CN111742778B - 一株花脸香蘑菌株及其液体菌种栽培子实体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株花脸香蘑菌株及其液体菌种栽培子实体的方法。本发明提供了花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618,其保藏编号为CGMCC No.16980。实验证明,采用花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618液体种可以栽培得到富含核苷类化合物和/或麦角甾醇的子实体,还可以实现大规模工厂化栽培。因此,花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618在食品加工、药品加工或保健品加工中具有重要的应用价值。本发明具有重要的应用价值。

Description

一株花脸香蘑菌株及其液体菌种栽培子实体的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株花脸香蘑菌株及其液体菌种栽培子实体的方法。
背景技术
花脸香蘑因菌盖边缘具水浸状花纹,故称花脸香蘑,又称丁香蘑、花脸蘑、紫花脸香蘑等,属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、口蘑科、香蘑属,是我国重要的食用真菌。花脸香蘑的蛋白质含量丰富,氨基酸种类齐全,还富含钙、铁、锌等人体必需的微量元素和维生素,具有养血、益神、补肝和补五脏之功效。
花脸香蘑香味浓郁、口感清脆、色泽怡人,营养价值和经济价值极高,是一种珍稀优质的野生食用菌。但目前人工栽培花脸香蘑还处于初级阶段,多采用固体菌种,产量低且周期长,远远满足不了市场需求。专利“花脸香蘑一级菌种固体培养基及菌种快速栽培方法(CN201310747585.9)”公开了一种花脸香蘑一级菌种的固体培养基,但未获得子实体;专利“一种采用荻草栽培花脸香蘑的方法及其培养基(CN201610112434.X)”提供了一种基于荻草的花脸香蘑栽培培养基以及使用荻草栽培花脸香蘑的具体方法;专利“一种花脸香蘑及其分离扩繁方法和覆土栽培方法(201810168806.X)”公开了一种花脸香蘑菌株及其覆土栽培方法,栽培种为袋装固体种,且栽培容器为泡沫箱,未实现规模化出菇。周会明从采自云南野生花脸香蘑子实体上分离纯化获得菌株并进行栽培,同样采用固体种袋栽(周会明等,一株野生花脸香蘑的生物学特性及其栽培食用菌学报2017,24(1):39-44)。胡先运等对花脸香蘑菌丝体进行液体发酵研究,但并未栽培获得子实体(胡先运;江家志,花脸香蘑菌丝体液体发酵研究,食品研究与开发2016,37(15):44-47)。
此外,花脸香蘑虽然已成功出菇,但出菇品相不均一、出菇时间漫长,产量低周期长;且栽培种都为固体种,导致种植规模小,远远满足不了市场需求至今未见规模化栽培。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以生产核苷类化合物和/或麦角甾醇的菌株。
本发明提供的菌株,具体可为花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618,该菌株已于2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号为CGMCC No.16980。花脸香蘑(Lepistasordida)DCH618CGMCC No.16980简称为花脸香蘑DCH618。
所述花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618CGMCC No.16980在生产核苷类化合物和/或麦角甾醇中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种菌剂,其可含有所述花脸香蘑DCH618。
所述菌剂可为液体菌剂。
所述菌剂的用途可为a1)和/或a2):a1)生产核苷类化合物;a2)生产麦角甾醇。
上述任一所述核苷类化合物可为胞嘧啶核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、肌苷、鸟苷和腺苷中的至少一种。
上述任一所述菌剂的制备方法也属于本发明的保护范围。
栽培所述花脸香蘑DCH618得到的子实体也属于本发明的保护范围。所述栽培可为液体菌种栽培。
