CN106434381A - 纯白真姬菇菌株及其分子标记、特异性引物对和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食用菌技术领域，具体涉及纯白真姬菇菌株及其分子标记、特异性引物对和应用。本发明提供的纯白真姬菇菌株名称为Finc‑W‑5，属于真姬菇(Hypsizygus marmoreus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12520，保藏日期为2016年6月30日。本发明提供的技术方案，获得的新菌株菌种纯合度高，活力稳定，不易发生退化变异，栽培周期短,出菇时间较为集中，单产高，朵型优美，保鲜期长，非常适合于大面积推广种植，市场前景广阔。

Description

纯白真姬菇菌株及其分子标记、特异性引物对和应用
技术领域
本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种纯白真姬菇菌株及其分子标记、特异性引物对和应用。
背景技术
真姬菇(拉丁文名称Hypsizygus marmoreus)，隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，因它具有独特的蟹鲜味，故又称它为蟹味菇。目前栽培的有浅灰色和纯白色两个品系，白色品系又称“白玉蘑”、“玉龙菇”，深受市场欢迎，纯白真姬菇多为工厂化栽培。
最初的人工栽培于1978年前后开始于日本，其味道鲜美、食感脆嫩、营养丰富，其味比平菇鲜，其肉比滑菇厚,其质比香菇韧，口感甚佳，其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富维生素和17种氨基酸，子实体中提取的β-1，3-D葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性，是一种低热量、低脂肪的保健食品，未来具有广阔的市场前景。
在真姬菇工厂化生产中，往往会发现，原先一个优良的品种经过一段时间的生产之后，它的优良性状开始表现不明显，例如栽培周期延长，出菇率低，出菇不整齐，产量下降等。人为控制的各种生长因子与其最适生长环境有差异，环境的改变会加速品种某些性状的改变，所以在生产过程中，真姬菇品种特别容易发生变异而失去原有的优良性状。
对一个品种频繁继代，不适宜的培养条件及保藏条件是导致衰退的主要外因，由此导致菌丝体遗传物质发生变异，是菌种衰退的内因。食用菌菌种随着培养时间的延长，将会发生老化现象，产生一系列生理生化变化，老化菌种易 出现菌丝体萌发率下降，生长速度减慢，长势减弱，相应子实体栽培周期延长，出菇率低，出菇不整齐，产量下降等。
发明内容
本发明提供了一种纯白真姬菇菌株，用以解决目前菌株在继代过程中容易发生退化变异的技术缺陷的问题。
本发明还提供了一种稳定纯白真姬菇菌株的育种方法，用以解决目前对于菌株在继代过程中容易发生退化变异问题有针对性的育种方法。
本发明提供的纯白真姬菇菌株名称为Finc-W-5，属于真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12520，保藏日期为2016年6月30日。
所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5以H-W为亲本，通过多孢自交，再经选育获得。
所述多孢自交是指从一个亲本的孢子中培养分离出的两个以上的单核体在同一培养面上彼此之间相隔一定距离(一般在2-3cm)进行培养，从中分离筛选的出新菌株的方法。
品种的改良与选育一直是产业发展的需求，传统的育种手段主要采用杂交育种，从而获得杂种优势，但是这种品系虽然各方面性状都比较优良，但是其遗传基因多为杂合性的，表现为显性遗传性状，按照遗传学观点，某个基因发生改变，它的性状就有可能发生改变，而通过自交育种，则可以使其基因纯合，遗传性状更为稳定。
培养所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5得到的孢子也属于本发明的保护范围。
所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5作为亲本在育种中的应用也属于本发明的保护范围。
进一步的，所述育种方法选自单孢自交、单孢杂交、多孢自交或多孢杂交 育种中的应用。
培养所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5得到的菌丝体也属于本发明的保护范围。
栽培所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5得到的子实体也属于本发明的保护范围。
本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术进行筛选实验，通过随机引物获得了纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的特异DNA片段，分子量为1052bp，将该片段克隆测序，以此片段的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物对H13-F和H13-R，序列如下：
