CN108293599A - 一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法，通过野生花脸香蘑子实体的组织分离获得N006#菌株，所述的花脸香蘑N006#菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；保藏日：2016年06月01日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.12507，本发明通过组织分离得到野生花脸香蘑N006#菌株，掌握了该菌种的扩繁方法，为花脸香蘑人工栽培提供了菌种保障；并通过人工覆土栽培获得了花脸香蘑子实体，保护了该物种的种质资源，开发了食用菌新品种。

Description

一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法
技术领域
本发明属食用菌研究技术领域，具体涉及一种花脸香蘑及其菌种分离鉴定、原种扩繁、栽培种扩繁及覆土栽培方法。
背景技术
花脸香蘑Lepista sordida (Schumach.) Singer主要分布在云南在滇西、滇西北和滇中地区，通常发生于7、8月份，口味香浓、色泽鲜艳呈紫色，是一种富含营养成分且具有多种药理作用的珍稀优质野生食用菌，有着很好的经济效益。近年来针对花脸香蘑的研究主要集中于生物学特性、菌种分离鉴定、菌种培养、营养成分及其功能评价等方面，因其栽培菌株少、生物学转化率较低、栽培技术不成熟等因素，严重影响该菌的商业化。而且在花脸香蘑的栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节，因此发明一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法是非常必要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种花脸香蘑，第一目的在于提供一种花脸香蘑，第二目的在于提供花脸香蘑N006#菌株母种、原种、栽培种的扩繁方法，第三目的在于提供花脸香蘑N006#菌株覆土栽培方法。
本发明的第一目的是这样实现的，花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.)Singer）N006#，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；其保藏日为2016年06月01日，保藏编号为CGMCC NO.12507；分类命名为花脸香蘑Lepista sordida；所述花脸香蘑N006#菌株属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、口蘑科、香蘑属。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
1）菌种分离、培养及鉴定：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于20~25℃下培养7~10d，获得试管菌种，于4~6℃冰箱中保存备用；
采用供试子实体与对应菌丝分离物N006#，分别按CTAB方法提取花脸香蘑基因组DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，将所测得试验样品的ITS序列提交NCBI数据库进行BLAST序列比对分析，与NCBI中的花脸香蘑（L.sordida ）菌丝体Identities=661/661(100%)，Gaps=0/661(0%)，分析确定实施例1分离得到的纯培养物为本发明所述的花脸香蘑（L.sordida ）菌丝体；
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基中，培养条件为20~25℃恒温避光，单次培养时间为7~10d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取2~3块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的原种瓶中继续扩大培养，培养条件为20~25℃恒温避光，单次培养时间为30~35d；
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取2~3块蚕豆大小的菌块，接种于装有栽培种培养料的塑料袋中，20~25℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。
本发明的第三目的是这样实现的，包括以下步骤：
1）选择地块：选择季风常绿阔叶林下作为覆土栽培地块，所述的地块海拔2100~2200m，气温16~28℃，空气湿度65%~90%，散射光充足，在地块中加入土壤总重的1%的石灰粉对土壤进行消毒处理，并选择林下的表层土壤为覆土材料，所述的表层土壤为离地表5~10cm深的土壤；
2）准备菌种：在4~5月份，将经过扩繁培养的菌种取出，碎成蚕豆大小的菌块；