培养所述花脸香蘑DCH618得到的菌丝体也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述子实体的栽培方法,可包括如下步骤:将所述花脸香蘑DCH618的菌丝体依次进行一级液体种制备、二级液体种制备、接种及发菌、覆土、出菇管理和出菇,得到子实体。
上述方法中,所述一级液体种制备的方法可包括如下步骤:将所述花脸香蘑DCH618的菌丝体接种至一级液体种培养基中,15-25℃(如15-20℃、20-25℃、15℃、20℃或25℃)、100-200rpm(如100-150rpm、150-200rpm、100rpm、150rpm或200rpm)避光培养至菌丝长满培养基,得到一级液体种。
上述方法中,所述二级液体种制备的方法可包括如下步骤:将所述一级液体种接种至二级液体培养基,15-25℃(如15-20℃、20-25℃、15℃、20℃或25℃)、100-200rpm(如100-150rpm、150-200rpm、100rpm、150rpm或200rpm)避光培养至菌丝长满培养基,得到二级液体种。
上述方法中,所述接种及发菌的方法可包括如下步骤:将所述二级液体种接入栽培料中并覆膜,在空气相对湿度为65-75%(如65-70%、70-75%、65%、70%或75%)条件下,15-28℃(如15-23℃、23-28℃、15℃、23℃或28℃)避光培养至菌丝长满栽培料。
所述接种及发菌的栽培方式具体可为层架栽培。
所述层架栽培具体可为:层架规格为3-5层,层高0.6m,每个层架长1.8m、宽1.2m,铺料面积约为2m2,底层距离地面0.3m(依据需要而定);栽培料平铺于每层床架进行栽培出菇。
上述方法中,所述覆土的方法可包括如下步骤:在所述接种及发菌步骤中,待菌丝长满料面后将膜取下,在所述栽培料的料面上覆土(覆土厚度可为3-4cm),在空气相对湿度为70-75%(如70-73%、73-75%、70%、73%或75%)、CO2的相对浓度在0.1-0.5%(如0.1-0.3%、0.3-0.5%、0.1%、0.3%或0.5%)的条件下,15-28℃(如15-23℃、23-28℃、15℃、23℃或28℃)避光培养至菌丝生长到土层表面。
所述覆土的土壤可为透气性好、持水力强的土壤。所述土壤具体可为草炭土。
上述方法中,所述出菇管理的方法可包括如下步骤:待所述覆土步骤得到的菌丝生长到土层表面时,补一层细土,维持温度为15-23℃(如15-20℃、20-23℃、15℃、20℃或23℃)、光照强度为500-800Lux(如500-600Lux、600-800Lux、500Lux、600Lux或800Lux)、空气相对湿度为85-95%(如85-90%、90-95%、85%、90%或95%)、空气中CO2相对浓度0.05-0.15%(如0.05-0.10%、0.10-0.15%、0.05%、0.10%或0.15%),培养5-10d(如5-8d、8-10d、5d、8d或10d)得到蘑菇原基;
上述方法中,所述出菇的方法可包括如下步骤:将所述出菇管理步骤得到的蘑菇原基转移至环境温度为18-20℃(如18℃、19℃或20℃)、空气相对湿度为75-90%(如75-80%、80-90%、75%、80%或90%)、CO2相对浓度为0.05-0.15%(如0.05-0.10%、0.10-0.15%、0.05%、0.10%或0.15%)的条件下培养,得到子实体。
所述一级液体种培养基可为麦麸培养基、加富PDB培养基或黄豆粉培养基。
所述麦麸培养基的制备方法可为:(1)用水煮法提取马铃薯200g和小麦麸皮20-80g(如20-50g、50-80g、20g、50g或80g),然后过滤,收集滤液;(2)向滤液中加入葡萄糖15-30g(如15-20g、20-30g、15g、20g或30g)、大豆蛋白冻1-5g(如1-3g、3-5g、1g、3g或5g)、酵母提取物0-3g(如0-1g、1-3g、1g、2g或3g),然后用水定容至1L,灭菌。
所述加富PDB培养基的制备方法可为:(1)用水煮法提取马铃薯200g,然后过滤,收集滤液;(2)向滤液中加入20g葡萄糖、2-3g(如2.5g、2g或3g)蛋白胨、0.5-1g(如0.5-0.75g、0.75-1g、0.5g、0.75g或1g)磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁,然后用水定容至1L,灭菌;
