CN102668885B - 一种黄伞新菌株及其子实体栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄伞新菌株及其子实体栽培方法。本发明所提供的黄伞具体为黄伞（Pholiota adipose）HS5，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6063。本发明所提供的黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCCNo.6063出菇早，菌丝长满菌袋后10-15d即可完成头潮菇采收，较现有黄伞（Pholiota adipose）1号栽培品种提前8-9d，且产量高，头两潮菇的生物学效率达67.88%，远大于现有黄伞（Pholiota adipose）1号栽培品种的42.67%，这表明黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063适合工厂化栽培。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄伞新菌株及其子实体栽培方法。
背景技术
黄伞学名Pholiota adipose(Fr)Quél.，俗名黄柳菇、多脂鳞伞、柳蘑、黄蘑、肥柳菇、柳松菇、柳树菌、刺儿菌、黄环锈菌、肥鳞儿、柳钉、黄丝菌等。在分类学上属菌物界，担子菌门，伞菌纲，伞菌亚纲，伞菌目，球盖菇科。黄伞子实体色泽鲜艳呈金黄色，菌盖菌柄上布满黄褐色鳞片。该菌富含蛋白质、碳水化合物、维生素及多种矿物质元素，食之黏滑爽口，味道鲜美，风味独特；菌盖上有一种特殊的黏液，据生化分析表明，这种物质是一种核酸，对人体精力、脑力的恢复有良好效果。黄伞是一种中低温型食用菌，产量较高，市场售价较好，是大有发展前途的食用菌新品种之一。
黄伞子实体单生或丛生，菌盖直径5-12cm，初期半球形边缘常内卷，后渐平展，有一层粘液；盖面色泽金黄至黄褐色，附有褐色近似平状的鳞片，中央较密。菌肉白色或淡黄色。菌褶直生密集，浅黄色至锈褐色，直生或近弯生，稍密。菌柄纤维质长5-15cm，粗1-3cm，圆柱形，有白色或褐色反卷的鳞片稍粘，下部常弯曲。菌环淡黄色，毛状，膜质，生于菌柄上部，易脱落。孢子椭圆形，光滑，锈色，7.5-10μm×5-6.5μm。菌丝初期白色，逐渐浓密，生理成熟时分泌黄褐色素。
发明内容
本发明提供了一种黄伞新菌株及其子实体栽培方法。
本发明提供的黄伞新菌株采自北京市海淀区紫竹院公园柳树上，经中国科学院微生物所卯晓岚先生鉴定为黄伞，并组织分离获得原始菌株，将该菌株命名为黄伞（Pholiota adipose）HS5，该菌株已于2012年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.6063。
所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063在作为亲本进行杂交育种中的应用也属于本发明的保护范围。
栽培所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063得到的子实体也属于本发明的保护范围。
培养所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063得到的菌丝体也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的子实体的栽培方法，可包括如下步骤：
（1）接种及发菌：将所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的栽培种接入栽培培养基，在环境温度为23℃-25℃，空气相对湿度为50%-60%，通风良好，暗光条件下培养30-32d，菌丝可长满培养基；
（2）低温刺激：转移至-5℃-5℃条件下处理3-5d；
（3）出菇：转移至环境温度为15℃-20℃，空气相对湿度80%-90%，光照300-600Lux，通风良好，二氧化碳浓度在2000-2300ppm之间的条件下培养7-10d至子实体原基形成，继续培养；
（4）采收：3-5d后，子实体菌柄长至10cm左右，菌盖尚未完全展开，即可采收。
在上述栽培方法中，所述栽培培养基具体由棉籽壳、木屑、麦麸、玉米粉、石膏、石灰和水混合而成；其中，所述棉籽壳、所述木屑、所述麦麸、所述玉米粉、所述石膏和所述石灰的质量百分配比为60%∶18%∶15%∶5%∶1%∶1%；所述水在所述栽培培养基中的质量百分含量为60%-65%。
在上述栽培方法中，所述栽培种可通过如下方法获得：
（1）母种制备：将所述黄伞（p.adipose）HS5CGMCC No.6063接种到母种培养基上，24℃-28℃避光培养10-12d，得到的菌丝体作为母种；所得母种若不及时使用，可贮藏于4℃。