H13-F：5'-GAGTTTCCCCACCCCTTTTC-3'；
H13-R：5'-GCATTTTGCAATGGCGATG-3'。
采用上述特异性引物对对纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体进行SCAR-PCR扩增，获得特异片段，分子量大小为952bp，提取特异性引物对之间片段，获得分子量大小为913bp的特异片段，将其作为纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的分子标记。
特异引物对扩增获得的特异片段，序列如下：
5'-GAGTTTCCCCACCCCTTTTCGATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCTCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAATGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGC ACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGTGCATTTTGCAATGGCGATG-3'。
本发明提供了所述白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的分子标记，所述分子标记的序列为：
5'-GATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCTCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAATGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGCACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGT-3'。
本发明提供了所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的特异性引物对H13-F和H13-R，对纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体进行扩增，获得所述Finc-W-5或其子实体的分子标记，所述特异性引物对的序列如下：
H13-F：5'-GAGTTTCCCCACCCCTTTTC-3'，
H13-R：5'-GCATTTTGCAATGGCGATG-3'。
需要指出的是，上述特异性引物对不是唯一的可以获得所述分子标记片段的特异性引物对。
本发明还公开了一种纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的鉴定方法，其包括如下步骤：从待测样品中提取DNA样本，采用所述特异性引物对对DNA样本进行PCR扩增，获得的DNA片段与所述分子标记进行比对，从而鉴定待测样品是否为纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体。
需要指出的是，上述的鉴定方法只是鉴定纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的一种方式，本领域所知的其他方式也可用于纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的鉴定。
本发明还提供了所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5的子实体的一种栽培方法，包括如下步骤：
1)接种与发菌：将所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5的栽培种接入栽培种培养基，在温度18～23℃，空气相对湿度65-75％，二氧化碳浓度2000～4000ppm条件下培养70-85天；
2)子实体原基形成:出菇温度设定为13℃～15℃，空气相对湿度93％～100％，二氧化碳浓度1000～2000ppm，前1～7天，光照强度50～100Lux，之后光照强度200～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，菇盖接近成熟时采收。
优选地是，步骤1)中，所述栽培种培养基按重量百分比计,包括34-36％的栽培种培养料和64～66％的水,所述栽培种培养料包括玉米芯21％、杂木屑15％、米糠20％、麸皮20％,玉米粉5％、棉籽壳19％。
所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5的子实体在食品加工中的应用也属于本发明的保护范围。比如将纯白真姬菇菌株Finc-W-5的子实体做成菌菇干、菌菇粉、油炸菌菇、调味料等。