所述黄豆粉培养基的制备方法可为:将黄豆粉20-60g(如20-40g、40-60g、20g、40g或60g)、蛋白胨1-5g(如1-3g、3-5g、1g、3g或5g)、葡萄糖15-30g(如15-20g、20-30g、15g、20g或30g)和水混合,然后用水定容至1L,灭菌。
所述二级液体种培养基可为发酵培养基。
所述发酵培养基的制备方法可为:将大豆粉0.5-1kg(如0.5-0.8kg、0.8-1kg、0.5kg、0.8kg或1kg)、白糖2-4kg(如2-3kg、3-4kg、2kg、3kg或4kg)、玉米面50-100g(如50-75g、75-100g、50g、75g或100g)、淀粉10-30g(如10-20g、20-30g、10g、20g或30g)、磷酸二氢钾213g、硫酸镁107g、消泡剂30-40g(如30-35g、35-40g、30g、35g或40g)和水300L混合,灭菌。
上述任一所述灭菌可为121℃高压灭菌15min。
所述一级液体种制备的方法中,所述15-25℃、100-200rpm避光培养具体可为25℃、100-200rpm避光培养。
上述任一所述栽培料可为粪草发酵料。所述粪草发酵料具体可由农作物秸秆、牛粪、豆粕和石膏发酵而成。
具体的,将栽培原料进行二次发酵,获得栽培料;步骤依次如下:
(1)制备栽培原料
栽培原料由农作物秸秆(稻草、麦草)、动物粪便(如干牛粪和/或鸡粪)、豆箔和石膏粉混合而成。栽培原料中,农作物秸秆、动物粪便、豆箔和石膏粉的质量比为55:45:1.2:4。
(2)前发酵
将农作物秸秆和动物粪便预湿,水分含量为65-70%(v/v),南北走向堆制发酵,监测堆体温度,当堆体内部温度达到70℃以上后开始下降时进行一次翻堆。
经过3-4次翻堆后,完成前发酵。
(3)后发酵
完成步骤(2)后,先将堆体内部温度升至58-62℃并保持12-24h,然后通风将堆体温度降至50-52℃保持4-6d,再将堆体温度降至常温(25-28℃),完成后发酵。完成步骤(3)的栽培原料无氨味,无粪臭味,可以看到料面明显的白色放线菌层。
(4)获得栽培料
取完成步骤(3)的栽培原料,先加入水,使含水量达到65%(m/m);然后调节pH值至7.0-7.5,即获得栽培料。
上述任一所述子实体在食品加工、药品加工或保健品加工中的应用也属于本发明的保护范围。
所述花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618CGMCC No.16980在降解农作物秸秆和/或动物粪便中的应用也属于本发明的保护范围。
花脸香蘑DCH618是采自中国北京市房山大石窝镇的标本分离得到的菌株。采用花脸香蘑DCH618液体种可以栽培得到富含核苷类化合物和/或麦角甾醇的子实体,还可以实现大规模工厂化栽培。同时花脸香蘑DCH618为典型的草腐菌,可以利用农作物秸秆,具有生态意义。因此,花脸香蘑DCH618在食品加工、药品加工或保健品加工中具有重要的应用价值。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为野外采集的野生真菌子实体的侧视图和俯视图。
图2为真菌DCH618CGMCC No.16980的试管菌种(母种)。
图3为真菌DCH618CGMCC No.16980在PDA固体培养基上培养15d天后菌丝的生长状况。
图4为花脸香蘑DCH618CGMCC No.16980接种20d后发满菌的状况。
图5为花脸香蘑DCH618CGMCC No.16980子实体原基分化状况。
图6为花脸香蘑DCH618CGMCC No.16980的子实体出菇状况。
图7为花脸香蘑DCH618CGMCC No.16980在不同一级液体培养基中的生长状况。
图8为花脸香蘑DCH618CGMCC No.16980栽培得到的子实体高效液相色谱图。
保藏说明
菌种名称:花脸香蘑
拉丁名:Lepista sordida
菌株编号:DCH618
保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称:CGMCC
地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期:2018年12月10日
保藏中心登记入册编号:CGMCC No.16980
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
PDA培养基:向900mL自来水中加入马铃薯200g(已切成小块),煮沸20min,过滤,收集滤液;向滤液中加入琼脂20g,然后用自来水定容至1L,121℃高压灭菌15min。