（2）原种制备：将步骤（1）所得的母种转接到原种培养基上，培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度为50%-60%，通风良好，避光培养至菌丝长满容器，得到所述原种。原种一般室温存放期不超过15d，低温存放不超过20d，过期菌种不能使用。
（3）栽培种制备：将步骤（2）所得的原种转接到栽培培养基上，在环境温度为23℃-25℃、空气相对湿度为50%-60%、通风良好、避光的条件下，培养30-32d菌丝长满菌袋，获得所述栽培种。
所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的子实体在食品加工中的应用也属于本发明的保护范围。
所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的子实体干后香味浓，食用时质地特脆。
本发明所提供的黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063出菇早，菌丝长满菌袋后10-15d即可完成头潮菇采收，较现有黄伞（P.adipose）1号栽培品种提前8-9d；且产量高，头两潮菇的生物学效率达67.88%，远大于现有黄伞（P.adipose）1号栽培品种的42.67%。黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063适合工厂化栽培。
保藏说明
建议分类命名：黄伞
拉丁名：（Pholiota adipose）
参椐的生物材料：HS5
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2012年4月26日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6063
附图说明
图1为黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063的子实体形态。
图2为黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063的孢子形态。
图3为黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063的菌丝形态，箭头所指为菌丝的锁状联合。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
黄伞（Pholiota adipose）1号：孟俊龙，梁志英，刘靖宇等.黄伞高产优质栽培模式研究.中国食用菌.2006（25）：27-30.
下述实施例所用各种培养基的配方如下：
（1）母种培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、MgSO4 0.2g、KH2PO40.25g、K2HPO4 0.25g、VB1 0.5mg、琼脂粉15g、水1000mL、pH7.0。
（2）原种培养基：由木屑、麸皮、石膏、石灰和水混合而成；其中，所述木屑、所述麸皮、所述石膏和所述石灰的质量百分配比为78%∶20%∶1%∶1%；所述水在所述栽培培养基中的质量百分含量为60%-65%。
（3）栽培培养基：由棉籽壳、木屑、麦麸、玉米粉、石膏、石灰和水混合而成；其中，所述棉籽壳、所述木屑、所述麦麸、所述玉米粉、所述石膏和所述石灰的质量百分配比为60%∶18%∶15%∶5%∶1%∶1%；所述水在所述栽培培养基中的质量百分含量为60%-65%。
实施例1、黄伞（P.adipose）HS5的分离与鉴定
本发明菌株（记作HS5）的野生子实体采自北京市海淀区紫竹院公园柳树上，经中国科学院微生物所卯晓岚先生鉴定为黄伞（Pholiota adipose）。进一步，通过对其子实体、菌丝体及孢子形态特征的观察，以及基因间隔序列（ITS）测序，判断该菌株的生物学分类命名。
一、形态特征
1、子实体形态特征
本发明菌株HS5子实体一般中等大（图1）。菌盖直径2-10cm，初扁半球形，边缘常内卷，后渐平展，谷黄色、污白色至黄褐色，很粘，有褐色近平伏的鳞片，中央较密。菌肉白色或淡黄色。菌褶黄色至锈褐色，直生或近弯生，稍密，不等长。菌柄长5-15cm，粗0.5-3cm，圆柱形，与盖同色，有褐色反卷的鳞片，粘或稍粘，下部常弯曲，纤维质，内实。菌环淡黄色，膜质，生菌柄之上部，易脱落。菌褶初乳白，采收时乳黄色，成熟时释放出大量锈褐色孢子，孢子椭圆形，光滑、直径（7.2-9.8）μm×（5.2-6.5）μm（图2）。在光学显微镜下，菌丝具有锁状联合（图3）。该菌子实体干后香味浓，食用时质地特脆。
2、菌丝体形态特征
本发明菌株HS5的菌丝初期菌丝白色至淡黄色，边缘整齐，较密；后期菌丝颜色逐渐加深至深黄色或黄褐色。