本发明所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5的形态特征如下：
菌丝：白色，气生菌丝发达，菌丝致密，菌落边缘圆整；
菌盖：直径为1.6±0.3cm，颜色为纯白色，断面圆山型，通体雪白，肉厚、肉质脆，斑纹清晰、中央分布，无龟裂；
菌褶：波状卷曲；孢子印颜色为白色；
菌柄：长度为6-8cm，中粗、雪白、无毛，与菌盖中心生，肉质脆。
通过对其子实体、菌丝体及孢子形态特征的观察，判断该菌株的生物学分类命名。
与现有技术相比，本发明提供的纯白真姬菇菌株Finc-W-5具有以下优点：
(1)子实体培养和栽培周期短，单产高，大大提高了生产效率，降低了生产成本；
(2)单株之间以及单株内单根子实体之间的外观均一度高，有利于机械化和自动化作业；
(3)菌种纯合，活力较为稳定，继代培养过程中不易发生退化变异；
(4)保鲜期长，有利于存储；
(5)目前纯白真姬菇种植资源稀缺，本发明提供的菌株综合特性优良，可以作为重要亲本从而培育出更多性能优良的菌株，丰富真姬菇种类。
综上所述，本发明提供的技术方案，获得的新菌株菌种纯合度高，活力稳定，不易发生退化变异，栽培周期短,出菇时间较为集中，单产高，朵型优美，保鲜期长，非常适合于大面积推广种植，市场前景广阔。
附图说明
图1是实施例2中纯白真姬菇菌株Finc-W-5和H-W的拮抗试验正面图，左 侧为H-W，右侧为Finc-W-5；
图2是实施例2中纯白真姬菇菌株Finc-W-5和H-W的拮抗试验背面图，左侧为H-W，右侧为Finc-W-5；
图3是本发明所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5栽培的子实体照片；
图4是本发明所述纯白真姬菇H-W栽培的子实体照片；
图5是实施例7中不同菌株在继代培养中菌丝生长速度变化趋势；
图6是实施例8中不同菌株在继代培养中栽培周期变化趋势；
图7是实施例8中不同菌株在继代培养中子实体单瓶产量变化趋势；
图8是实施例10中所述电泳图谱。
图中所示：
H13为F-W-5，H7为H-W，H6为Finc-W-247，H18为F-W-90，H19为F-W-62，H20为F-W-227，MK为mark。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的Finc-W-247、Finc-W-62、Finc-W-90和Finc-W-227菌株是上海丰科生物科技股份有限公司培育菌株,保藏于中国典型培养物保藏中心，Finc-W-247菌株保藏号CCTCC NO:M2012378；Finc-W-62菌株保藏号CCTCC NO:M2012375；Finc-W-90菌株保藏号CCTCC NO:M2012376；Finc-W-227菌株保藏号CCTCC NO:M2012377。H-W菌株从市场上购买的一种纯白真姬菇菌株，它的原基为纯白色，采收期菌柄为纯白色，菌盖为纯白色，在上海市农业科学院菌种保藏中心也有保藏；
下述实施例所用各种培养基的配方如下：
母种培养基(PDA培养基)：每1L培养基用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。
原种培养基：按重量百分比计包括38-40％的原种培养料和60％～62％的水，所述原种培养料按重量百分比计包括木屑65％(重量百分比，下同)、米糠18％、麸皮7％、玉米粉10％。
栽培种培养基：所述栽培种培养基按重量百分比计，其中含水量64％～66％。包括34-36％的栽培种培养料和64～66％的水，所述栽培种培养料包括玉米芯21％、杂木屑15％、米糠20％、麸皮20％，玉米粉5％、棉籽壳19％。
实施例1多孢自交获得Finc-W-5
采用多孢自交育种方法获得纯白真姬菇菌株Finc-W-5。
具体步骤如下：
1)市场购得亲本菌株H-W；
2)配制母种培养基、原种培养基和栽培种培养基：各培养基配方已经给出，在此不再赘述；
3)担孢子的分离：将亲本菌株H-W置于培养皿中，24小时后，收集落在培养皿中的孢子，在无菌水中稀释成适当的浓度，并涂布在PDA培养基平板上。在23℃下培养10天，待孢子萌发后用接种环分别接种到PDA斜面试管上。将这些试管在23℃下培养12天，然后从试管中分离出菌丝，并在显微镜下观察锁状联合的形成。将没有锁状联合的菌株储存在冰箱中备用；
4)自交：将一个单核体和另一个单核体彼此相隔2.5cm接种到新鲜的马铃薯琼脂板中，然后在恒温培养箱中23℃下培养10天。分离菌丝并通过显微镜观察以确定锁状联合的形成，选择具有锁状联合的菌株，通过此方法获得500个菌株；
5)把获得的菌株根据常规的方法进行栽培试验和筛选；
6)获得目标菌株：通过系统筛选，从500个菌株中，获得一个纯白真姬菇菌株，培养及栽培周期短，单产高，朵型优美，瘤盖菇出现率低，可食率高，保鲜期长，菌株活性稳定，该菌株被命名为Finc-W-5。