加富PDB培养基:向900mL自来水中加入马铃薯200g(已切成小块),煮沸20min,过滤,收集滤液;向滤液中先加入20g葡萄糖并使之完全溶化,然后再加入2-3g蛋白胨、0.5-1g磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁,用自来水定容至1L,121℃高压灭菌15min。
麦麸培养基:向900mL自来水中加入马铃薯200g(已切成小块)和小麦麸皮20-80g,煮沸20min,过滤,向滤液中加入葡萄糖15-30g、大豆蛋白冻1-5g、酵母提取物0-3g,然后用自来水定容至1L,121℃高压灭菌15min。
黄豆粉培养基:向900mL自来水中加入黄豆粉20-60g、蛋白胨1-5g和葡萄糖15-30g,然后用自来水定容至1L,121℃高压灭菌15min。
下述实施例中的栽培料为粪草发酵料,由农作物秸秆、牛粪、豆粕和石膏发酵而成。具体的,将栽培原料进行二次发酵,获得栽培料;步骤依次如下:
(1)制备栽培原料
栽培原料由农作物秸秆(稻草、麦草)、动物粪便(如干牛粪和/或鸡粪)、豆箔和石膏粉混合而成。栽培原料中,农作物秸秆、动物粪便、豆箔和石膏粉的质量比为55:45:1.2:4。
(2)前发酵
将农作物秸秆和动物粪便预湿,水分含量为65-70%(v/v),南北走向堆制发酵,监测堆体温度,当堆体内部温度达到70℃以上后开始下降时进行一次翻堆。
经过3-4次翻堆后,完成前发酵。
(3)后发酵
完成步骤(2)后,先将堆体内部温度升至58-62℃并保持12-24h,然后通风将堆体温度降至50-52℃保持4-6d,再将堆体温度降至常温(25-28℃),完成后发酵。完成步骤(3)的栽培原料无氨味,无粪臭味,可以看到料面明显的白色放线菌层。
(4)获得栽培料
取完成步骤(3)的栽培原料,先加入水,使含水量达到65%(m/m);然后调节pH值至7.0-7.5,即获得栽培料。
实施例1、花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618CGMCC No.16980的分离、鉴定和保藏
一、真菌DCH618的分离
本发明的发明人从北京市房山区大石窝镇采集野生真菌子实体(见图1,A为侧视图,B为俯视图)。挑取其菌盖和菌柄交接处组织,然后置于PDA培养基上,25℃暗培养2周,得到菌丝。挑出菌丝纯化两次,获得真菌DCH618。每次纯化的步骤为:将菌丝置于PDA培养基上,25℃暗培养2周。
二、真菌DCH618的鉴定
1、形态学鉴定
(1)将真菌DCH618的菌丝接种于PDA培养基(斜面),25℃暗培养2周,观察菌丝的生长状态。
实验结果见图2。结果表明,菌丝在PDA培养基(斜面)上呈绒毛状,颜色为白色或淡紫色。
(2)将真菌DCH618的菌丝接种于PDA培养基,25℃暗培养15d,观察菌丝的生长状态。
实验结果见图3。结果表明,菌落直径为8-9cm,菌落正面呈淡紫色棉絮状,气生菌丝较厚,菌丝疏松。
2、分子生物学特征鉴定
rDNA-ITS序列作为条形码(Schoch,C.L.et al.Nuclear ribosomalinternaltranscribed spacer(ITS)region as a universal DNA barcode markerforfungi.Proceedings of the National Academy of Sciences,2012.109:6241-6246),广泛用于真菌物种鉴定。
(1)提取真菌DCH618的基因组DNA并以其作为模板,采用引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和引物ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物,测序。
结果表明,真菌DCH618的rDNA-ITS序列如序列表中的序列1所示。
将序列表中的序列1所示的核苷酸序列在NCBI数据库中进行BLAST在线比对。结果表明,真菌DCH618与花脸香蘑(Lepista sordida)的同源性最高,达到99%。
三、保藏
步骤一分离的真菌DCH618已于2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号为CGMCC No.16980。真菌DCH618的全称为花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618CGMCCNo.16980,简称为花脸香蘑DCH618。