通过上述形态学鉴定，将本发明菌株HS5初步判断为黄伞（Pholiota adipose）。
二、rDNA-ITS测序
采用分子生物学方法对从采集的子实体中分离得到的菌丝体进行rDNA-ITS测序，其测序结果如序列表中序列1所示。将序列1与Genbank No.：FJ810180（黄伞（Pholiota adipose）进行DNAMAN剪切比对处理，发现其同源性达99.41%，Renske等在对土层中分布的外生菌根菌群落进行分子鉴定的研究中提出，供试的rDNA ITS序列通过与NCBI的GenBank数据库进行BLAST检索比对，序列相似性≥99％，可以鉴别为相同种；序列相似性为95％～99％，可以鉴别为相同属；序列相似性≤95％，可以鉴别为相同科（Renske L，Paula L，Thom W K,et al.Molecular identification ofectomycorrhizal mycelium in soil horizons.Applied and environmental microbiology，2003,69(1):327-333.）。因此，rDNA-ITS测序结果表明本发明菌株HS5与Genbank No.：FJ810180（黄伞（Pholiota adipose）为同一个种，均为黄伞菌株，这进一步证实了形态学观察鉴定结果的正确性。
鉴于上述形态特征、rDNA-ITS测序鉴定结果，将本发明菌株HS5鉴定为真菌界，担子菌门，层菌纲，伞菌目，球盖菇科，环锈伞属的黄伞（Pholiota adipose）。该菌株已于2012年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.6063。
实施例2、黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063子实体的人工栽培
一、菌种的制备
（1）母种制备：将实施例1获得的所述黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCCNo.6063接种到母种培养基上，24℃-28℃避光培养10-12d，得到的菌丝体作为母种；所得母种若不及时使用，可贮藏于4℃。
（2）原种制备：将步骤（1）所得的母种转接到原种培养基上，培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度为50%-60%，通风良好，避光培养至菌丝长满容器，得到原种。原种一般室温存放期不超过15d，低温存放不超过20d，过期菌种不能使用。
（3）栽培种制备：将步骤（2）所得的原种转接到栽培培养基上，在环境温度为23℃-25℃、空气相对湿度为50%-60%、通风良好、避光的条件下培养30-32d菌丝长满菌袋，获得所述栽培种。
二、栽培方法
黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的栽培流程具体如下：
培养基制作→冷却接种→发菌→低温刺激→出菇→采收
（1）培养基制作及装袋
按照上文栽培培养基的配方配制得到栽培培养基，将其按照常规方法制备菌袋，使用的菌袋规格为17cm×33cm×0.04cm的耐高压塑料袋，每袋装干料（栽培培养基中除水外的其他组分）0.40kg。经高压灭菌，冷却后得到待接种菌袋。
（2）接种及发菌：将经过上述步骤一获得的所述黄伞（P.adipose）HS5CGMCCNo.6063的栽培种均匀接入步骤（1）制备的菌袋，每袋接种量为3.14×10-5m3。接种后在环境温度为23℃-25℃，空气相对湿度为50%-60%，通风良好，避光条件下培养，30-32d后菌丝可长满培养基；
（2）低温刺激：转移至-5℃-5℃条件下处理3-5d；
（3）出菇：转移至环境温度为15℃-20℃，空气相对湿度80%-90%，光照300-600Lux，通风良好，二氧化碳浓度在2000-2300ppm之间的条件下培养7-10d至子实体原基形成，继续培养；
（4）采收：3-5d后，子实体菌柄长至10cm左右，菌盖尚未完全展开，即可采收第一潮菇。采摘后进行搔菌，进入菌丝恢复期，待菌丝回复后重新恢复上述操作进行出菇，采收第二潮菇，一般可采3-4潮菇。
实施例3、黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063菌丝生长速度、产量及营养成分的检测
本实施例以黄伞（P.adipose）1号为对照，检测黄伞（P.adipose）HS5 CGMCCNo.6063的菌丝生长速度、产量及营养成分。
一、菌丝生长速度的测定
1、实验材料
黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063和黄伞（P.adipose）1号菌株的母种、原种和栽培种，其制备方法同实施例2步骤一。