实施例2拮抗实验
本发明Finc-W-5和亲本菌株H-W为试验材料，所用培养基为PDA培养基。
Finc-W-5和亲本菌株H-W在平板培养基上分别对峙接种和培养，接种点相距2.5cm，23℃恒温培养18-20天，本试验结果请参阅表1。
表1不同纯白真姬菇菌株间拮抗试验
品种 H-W
Finc-W-5 拮抗
如图1-2所示，在对峙培养菌落交界处之间有明显拮抗线，说明Finc-W-5是与亲本菌株H-W不同的纯白真姬菇菌株。
实施例3栽培实验
本发明Finc-W-5与亲本菌株H-W分别进行培养和栽培，从70天到85天设置4个菌龄，每增加5天为一个菌龄，每个菌龄96瓶，然后对小批量栽培的结果进行汇总比较，总结出本发明菌株Finc-W-5的优势和特点。
本实施例培养基参加栽培种培养基，不再赘述。
栽培瓶容积：850cc，瓶口直径58mm。
培养：温度18-23℃，空气相对湿度65-75％，二氧化碳浓度2000～3500ppm条件下培养70-85天；
栽培：出菇温度设定为13℃～15℃，空气相对湿度93％～100％，二氧化碳浓度1000～2000ppm，前6天，光照强度50～100Lux，之后光照强度200～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，菇盖接近成熟时采收。
表2为Finc-W-5与亲本菌株H-W栽培试验结果，具体包括培养周期，栽培周期，单产。
表2纯白真姬菇菌株栽培试验结果
H-W最佳菌龄为85天，相应栽培周期为24天，平均单产为155克/瓶；Finc-W-5最佳菌龄为80天，相应栽培周期为22天，平均单产为185克/瓶；Finc-W-5在周期和单产方面均表现出明显的优势。
实施例4菌丝生长的温度梯度试验
本实施例以培养温度为标准，设计4组实验，从接种了Finc-W-5和H-W马铃薯琼脂板板上分别切取直径为5.0mm的接种块接种到PDA培养基上，分别于18℃、23℃、28℃和33℃培养15天，试验结果见表3。
表3温度对不同纯白真姬菇菌丝生长速率的影响
结果表明：Finc-W-5菌丝生长速度较H-W快；Finc-W-5的菌丝在23℃生长速度最快，达到3.81mm/d；当温度降低至18℃时，则生长速度逐渐下降为3.6mm/d，当升高到28℃，菌丝生长速度大幅下降为1.5mm/d，当33℃时，2个菌株均不能生长，由此可见，纯白真姬菇菌株Finc-W-5菌株的适宜培养温度为18-23℃。
实施例5形态特征和生物学特性
形态特征：Finc-W-5及其亲本H-W具体形态特征的差异请参阅表4。
表4不同菌株形态特征对比
如图3所示，Finc-W-5的形态特征：
菌丝：白色，气生菌丝发达，菌丝密度中等，菌落边缘圆整；
菌盖：直径为1.6±0.3cm，颜色雪白，断面呈圆山型，斑纹清晰，主要分布在菌盖中央，菌盖边缘圆整，表面无龟裂，质地脆嫩；
菌褶：白色、排列方式呈波状卷曲；孢子印颜色为白色；
菌柄：长度为6～9cm，白色，实心，与菌盖连接方式为中生，菌柄相互离生。
如图4所示，H-W的形态特征：
菌丝：白色，气生菌丝发达，菌丝致密，菌落边缘圆整；
菌盖：直径为2±0.5cm，颜色雪白，断面呈圆山型，斑纹清晰，主要分布在菌盖中央，菌盖边缘圆整，表面无龟裂，质地脆嫩；
菌褶：白色、排列方式呈波状卷曲；孢子印颜色为白色；
菌柄：长度为6～8cm，白色，实心，与菌盖连接方式为中生，菌柄相互离生。
生物学特征：
菌丝体培养温度23℃～28℃，湿度75％，CO2浓度2000ppm～3500ppm，培养周期70d～85d。适宜出菇温度为13℃～15℃，湿度93％～100％，CO2浓度1000～2000ppm，前6天光照强度50Lux～100Lux，之后光照强度200Lux～300Lux，每天间隙式开启层架灯刺激出菇，栽培周期约22-24d。
菌丝体的致死温度为45℃30min，担孢子的致死温度为50℃15min。
实施例6保鲜试验
本实施例开展真姬菇菌株H-W和Finc-W-5保鲜试验。
H-W和Finc-W-5采收后随即抽取20包，置于冷库(3℃～8℃)保藏至60天，有一株子实体开始霉腐，即为开始变质。不同品种在(3℃～8℃)的保质期请参阅表5。
表5保质期实验结果汇总
对比项目 H-W Finc-W-5
保质期(天) 24 32
由表5可知，Finc-W开始变质时间为24天，Finc-W-5保质期为32天。
实施例7继代培养菌丝生长速度试验
将Finc-W-5和H-W、Finc-W-247、Finc-W-262、Finc-W-90、Finc-W-227菌株在马铃薯琼脂板上分别切取直径为5.0mm的接种块接种到d＝9cm的PDA培养基中央，为了提高准确性，把培养好的平板菌种取同一半径圆周长生长一致的菌丝在23℃下恒温培养，每个处理重复5次。每个菌株分别继代15代，观察这六个菌株在继代培养过程中菌丝气生性，菌丝的疏密程度以及菌丝生长速度，图5给出了不同菌株在继代培养中菌丝生长速度的变化趋势。