实施例2、花脸香蘑DCH618的子实体栽培
一、栽培流程
花脸香蘑DCH618子实体的栽培流程具体如下:母种的制备→一级液体种的制备→二级液体种(即栽培液体种)的制备→接种、覆膜及发菌→覆土→出菇管理→出菇→采收。
1、母种的制备
将花脸香蘑DCH618的菌丝接种到PDA培养基(试管斜面)上,25℃避光培养至菌丝长满培养基,培养基上的菌丝体即为母种。
2、一级液体种的制备
完成步骤1后,将母种转接至一级液体培养基(接种量为每200mL一级液体培养基中接入8-10个母种菌种块(直径约为1.0cm)),25℃、150rpm避光培养7-10d,得到一级液体种。
一级液体培养基为麦麸培养基、加富PDB培养基或黄豆粉培养基。
3、二级液体种(栽培种)的制备
完成步骤2后,取装有300L二级液体培养基的发酵罐(规格为900L),接种1500mL一级液体种,20℃、150rpm避光培养15d,得到二级液体种。
二级液体培养基:将大豆粉0.5-1kg、白糖2-4kg、玉米面50-100g、淀粉10-30g、磷酸二氢钾213g、硫酸镁107g、消泡剂30-40g和自来水300L混合,121℃高压灭菌15min。
4、接种、覆膜及发菌
完成步骤3后,将二级液体种接入栽培料(接入比例为每m2栽培料接种1500mL二级液体种;接种方法为将二级液体种均匀地喷洒在栽培料的料面,覆上薄膜保湿),在空气相对湿度为65-75%条件下15-28℃避光培养20d。
避光培养后的结果见图4。
该步骤中的栽培方式具体可为层架栽培。层架栽培具体可为:层架规格为3-5层,层高0.6m,每个层架长1.8m、宽1.2m,铺料面积约为2m2,底层距离地面0.3m(依据需要而定);栽培料平铺于每层床架进行栽培出菇。
5、覆土
完成步骤4后,向栽培料的料面上覆土(厚度为3-4cm),然后在空气相对湿度为70-75%条件下15-28℃避光培养。培养期间,每天通风1次,使空气中CO2的相对浓度在0.1-0.5%(v/v)之间。
覆土的土壤要求透气性好、持水力强,一般为草炭土。
6、出菇管理
待菌丝生长到土层表面时,先补一层细土,然后在空气相对湿度为85-95%条件下(同时以光照强度为500-800Lux的弱光刺激)15-23℃培养5-10d,得到大量蘑菇原基(见图5)。培养期间,每天通风2-3次,使空气中CO2的相对浓度在0.05-0.15%(v/v)之间。
7、出菇
完成步骤6后,转移至空气相对湿度为75-90%、CO2相对浓度为0.05-0.15%(v/v)的条件下,18-20℃继续培养7-10d,得到子实体(见图6,A为层架上出菇,B为花盆栽培出菇)。
8、采收
待子实体长至八成熟(菌盖尚未完全展开),即可采收第一潮菇。采摘后清理残留菇根、补土菇穴,待菌丝恢复生长后,进行步骤6,采收下一潮菇。
需要指明的是,目前的食用菌产业以木腐菌为主,消耗大量的木材资源,造成菌林矛盾。而花脸香蘑DCH618的栽培料以农作物秸秆(稻草、麦草)和动物粪便(如干牛粪和/或鸡粪)为主。因此,花脸香蘑的栽培因为其降解农作物秸秆和动物粪便,可以缓解目前日益扩大的食用菌行业对木材资源的消耗,同时可以将动物粪变废为宝。
此外,目前的草腐菌栽培以固体菌种为主,液体菌种具有发菌快,出菇整齐的优点。
二、花脸香蘑DCH618栽培得到的子实体特征
按照步骤一的栽培流程,获得潮菇,即子实体。
经观察记录,花脸香蘑DCH618栽培得到的子实体的特征如下:菌盖直径3-6.5cm,扁半球形至平展,有时中部稍下凹,薄浅紫色,边缘内卷,常呈波状或瓣状;菌盖光滑,初时浅丁香色,后褪为污白至藕粉色;直生至弯生,有时稍延生,不等长;菌肉薄而脆,淡紫色;菌褶淡紫;菌柄长3-7.5cm,粗0.2-1cm,圆柱形,同菌盖色,靠近基部常弯曲,内实。具有浓郁的香气,但较野生花脸香蘑的子实体颜色偏浅。
三、条件优化
1、原种培养温度的优化
实验重复三次取平均值,每次重复的步骤如下:
(1)将花脸香蘑DCH618的菌丝接种于PDA培养基,25℃避光培养至菌丝长满培养基,然后通过打孔获得菌种块(直径约为1.0cm)。
(2)完成步骤(1)后,向新的PDA培养基中接种菌种块,然后15℃、20℃、22℃、25℃或30℃避光培养13d,测量菌落直径。
(3)完成步骤(2)后,根据菌落直径,计算菌丝生长速度。菌丝生长速度=菌落直径/13。