3）栽培：将菌种均匀撒播埋于步骤（1）选择的地块土壤中，每平方米播撒10~15袋规格为17cm×33cm×0.05cm的栽培种，然后再覆盖一层2.5~3cm厚的覆土材料，接着不再进行人工干预，当雨水季节到来，即可采集生长出的花脸香蘑子实体。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明通过组织分离得到野生花脸香蘑N006#菌株，掌握了该菌种的扩繁方法，为花脸香蘑人工栽培提供了菌种保障；并通过人工覆土栽培获得了花脸香蘑子实体，保护了该物种的种质资源，开发了食用菌新品种。
2、本发明选择通气性好，腐殖质高的表层腐殖土为覆土材料，透气性好，有利于菌丝快速生长到土表、倒伏并扭结成原基，腐殖质高为原基继续生长发育为成熟子实体提供丰富的养料。
3、本发明先后通过改良PDA进行母种扩繁、用麦粒种制备原种，最终扩繁得到栽培种，这样从母种到栽培种一步步扩繁的方法，使菌丝积累了大量养分，明显提高了菌种的活力，有利于提高栽培种萌发率，以及缩短栽培种的发菌时间。此外，本发明栽培种制备所用的主料为稻草、锯末、棉籽壳，发菌后期不容易腐败变质，菌种耐贮性好，且污染率低。
4、本发明得到的菌种通过合适的覆土栽培方法即可实现后期不再进行人工干预直至采收，不仅大大提高了花脸香蘑人工栽培的成功率，而且有效节省人力，林下栽培的方式也进一步实现绿色生态栽培，提高花脸香蘑的质量。
附图说明
图1为室内人工覆土栽培子实体生长前期；
图2为室内人工覆土栽培子实体生长后期；
图3为野生环境人工覆土栽培子实体。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏日为2016年06月01日，保藏编号为CGMCC NO.12507。
本发明所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，包括以下步骤：
1）菌种分离、培养：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于20~25℃下培养7~10d，获得试管菌种，于4~6℃冰箱中保存备用；
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基中，培养条件为20~25℃恒温避光，单次培养时间为7~10d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取2~3块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的原种瓶中继续扩大培养，培养条件为20~25℃恒温避光，单次培养时间为30~35d；
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取2~3块蚕豆大小的菌块，接种于装有栽培种培养料的塑料袋中，20~25℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。
所述的改良PDA培养基的配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
步骤（3）中所述的麦粒种培养料包括以下重量份的原料：大麦粒85~95份，阔叶树锯末5~15份；所述的麦粒种培养料的含水量控制在60~65%，121℃高压灭菌1.5~2.0h。
步骤（4）中所述的栽培种培养料包括以下重量份的原料：主料80~82份，麦麸15~17份，糖1.5~2.5份，石膏0.5~1.5份；所述的主料为稻草、锯末、棉籽壳中的一种或两种。
步骤（4）中所述的栽培种培养料的制备方法为取配方比例的原料混合均匀，121℃高压灭菌1.5~2.0h，含水量控制在60~70%。
步骤（4）中所述的塑料袋为聚丙烯塑料袋，规格为17cm×33cm×0.05cm，所述的栽培种培养料的装入量为0.85~0.90kg/袋。
本发明所述的花脸香蘑的覆土栽培方法，包括以下步骤：
1）选择地块：选择季风常绿阔叶林下作为覆土栽培地块，所述的地块海拔2100~2200m，气温16~28℃，空气湿度65%~90%，散射光充足，在地块中加入土壤总重的1%的石灰粉对土壤进行消毒处理，并选择林下的表层土壤为覆土材料，所述的表层土壤为离地表5~10cm深的土壤；
2）准备菌种：在4~5月份，将经过扩繁培养的菌种取出，碎成蚕豆大小的菌块；
3）栽培：将菌种均匀撒播埋于步骤（1）选择的地块土壤中，每平方米播撒10~15袋规格为17cm×33cm×0.05cm的栽培种，然后再覆盖一层2.5~3cm厚的覆土材料，接着不再进行人工干预，当雨水季节到来，即可采集生长出的花脸香蘑子实体。
所述的阔叶林为以短刺栲、越橘、毛杨梅中的一种或多种为主导树种的阔叶林。
本发明所述的覆土栽培方法为将经过扩繁培养的菌种从袋中取出，弄碎成蚕豆大小的菌块放到塑料花盆或是泡沫箱中，然后在表面覆盖一层2.5cm厚的覆土材料，所述的覆土材料为通气性良好的腐殖土，且预先加入土壤总重的1%的石灰粉进行消毒处理，接着喷一次重水，之后每天在土表喷水保湿，保持土壤含水量在20%~30%之间；待菌丝爬出土面后保持通风，同时保证环境的湿度在85~90%之间，温度控制在18~25℃之间，待原基形成后，保持环境湿度为90%，并加大通风，至子实体发育成熟，即可。