如图5所示，Finc-W-2菌株在1-10代菌丝生长速度基本保持一致，11-15代菌丝生长速度略有下降，并且下降幅度不明显，而Finc-W-247，Finc-W-90，Finc-W-227菌株保持6代左右菌丝生长速度开始下降，Finc-W-62菌株第3代开始明显下降，H-W菌株第8代开始明显下降。
实施例8继代培养栽培试验
将Finc-W-5和H-W，Finc-W-247，Finc-W-62，Finc-W-90，Finc-W-227菌株进行培养和栽培，培养菌龄设置在80天，各继代15次，每个菌株每个世代共接种96瓶，然后对小批量栽培的结果进行汇总比较，总结出本发明菌株Finc-W-5的优势和特点。
本实施例培养及栽培方式参照实施例3，此处不再赘述。
图6和图7给出了不同菌株在继代培养中栽培周期变化趋势和单瓶产量变化趋势，结果分析如下：
Finc-W-5：1-12代，栽培周期22天，单产185-195之间；13-15代，栽培周期延长一天，单产略有下降，在178-180之间。
H-W:1-8代，栽培周期24天，单产152-165克；9-12代，栽培周期25天，单产128-148克；13-15代，栽培周期延长至26天，单产降低至120-125克。
Finc-W-547：1-6代，栽培周期22天，单产180-188之间；7-9代，栽培周期延长至23天，单产下降至160-172之间；第12代栽培周期延长至24天，单 产降低至158克；第12-15代，栽培周期延长至25天，单产降低至148-152克。
Finc-W-62：1-8代，栽培周期21天，单产较低135-145之间；9-11代，栽培周期延长至22天，单产下降至128-132之间；第12代-15，栽培周期延长至24天，单产降低至105-125克。
Finc-W-90：1-6代，栽培周期25天，单产158-165之间；7-8代，栽培周期延长至26天，单产下降至155-156之间；第9-10代，栽培周期延长至28天，单产降低至145-150克，第13-15代，栽培周期延长至29天，单产降低至140-140。
Finc-W-527：1-5代，栽培周期22天，单产194-195之间；6-10代，栽培周期延长至23天，单产下降至180-190之间；第11-15代，栽培周期延长至25天，单产降低至150-175。
由此可见，继代培养过程中，Finc-W-5保持稳定的单产和周期的世代最长，在第12代才开始出现单产略微下降和周期延长的趋势；Finc-W-227虽然在1-5单产高于Finc-W-5，周期和Finc-W-5一致，均为22天，但是从第6代开始，栽培周期延长至23天，单产速度降低；Finc-W-62虽然在1-8代栽培周期较Finc-W-5短，但是其单产仅在135-145克，综上所述，Finc-W-5菌株的活性更为稳定。
实施例9分子标记及特异引物的设计
纯白色真姬菇Finc-W-5的分子标记的获得方法，包括如下步骤：
1)菌株培养和气生菌丝获得
把低温保藏的Finc-W-5和H-W、Finc-W-247、Finc-W-262、Finc-W-90、Finc-W-227菌株接种到PDA培养基上，在温度22℃、湿度75％的条件下培养20天，刮取气生菌丝，-20℃冻存。
2)基因组DNA提取
在本实施例中，按照生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称“生工”)进行SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取菌株基因组，将所得到的DNA溶液置于-20℃冷藏，备用。
3)RAPD法分析
选用21条随机引物，见表6，进行RAPD分析。
表6随机引物
编号 引物编号 序列 编号 引物编号 序列
1 S23 AGTCAGCCAC 12 S95 ACTGGGACTC
2 S29 GGGTAACGCC 13 S99 GTCAGGGCAA
3 S38 AGGTGACCGT 14 S121 ACGGATCCTG
4 S42 GGACCCAACC 15 S122 GAGGATCCCT
5 S43 GTCGCCGTCA 16 S1327 ACGCGACAGA
6 S45 TGAGCGGACA 17 S6 TGCTCTGCCC
7 S47 TTGGCACGGG 18 S265 GGCGGATAAG
8 S48 GTGTGCCCCA 19 S31 CAATCGCCGT
9 S49 CTCTGGAGAC 20 S38 AGGTGACCGT
10 S67 GTCCCGACGA 21 S37 GACCGCTTGT
11 S80 ACTTCGCCAC
经过筛选，随机引物S265能扩增得到Finc-W-5菌株所特有的DNA条带，切取Finc-W-5特有的DNA条带，回收DNA。回收方法按照生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明。回收的DNA采用常规测序方法，结果见序列表，其为1052bp的DNA片段，序列如下：