实验结果见表1。结果表明,花脸香蘑DCH618在25℃的条件下,菌丝生长速度最快。由此可见,花脸香蘑DCH618的原种培养温度最佳为25℃。
表1
温度(℃) 生长速率(mm/d)
15℃ 3.865±0.092c
20℃ 6.125±0.480b
25℃ 8.475±0.050a
30℃ 5.635±0.798b
35℃ 3.635±0.348c
注:同一栏内相同的字母表示多重检验没有显著性差异(P=0.05)。
2、原种培养基的优化
原种培养基为麦麸培养基、加富PDB培养基或黄豆粉培养基。
(1)将花脸香蘑DCH618的菌丝接种到PDA培养基(试管斜面)上,25℃避光培养至菌丝长满培养基,培养基上的菌丝体即为母种。
(2)完成步骤(1)后,将8个母种菌种块(直径约为1.0cm)转接至装有200mL一级液体培养基的锥形瓶(规格为500mL)中,25℃、150rpm避光培养8d。观察菌丝球的生长情况。
实验结果见图7(A为麦麸培养基,B为黄豆粉培养基,C为加富PDB培养基)。结果表明,花脸香蘑DCH618在麦麸培养基、加富PDB培养基和黄豆粉培养基中都可生长形成菌丝球。但与加富PDB培养基或黄豆粉培养基相比,花脸香蘑DCH618在麦麸培养基中的萌发时间较早、菌丝生长速度较快、菌丝粗壮、生长状况更好。由此可见,花脸香蘑DCH618的原种培养基最佳为麦麸培养基。
实施例3、花脸香蘑DCH618子实体的高效液相色谱分析
本实施例中,高效液相色谱分析的流动相由17体积份pH 6.5、10mM的磷酸盐缓冲液和3体积份甲醇组成,流速为1.0mL/min,柱温为室温。检测波长为260nm。
1、按照实施例2中步骤一的栽培流程,获得潮菇,即子实体。
2、完成步骤1后,取子实体,干燥,然后研磨,得到子实体粉末。
3、完成步骤2后,取具塞锥形瓶,加入子实体粉末0.5g和10mL 90%(v/v)甲醇水溶液,密塞,摇匀,加热回流30min。
4、完成步骤3后,自然冷却,过滤,收集滤液。
5、完成步骤4后,取试管,加入步骤4收集的滤液,然后用进行高效液相色谱分析的流动相定容至10mL,用孔径为0.22μm的过滤器过滤,收集滤液。
6、取10μL步骤5收集的滤液,进行高效液相色谱分析。
7、称取0.1g腺嘌呤核苷、腺嘌呤、胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷或麦角甾醇,用90%(v/v)甲醇水溶液溶解,得到浓度为2mg/mL的母液;将上述母液各取2.5μL,混合,然后用90%(v/v)甲醇水溶液稀释至1mL,得到混合标准品溶液(也叫做对照品)。
8、取10μL混合标准品溶液(也叫做对照品),进行高效液相色谱分析。
高效液相色谱分析结果见图8(A为混合标准品溶液,B为步骤5收集的滤液,1为胞嘧啶核苷,2为尿嘧啶,3为尿嘧啶核苷,4为腺嘌呤,5为胸腺嘧啶,6为肌苷,7为鸟苷,8为腺苷,9为3'-脱氧腺苷,10为麦角甾醇)。结果表明,步骤5收集的滤液即花脸香蘑DCH618子实体的提取液中含有胞嘧啶核苷、尿嘧啶、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、肌苷、鸟苷、腺苷等核苷类化合物,并含有高含量的麦角甾醇。
<110> 中国科学院微生物研究所
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<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 696
<212> DNA
<213> Lepista sordida
<400> 1
actaaggtga ctgcggagga tcattattga taaacttggt tgggttgtgc tggctttttg 60
gagcatgtgc acgcctagcg ccatttttac cacctgtgca ccttttgtag atttgaaaca 120
actctcgagg aaactcggtt tgaggaatgc tgtgtgcaaa catggctttc cttgtgtttc 180
aagtctatgt ttttattata ccccataaga atgtaataga atgttattaa tgggctttat 240
gcctttaaat taatacaact ttcaacaacg gatctcttgg ctctcgcatc gatgaagaac 300
gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa 360