所述的覆土材料的土壤母岩为石灰岩，土壤类型为砂壤，土壤pH6~7。
下述各实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；以下实施例野生花脸香蘑在云南省临沧市永德县亚练乡采集；采集方法为徒手采集，采集时注意保持子实体完整、无霉变、无病虫害。
实施例1
一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法，包括以下步骤：
（1）菌种分离、培养、鉴定及保藏
将徒手采集的一个野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于25℃下培养7d，获得试管菌种，于4℃冰箱中保存备用。所述的试管琼脂培养基的配方为改良PDA培养基，配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
——花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#的鉴定
一、花脸香蘑N006#菌株的子实体形态 菌盖直径3.0~7.5cm，扁半球形至平展，有时中部稍下凹，湿润时半透明状或水浸状，紫色，边缘内卷，具不明显的条纹，常呈波状或瓣状。菌肉淡紫色，薄。菌褶淡蓝紫色，稍稀，直生、弯生或稍延生，不等长。菌柄长3.0~6.5cm，粗0.2~1.0cm，同菌盖色，靠近基部常弯曲，内实。孢子印粉红色。孢子无色，椭圆形至近卵圆形，较粗糙，有麻点，6.0~10μm×3.0~5.0μm。
二、ITS序列分析
采用供试子实体与对应菌丝分离物N006#，分别按CTAB方法提取花脸香蘑基因组DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，将所测得试验样品的ITS序列提交NCBI数据库进行BLAST序列比对分析，与NCBI中的花脸香蘑（L.sordida ）菌丝体Identities=661/661(100%)，Gaps=0/661(0%)，分析确定实施例1分离得到的纯培养物为本发明所述的花脸香蘑（L.sordida ）菌丝体。
改良CTAB法的流程
ⅰ称取0.12g左右的干燥样品，加入液氮并迅速研磨至粉状后，迅速加入-CTAB500µl、β-巯基乙醇20µl，再加+CTAB（65℃预热）700µl，混匀后置65℃水浴振荡抽提60min；
ⅱ冷却，12000r离心10min，取上清液，加入700μl等体积的苯酚/氯仿（1:1），混匀后12000r离心10min；
ⅲ取上清，加入700μl氯仿/异戊醇，混匀，12000r离心10min；
ⅳ取上清，先加入80µl 10%CTAB+4%NaCl溶液（65℃预热），再加入700μl氯仿/异戊醇，混匀，12000r离心10min；
ⅴ取上清，加入600μl异丙醇，-18℃下放置过夜；
ⅵ取出，12000r离心10min，弃上清液，沉淀依次用600μl 76%乙醇、0.2mol/L乙酸钠及300μl 70%乙醇进行洗涤；
ⅶ8000r离心5min，用滤纸滤干离心管，45℃下真空干燥5min，加入100μl TE缓冲液溶解，4℃冰箱保存。
纯度及浓度检测
取2μl DNA样品，用TE缓冲液定容至50μl，用紫外分光光度计测定波长在230nm、260nm、280nm处的OD值，根据260nm处的OD值计算DNA浓度，根据260/280、260/230值确定DNA的纯度。
分子量检测
取DNA样品5μl，上样缓冲液（含0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）2μl，混匀，点入含0.75μl核酸染料的0.8%琼脂糖凝胶中，同时点入λ-Lambda mix marker作为标记，用1×TAE缓冲液，在80V电压下电泳80min，最后在凝胶成像仪下观察并照相。
扩增
ITS序列扩增引物
采用White设计的ITS通用引物ITS4/ITS5对供试材料的rDNA ITS序列进行PCR扩增。其ITS引物如下：
ITS4: 5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’
ITS5: 5’—GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3’
ITS-PCR扩增体系
ITS-PCR扩增体系为50μL，含rTaq(5U/μL)0.5μL，10×PCR Buffer 6.25μL，Mgcl2(25mmol/L)5.0μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)0.75μL，ITS4/ITS5引物(10μmol/L)各2.5μL，模板DNA(50ng/μL)2.5μL，ddH2O补足至总体积50μL。