5'-GGCGGATAAGGAGTTTCCCCACCCCTTTTCTAAGCCCCAATCGGCCCCTCAAAAAAATTGGGGCAAAGATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCCCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAATGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGCACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGTGCGAACCCTCTTTTTCCCGGAAGATAATCACCTGCATCGCCATTGCAAAATGCCTTCCATTGCTTATCCGCC-3'。
4)特异引物的获得
根据上述DNA片段，设计特异引物序列对H13-F和H13-R，序列分别为：
H13-F：5'-GAGTTTCCCCACCCCTTTTC-3'和
H13-R：5'-GCATTTTGCAATGGCGATG-3'。
在本实施例中采用Primer premier 5.0软件设计上述特异引物序列。
5)分子标记的确定
采用设计的特异性引物对，对Finc-W-5进行SCAR-PCR扩增，扩增出的DNA片段分子量为913bp，将其作为Finc-W-5或其子实体的分子标记，所述分子标记的序列为：
5'-GATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCTCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAA TGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGCACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGT-3'。
实施例10Finc-W-5鉴定
采用实施例9设计的特异性引物对，对Finc-W-5和H-W、Finc-W-247、Finc-W-262、Finc-W-90、Finc-W-227进行SCAR-PCR扩增，PCR反应体系见表7，PCR循环条件见表8。
表7PCR反应体系
试剂 体积(μl)
Template(基因组DNA 20-50ng/μl) 0.5
10×Buffer(with Mg2+) 2.5
dNTP(各2.5mM) 1
酶 0.2
F(10uM) 0.5
R(10uM) 0.5
加双蒸H2O至 25
表8PCR循环条件
取上述PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，进行琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像仪上照相，其结果请参阅图8电泳图谱。
从图8可知，只有本发明纯白色真姬菇新菌株Finc-W-5菌株有专一扩增条带，说明只有Finc-W-5扩增出了特异DNA片段，可以通过电泳图谱清晰的判断是否为Finc-W-5，进一步可对扩增的片段进行测序，与实施例9中所述分子标记进行比对，确定是否为Finc-W-5。
本实施例建立的纯白真姬菇Finc-W-5菌株的SCAR分子标记，能够对Finc-W-5菌种进行快速鉴定。
其包括如下步骤：从待测样品中提取DNA样本，采用实施例9所述特异性引物对对DNA样本进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳法或基因测序法与所述分子标记进行比对，从而鉴定待测样品是否为纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体。
以上描述仅为本发明的实施例，谅能理解，在不偏离本发明构思的前提下，对本发明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。
发明名称：纯白真姬菇菌株及其分子标记、特异性引物对和应用
申请人： 上海丰科生物科技股份有限公司 青岛丰科生物科技有限公司 河北丰科生物科技有限公司
分子标记（913bp）：
GATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCTCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAATGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGCACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGT
H13-F（20bp）：
GAGTTTCCCCACCCCTTTTC
H13-R（19bp）：
GCATTTTGCAATGGCGATG
实施例9随机引物提取的DNA片段（1052bp）：