cgcaccttgc gctccttggt attccgagga gcatgcctgt ttgagtgtca ttaaattctc 420
aaccttttca gcttttgcaa gttggattgg cttggatgtg gaggttattg cgggcttctc 480
tagaagtcgg ctcctcttaa atgcattagc ggaacctttg tggaccagct tttggtgtga 540
taattatcta cgccatggtt gtgaagcagc tttaacatgg ggttcagctt ctaacagtcc 600
attgacttgg acaaatttat gacatttttg acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa 660
cttaagcata tcataaagcc ggaggaaact agttcc 696

Claims (6)

1.花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.16980。
2.权利要求1所述花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618 CGMCC No.16980在同时生产胞嘧啶核苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、肌苷和麦角甾醇中的应用。
3.一种菌剂,其含有权利要求1所述花脸香蘑(Lepistasordida)DCH618 CGMCCNo.16980。
4.栽培权利要求1所述花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618 CGMCC No.16980得到的子实体。
5.培养权利要求1所述花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618 CGMCC No.16980得到的菌丝体。
6.权利要求4所述子实体的栽培方法,包括如下步骤:将权利要求1所述花脸香蘑(Lepista sordida)DCH618 CGMCC No.16980的菌丝体依次进行一级液体种制备、二级液体种制备、接种及发菌、覆土、出菇管理和出菇,得到子实体;
所述一级液体种制备的方法包括如下步骤:将权利要求1所述花脸香蘑(Lepistasordida)DCH618 CGMCC No.16980的菌丝体接种至一级液体种培养基中,15-25℃、100-200rpm避光培养至菌丝长满培养基,得到一级液体种;
所述二级液体种制备的方法包括如下步骤:将所述一级液体种接种至二级液体培养基,15-25℃、100-200rpm避光培养至菌丝长满培养基,得到二级液体种;
所述接种及发菌的方法包括如下步骤:将所述二级液体种接入栽培料中并覆膜,在空气相对湿度为65-75%条件下,15-28℃避光培养至菌丝长满栽培料;
所述覆土的方法包括如下步骤:在所述接种及发菌步骤中,待菌丝长满料面后将膜取下,在所述栽培料的料面上覆土,在空气相对湿度为70-75%、CO2的相对浓度在0.1-0.5%的条件下,15-28℃避光培养至菌丝生长到土层表面;
所述出菇管理的方法包括如下步骤:待所述覆土步骤得到的菌丝生长到土层表面时,补一层细土,维持温度为15-23℃、光照强度为500-800Lux、空气相对湿度为85-95%、空气中CO2相对浓度0.05-0.15%,培养5-10d得到蘑菇原基;
所述出菇的方法包括如下步骤:将所述出菇管理步骤得到的蘑菇原基转移至环境温度为18-20℃、空气相对湿度为75-90%、CO2相对浓度为0.05-0.15%的条件下培养,得到子实体;
所述一级液体种培养基为麦麸培养基;所述麦麸培养基的制备方法为:(1)用水煮法提取马铃薯200g和小麦麸皮20-80g,然后过滤,收集滤液;(2)向滤液中加入葡萄糖15-30g、大豆蛋白冻1-5g、酵母提取物0-3g,然后用水定容至1L,灭菌;
所述二级液体种培养基为发酵培养基;所述发酵培养基的制备方法为:将大豆粉0.5-1kg、白糖2-4kg、玉米面50-100g、淀粉10-30g、磷酸二氢钾213g、硫酸镁107g、消泡剂30-40g和水300L混合,灭菌。
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