PCR扩增在GE9700 PCR仪上进行。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；52℃退火45s；72℃延伸1min；共40个循环；最后于72℃补平10min，终止温度为4℃。采用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测ITS-PCR扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录电泳谱带。
扩增产物的序列测定
PCR扩增产物经电泳检测后，用胶回收试剂盒进行回收和纯化，样品送测序公司测序。
序列分析
将扩增得到的各试验样品的ITS序列用DNAMAN进行拼接，将拼接好的序列保存为FASTA格式，然后提交NCBI数据库进行BLAST比对分析。用MEGA5.1软件包进行系统发育树的构建，用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter（K2P）模型，采用N-J法对上述序列进行分析并构建系统发育树，自举检测1000次。
本发明所述的N006#菌株其rDNA ITS序列见序列表。
本发明申请将N006#菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年06月01日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.12507；所述花脸香蘑N006#菌株属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、口蘑科、香蘑属。
（2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁
从试管菌种中挑取少量菌丝转移至新的改良PDA培养基（配方同上）中，培养条件为25℃恒温避光，单次培养时间为7d。
（3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备
原种配方采用麦粒种，配方为：90%大麦粒，10%阔叶树锯末，培养料含水量均控制在65%左右，121℃高压灭菌1h，从扩繁母种中挑取3块蚕豆大小的菌块接种至装有原种培养料的750mL原种瓶中继续扩大培养，培养条件为25℃恒温避光，单次培养时间为30d。
（4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备
栽培种采用稻草做主料，配方为：稻草81%，麦麸16%，糖2%，石膏1%，培养料含水量均控制在65%左右。用不锈钢长柄小汤勺均匀地取原种3勺，接种于装有重量为0.85kg栽培料的聚丙烯塑料袋（17cm×33cm×0.05cm）中，25℃下培养，55d菌丝满袋。
（5）花脸香蘑N006#菌株的覆土出菇试验
栽培种发菌完成后，进行室内脱袋覆土栽培，具体步骤为：将栽培袋中的菌种取出，弄碎成蚕豆大小的菌块放到塑料花盆或是泡沫箱中，每盆（箱）3袋栽培种，然后在表面覆盖一层2.5cm厚的通气性好且富含腐殖质的土壤（需预先加入土壤总重的1%的石灰粉进行消毒处理），喷一次重水，之后每天在土表喷水保湿，保持土壤含水量在20%~30%之间。待菌丝爬出土面后应加强通风，同时保证环境的湿度在85~90%之间，温度控制在18~25℃之间，待原基形成后，可以保持环境湿度为90%，并加大通风量，促使子实体发育成熟。
实施例2
一种花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#的分离扩繁方法及覆土栽培方法，包括以下步骤：
1）菌种分离、培养：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于25℃下培养10d，获得试管菌种，于6℃冰箱中保存备用；所述的改良PDA培养基的配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基（配方如上）中，培养条件为25℃恒温避光，单次培养时间为7d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取2块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的750mL原种瓶中继续扩大培养，培养条件为20℃恒温避光，单次培养时间为30d；所述的麦粒种培养料包括以下重量份的原料：大麦粒85份，阔叶树锯末5份；所述的麦粒种培养料的含水量控制在60%，121℃高压灭菌1.5h。
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取2块蚕豆大小的菌块，接种于装有0.85kg栽培种培养料的聚丙烯塑料袋（17cm×33cm×0.05cm）中，20℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。所述的栽培种培养料包括以下重量份的原料：锯末42%，棉籽壳39%，麦麸16%，糖2%，石膏1%。