GGCGGATAAGGAGTTTCCCCACCCCTTTTCTAAGCCCCAATCGGCCCCTCAAAAAAATTGGGGCAAAGATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCCCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAATGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGCACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGTGCGAACCCTCTTTTTCCCGGAAGATAATCACCTGCATCGCCATTGCAAAATGCCTTCCATTGCTTATCCGCC

Claims (10)

1.一种纯白真姬菇菌株，其特征在于，名称为Finc-W-5，属于真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.12520，保藏日期为2016年6月30日。
2.一种纯白真姬菇孢子，其特征在于，为培养权利要求1所述Finc-W-5得到的孢子。
3.权利要求1所述Finc-W-5作为亲本在育种中的应用。
4.一种纯白真姬菇菌丝体，其特征在于，为培养权利要求1所述Finc-W-5得到的菌丝体。
5.一种纯白真姬菇子实体，其特征在于，为栽培权利要求1所述Finc-W-5得到的子实体。
6.权利要求5所述Finc-W-5子实体在食品加工中的应用。
7.权利要求1所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的分子标记，其特征在于，所述分子标记的分子量为913bp，所述分子标记序列为：
5'-GATCGGACGTCCCCTGGCACCCATCTGTGATGTGTAGATTTGACAACACTCCGGAGAGCACCGCCGCTCCATTTCAGATTTACGAGCGTCTGGAGATGCAAGAGACAGTGCCAGGGTTCCTCACCCGATACCTCATGCGAGGCGTCAGAGGGATCGTTGGAAGAATTAGTGCTTGTCGAGACGCATTTTCATAACGCAGCGTGTATGCAAAAGAAATATCAGTCTCTCAGCAGATTGGGCTGAAATCGCCTCGCAAATACTCTCTATTTCCACTAACCAATAGGGCTAGTCATCAGCTGTAGTATCTGAGTCGTCGGGATGATGATCCCACCAGTCAATTTATCCCTGCCACTGTTCCCTGGGCAATAGACCTTTGAGAAATGCGTTACTCAAAATTATATCTTTGTCATTCTCAGCGACTAATTGCCGGAGTGTGTCGAGTTCCAGCGCATCGACATGATGCCGGCAAATCAGCCCAATTGTTTTGAGGTCATCCGGCATTTCGAATTCCGCTTCCTCCACCAAATTTTTTAAAAGCACTTCTTCTTTTGGAGAGTAAATATTAAAAATCAAACCGATGAAAAATAACGCACTCATTCTTTCATATGGGACGCTATTTCTTGCTCCGTACTGCAATCGCTCTTTGAGGCTCATAAGTTTATGAACTATGACGGGCCTAGCAGCTGTAAATTGATCTCTCGCACCTCCAGCTATATTCCTGTCGATCCGAGGGGACAATAGCAGGTTAAGCACTAAAGCGACTGTATCCCTTACTTTGCTGCTGAGGGCAACGATGGGAGAGCCAGGCAATATAACACAGGAAGTACGATGTAATTTATCTACCCAACTCTGCACGCGAAGAGTTAACCAAGCGCGAGAGTTATTTGCAGGAATTCCGTGCGAGCGCCTATGT-3'。
8.权利要求1所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的序列如下：
H13-F：5'-GAGTTTCCCCACCCCTTTTC-3'，
H13-R：5'-GCATTTTGCAATGGCGATG-3'。
9.权利要求1所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的鉴定方法，其特征在于，通过待测样本与权利要求7所述纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体的分子标记的比对结果加以鉴定。
10.根据权利要求9所述鉴定方法，包括如下步骤：从待测样本中提取DNA样本，采用权利要求8所述的特异性引物对对所述DNA样本PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳法或基因测序法与权利要求7所述分子标记进行比对，从而鉴定所述待测样本是否为纯白真姬菇菌株Finc-W-5或其子实体。
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