cgggctggaa acactggggt cttgctcatg 120

atattttggt gcttcctcgg ccccttcaac aagggagtaa atgctcttgc atttaatcac 180

aatcttcaag ttcattggac ctttggttgc gacatcagcg ctgtcatcga acgaatctgg 240

caaataggct tgtgctgtag ttcgctttgt attttgcaga agctggagag cattgcttcc 300

ctcaggcaag cgcattcaag caatgcggat aggagacgca gactatgcat cgacttatct 360

gtgggacttg gagtccccat ccttcaaatt ccgttattct tcgtcgttca accatacaga 420

ctcgatgtga tcgaaaatat cggatgcagt gctccgctct acaactctgt acccgcgctg 480

ttcgtctact atttgtggag gctcctcatc agcgtcctgt gctccgtctt tgcaggtatg 540

tccattcctt ggcttggaat cttcgacgct acttcatgct gaccttgtct ttgactcaac 600

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tcaacattca ggcctgtctc aaaaaaaata cttccgctta ttcgccctgg cagtctgcga 720

agcgactctc gtctcggttg cacaatttta tctcatcata gactcactgc gactaactgg 780

tctgctccct tattcgaact gggcacaagt acacatcaac ttcgatacga ttgcgtacgt 840

tccgatgatc agagaaggag gcacatctca tgcctcagtc tcccttacaa ttttcaggtg 900

gttgtccttg tctccagctc tcgctctgtt cttctttttt ggtctcacgg aagatgcgaa 960

ggcgacctac cagagcttct ggcaggcaat caagaaaatg ggccaagcat ttcagtaagt 1020

atggcgaaat ttttattatt tggtcaatcc tttgagtgct catcgaattt gacgacgttg 1080

tcttgtagac caaggatgag aaacaggggc tctggaaagc acatcaaccc agagaatcac 1140

tccctcgacc tcgaacactt tcaggatcaa aacagcaaag tttcgattgt gctgcacaaa 1200

gacatcgtga ttacttga 1218

<210> 3

<211> 1479

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌

<400> 3

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tgttcaacta gccttttcat cgcaatcaac actgctggat ggcaacacaa tgtttcagat 180

aagtggcagg tgtattgcga aatttgtaag tgaccaagtc cgataaaaaa ctgtttaaga 240

tcaccagcta actcgcccca aatcctttga ttttcacttt tattatgatt attacgtttc 300

ctattattat tttctctttc ttcatagccg ttcgaatcgt gtacgcctcc cctttcgccc 360

ttcaatgctg ctcagtgctt ctactcagtc gcctcgaagc aatcgctgcg actcgatacg 420

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ctagtgctct gtgcttattg gctattcctg cgcaggaggc aattaagtgc agtactttcc 780

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gagctcttat ggaccgtacc aatcaattgg agcgtccaga tgcagaacct tcttaataga 900

ggcgacaacg gccaagttct gtacccatac aagtcttggg cgtacgtaca tcaaggatac 960

tggtctattt cacaggttac catcgaggac cttcgacaga cctctgtggg aagaaagaac 1020

atccccatca tgtatcttgg agccctgtca atctctgtgt cttgttttat tttcttcatc 1080

ttcctcggta caagcaccga aatctcgaga gacctcacag ctaggctcgg tgcattttgt 1140

ccagtctcta agtgggcctc aaagatttca ggacgtcaag ggtgagtcga cttacaatat 1200

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<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atcggcatcc tcgctcatta tg 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

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<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

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<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gacaaagcag cagtgaactg cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cacaattccc atcacggtgc tc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gagcgagagc actgatggaa ag 22

Claims

1.一种菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1，保藏号为：CGMCC No.11843。

2.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UET1在茭白人工孕茭中的应用。