5）花脸香蘑N006#菌株的覆土出菇试验：栽培种发菌完成后，将其运到原生长野生花脸香蘑N006#菌株的林区回归自然生长，具体步骤为：在4~5月份，将栽培袋中的菌种取出，弄碎成蚕豆大小的菌块，然后均匀撒播埋于离地面5cm的腐殖质土壤中，每平方米播撒10袋栽培种，让花脸香蘑菌种回归自然环境，不进行人工干预，当雨水季节到来，即7~8月份，可采集生长出的花脸香蘑子实体。
实施例3
一种花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#的分离扩繁方法及覆土栽培方法，包括以下步骤：
1）菌种分离、培养：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于21℃下培养8d，获得试管菌种，于5℃冰箱中保存备用；所述的改良PDA培养基的配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基（配方如上）中，培养条件为21℃恒温避光，单次培养时间为9d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取2块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的原种瓶中继续扩大培养，培养条件为21℃恒温避光，单次培养时间为35d；所述的麦粒种培养料包括以下重量份的原料：大麦粒95份，阔叶树锯末15份；所述的麦粒种培养料的含水量控制在65%，121℃高压灭菌2.0h。
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取3块蚕豆大小的菌块，接种于装有栽培种培养料的塑料袋中， 25℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。所述的栽培种培养料包括以下重量份的原料：主料80份，麦麸15份，糖1.5份，石膏0.5份；所述的主料为稻草40份、棉籽壳40份。所述的栽培种培养料的制备方法为取配方比例的原料混合均匀，121℃高压灭菌1.5h，含水量控制在70%。所述的塑料袋为聚丙烯塑料袋，规格为17cm×33cm×0.05cm，所述的栽培种培养料的装入量为0.86kg/袋。
5）花脸香蘑N006#菌株的覆土栽培方法，包括以下步骤：
A选择地块：选择季风常绿阔叶林下作为覆土栽培地块，所述的地块海拔2100m，气温16~22℃，空气湿度65%~75%，散射光充足，在地块中加入土壤总重的1%的石灰粉对土壤进行消毒处理，并选择林下的表层土壤为覆土材料，所述的表层土壤为离地表5cm深的土壤；所述的阔叶林为以短刺栲为主导树种的阔叶林；
B准备菌种：在4月份，将经过扩繁培养的菌种取出，碎成蚕豆大小的菌块；
C栽培：将菌种均匀撒播埋于步骤（1）选择的地块土壤中，每平方米播撒15袋规格为17cm×33cm×0.05cm的栽培种，然后再覆盖一层3cm厚的覆土材料，接着不再进行人工干预，当雨水季节到来，即可采集生长出的花脸香蘑子实体。
所述的覆土材料的土壤母岩为石灰岩，土壤类型为砂壤，土壤pH6。
实施例4
一种花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#的分离扩繁方法及覆土栽培方法，包括以下步骤：
1）菌种分离、培养：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于22℃下培养9d，获得试管菌种，于6℃冰箱中保存备用；所述的改良PDA培养基的配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基（配方如上）中，培养条件为22℃恒温避光，单次培养时间为9d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取3块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的750mL原种瓶中继续扩大培养，培养条件为22℃恒温避光，单次培养时间为32d；所述的麦粒种培养料包括以下重量份的原料：大麦粒85份，阔叶树锯末15份；所述的麦粒种培养料的含水量控制在64%，121℃高压灭菌1.5h。
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取3块蚕豆大小的菌块，接种于装有栽培种培养料的塑料袋中，22℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。所述的栽培种培养料包括以下重量份的原料：主料81份，麦麸17份，糖2.5份，石膏1.5份；所述的主料为锯末。所述的栽培种培养料的制备方法为取配方比例的原料混合均匀，121℃高压灭菌1.8h，含水量控制在68%。所述的塑料袋为聚丙烯塑料袋，规格为17cm×33cm×0.05cm，所述的栽培种培养料的装入量为0.87kg/袋。
5）花脸香蘑N006#菌株的覆土栽培方法，包括以下步骤：
A选择地块：选择季风常绿阔叶林下作为覆土栽培地块，所述的地块海拔2200m，气温18~28℃，空气湿度85%~90%，散射光充足，在地块中加入土壤总重的1%的石灰粉对土壤进行消毒处理，并选择林下的表层土壤为覆土材料，所述的表层土壤为离地表10cm深的土壤；所述的阔叶林为以越橘、毛杨梅为主导树种的阔叶林；
B准备菌种：在5月份，将经过扩繁培养的菌种取出，碎成蚕豆大小的菌块；
C栽培：将菌种均匀撒播埋于步骤（1）选择的地块土壤中，每平方米播撒12袋规格为17cm×33cm×0.05cm的栽培种，然后再覆盖一层2.8cm厚的覆土材料，接着不再进行人工干预，当雨水季节到来，即可采集生长出的花脸香蘑子实体。
所述的覆土材料的土壤母岩为石灰岩，土壤类型为砂壤，土壤pH7。
实施例5
一种花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#的分离扩繁方法及覆土栽培方法，包括以下步骤：
1）菌种分离、培养：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于23℃下培养8d，获得试管菌种，于6℃冰箱中保存备用；所述的改良PDA培养基的配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基（配方如上）中，培养条件为23℃恒温避光，单次培养时间为8d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取3块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的750mL原种瓶中继续扩大培养，培养条件为24℃恒温避光，单次培养时间为33d；所述的麦粒种培养料包括以下重量份的原料：大麦粒92份，阔叶树锯末8份；所述的麦粒种培养料的含水量控制在62%，121℃高压灭菌1.6h。
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取2块蚕豆大小的菌块，接种于装有栽培种培养料的塑料袋中，24℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。所述的栽培种培养料包括以下重量份的原料：主料82份，麦麸16份，糖2份，石膏1份；所述的主料为稻草39份、锯末43份。所述的栽培种培养料的制备方法为取配方比例的原料混合均匀，121℃高压灭菌1.6h，含水量控制在62%。所述的塑料袋为聚丙烯塑料袋，规格为17cm×33cm×0.05cm，所述的栽培种培养料的装入量为0.89kg/袋。
5）所述的覆土栽培方法为将经过扩繁培养的菌种从袋中取出，弄碎成蚕豆大小的菌块放到塑料花盆或是泡沫箱中，然后在表面覆盖一层2.5cm厚的覆土材料，所述的覆土材料为通气性良好的腐殖土，且预先加入土壤总重的1%的石灰粉进行消毒处理，接着喷一次重水，之后每天在土表喷水保湿，保持土壤含水量在22%~28%之间；待菌丝爬出土面后保持通风，同时保证环境的湿度在86~88%之间，温度控制在20~22℃之间，待原基形成后，保持环境湿度为90%，并加大通风，至子实体发育成熟，即可。所述的覆土材料的土壤母岩为石灰岩，土壤类型为砂壤，土壤pH6.5。
SEQUENCE LISTING
<110> 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所
<120> 一株花脸香蘑及其菌种的分离扩繁方法和覆土栽培方法
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 683
<212> DNA
<213> 花脸香蘑菌株rDNA序列
<400> 1
ccccggcctt tgatatgctt aagttcagcg ggtagtccta cctgatttga ggtcaaaaat 60
gtcataaatt tgtccaagtc aatggactgt tagaagctga accccatgtt aaagctgctt 120
cacaaccatg gcgtagataa ttatcacacc aaaagctggt ccacaaaggt tccgctaatg 180
catttaagag gagccgactt ctagagaagc ccgcaataac ctccacatcc aagccaatcc 240
aacttgcaaa agctgaaaag gttgagaatt taatgacact caaacaggca tgctcctcgg 300
aataccaagg agcgcaaggt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca 360
cattacttat cgcatttcgc tgcgttcttc atcgatgcga gagccaagag atccgttgtt 420
gaaagttgta ttaatttaaa ggcataaagc ccattaataa cattctatta cattcttatg 480
gggtataata aaaacataga cttgaaacac aaggaaagcc atgtttgcac acagcattcc 540
tcaaaccgag tttcctcgag agttgtttca aatctacaaa aggtgcacag gtggtaaaaa 600
tggcgctagg cgtgcacatg ctccaaaaag ccagcacaac ccaaccaagt ttattcaata 660
atgatccttc gtgtttccac acg 683

Claims (10)

1.一种花脸香蘑（Lepista sordida (Schumach.) Singer）N006#，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏日为2016年06月01日，保藏编号为CGMCCNO.12507。
2.一种根据权利要求1所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，其特征在于包括以下步骤：
1）菌种分离、培养：将野生花脸香蘑子实体作为驯化材料，采用组织分离法得到花脸香蘑N006#菌株，再将其菌丝体接种到改良PDA培养基斜面上，于20~25℃下培养7~10d，获得试管菌种，于4~6℃冰箱中保存备用；
2）花脸香蘑N006#菌株的母种扩繁：从试管菌种中挑取菌丝转移至改良PDA培养基中，培养条件为20~25℃恒温避光，单次培养时间为7~10d；
3）花脸香蘑N006#菌株的原种制备：原种配方采用麦粒种，从扩繁母种中挑取2~3块蚕豆大小的菌块接种至装有麦粒种培养料的原种瓶中继续扩大培养，培养条件为20~25℃恒温避光，单次培养时间为30~35d；
4）花脸香蘑N006#菌株的栽培种制备：用长柄小勺从扩繁原种中均匀地取2~3块蚕豆大小的菌块，接种于装有栽培种培养料的塑料袋中，20~25℃下培养至菌丝满袋，即完成扩繁。
3.根据权利要求2所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，其特征在于所述的改良PDA培养基的配方为：土豆200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L。
4.根据权利要求2所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，其特征在于步骤（3）中所述的麦粒种培养料包括以下重量份的原料：大麦粒85~95份，阔叶树锯末5~15份；所述的麦粒种培养料的含水量控制在60~65%，121℃高压灭菌1.5~2.0h。
5.根据权利要求2所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，其特征在于步骤（4）中所述的栽培种培养料包括以下重量份的原料：主料80~82份，麦麸15~17份，糖1.5~2.5份，石膏0.5~1.5份；所述的主料为稻草、锯末、棉籽壳中的一种或两种。
6.根据权利要求2所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，其特征在于步骤（4）中所述的栽培种培养料的制备方法为取配方比例的原料混合均匀，121℃高压灭菌1.5~2.0h，含水量控制在60~70%。
7.根据权利要求2所述的花脸香蘑的分离扩繁方法，其特征在于步骤（4）中所述的塑料袋为聚丙烯塑料袋，规格为17cm×33cm×0.05cm，所述的栽培种培养料的装入量为0.85~0.90kg/袋。
8.一种根据权利要求1所述的花脸香蘑的覆土栽培方法，其特征在于包括以下步骤：
1）选择地块：选择季风常绿阔叶林下作为覆土栽培地块，所述的地块海拔2100~2200m，气温16~28℃，空气湿度65%~90%，散射光充足，在地块中加入土壤总重的1%的石灰粉对土壤进行消毒处理，并选择林下的表层土壤为覆土材料，所述的表层土壤为离地表5~10cm深的土壤；所述的阔叶林为以短刺栲、越橘、毛杨梅中的一种或多种为主导树种的阔叶林；
2）准备菌种：在4~5月份，将经过扩繁培养的菌种从袋中取出，碎成蚕豆大小的菌块；
3）栽培：将菌种均匀撒播埋于步骤（1）选择的地块土壤中，每平方米播撒10~15袋规格为17cm×33cm×0.05cm的栽培种，然后再覆盖一层2.5~3cm厚的覆土材料，接着不再进行人工干预，当雨水季节到来，即可采集生长出的花脸香蘑子实体。
9.一种根据权利要求1所述的花脸香蘑的覆土栽培方法，其特征在于所述的覆土栽培方法为将经过扩繁培养的菌种从袋中取出，弄碎成蚕豆大小的菌块放到塑料花盆或是泡沫箱中，然后在表面覆盖一层2.5cm厚的覆土材料，所述的覆土材料为腐殖土，且预先加入土壤总重的1%的石灰粉进行消毒处理，接着喷一次重水，之后每天在土表喷水保湿，保持土壤含水量在20%~30%之间；待菌丝爬出土面后保持通风，同时保证环境的湿度在85~90%之间，温度控制在18~25℃之间，待原基形成后，保持环境湿度为90%，并加大通风，至子实体发育成熟，即可。
10.根据权利要求8所述的花脸香蘑菌种的覆土栽培方法，其特征在于所述的覆土材料的土壤母岩为石灰岩，土壤类型为砂壤，土壤pH6~7。
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