2、实验方法
母种菌丝平均生长速度测定：将两种黄伞母种分别接种于母种培养基表面的中央，培养2-3d后，记录菌丝位置（A），3-5d后记录菌丝位置（B），用直尺测量A与B之间的距离，除以两位置之间的天数即为菌丝的日平均生长速度，实验设置五个重复，结果取平均值。
栽培种菌丝平均生长速度测定：将黄伞原种接种于装有栽培培养基的栽培袋中央，使均匀分布，待菌丝萌发3-5d后，记录菌丝位置（A），5-7d后记录菌丝位置（B），用直尺测量A与B之间的距离，除以两位置之间的天数即为菌丝的日平均生长速度，实验设置五个重复，结果取平均值。
3、实验结果
对母种菌丝生长速度的测定结果如表2所示，黄伞（P.adipose）HS5 CGMCCNo.6063母种的菌丝生长速度可达5.59±0.19mm/d，高于对照黄伞（P.adipose）1号母种的菌丝生长速度4.33±0.05mm/d。
表2母种菌丝生长速度的测定结果（单位：mm/d）
| 菌株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值±标准差 |
| HS5 | 5.30 | 5.60 | 5.55 | 5.75 | 5.75 | 5.59±0.19 |
| 1号 | 4.30 | 4.40 | 4.30 | 4.30 | 4.35 | 4.33±0.05 |
对栽培种菌丝生长速度的测定结果如表3所示，黄伞（P.adipose）HS5CGMCCNo.6063栽培种的菌丝生长速度可达2.56±0.03mm/d，而对照黄伞（P.adipose）1号栽培种的菌丝生长速度为2.51±0.02mm/d，两者相比，无差异。
表3栽培种菌丝生长速度的测定结果（单位：mm/d）
| 菌株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | 重复5 | 平均值±标准差 |
| HS5 | 2.56 | 2.58 | 2.53 | 2.54 | 2.59 | 2.56±0.03 |
| 1号 | 2.50 | 2.53 | 2.51 | 2.52 | 2.49 | 2.51±0.02 |
二、产量的测定
将本发明的黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063与作为对照的黄伞（P.adipose）1号分别按照实施例2的栽培方法进行栽培，均收获头两潮菇，对其栽培周期及产量进行比对。实验设置三个重复，每个重复栽培150个菌袋，结果取平均值。
1、栽培周期
在实施例2所述栽培条件下，黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的发菌期需要30-32d，低温刺激3-5d，出菇条件下子实体原基形成期7-10d，子实体分化至采收3-5d，计算从接种至采收第一潮菇需要43-52d。菇潮间隔10-13d，第二潮菇子实体分化至采收5-7d。出两潮菇的整个生产周期共58-72d。黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063农艺性状的一致性良好，表现为出菇整齐，批量栽培的子实体头潮菇从进入出菇房（对应于实施例2栽培方法中的（3））到采收10-15d即可完成。
在实施例2所述栽培条件下，黄伞（Pholiota adipose）1号发菌期为34-38d，低温刺激3-5d，出菇条件下子实体原基形成期10-12d，子实体分化至采收4-6d，计算从接种至采收第一潮菇共需要51-61d。菇潮间隔12-15d，第二潮菇子实体分化至采收5-8d。出两潮菇的整个生产周期为68-84d。
统计上述结果，黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063较作为对照的黄伞（P.adipose）1号栽培品种提前8-9d完成头潮菇采收，适合工厂化栽培。
2、产量
以“生物学效率”表示产量。所述生物学效率是指食用菌鲜重与所用的培养料干重（栽培培养基中除水外的其他组分）之比，常用百分数表示。如100kg干培养料生产了80kg新鲜食用菌，则这种食用菌的生物学效率为80%。
在实施例2所述栽培条件下，黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063头两潮菇的生物学效率可达67.88±1.33%，远高于作为对照的黄伞（P.adipose）1号头两潮菇的生物学效率42.67±1.35%，详见表4。
表4头两潮菇的产量（生物学效率）统计（单位：%）
| 菌株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 |
| HS5 | 69.19 | 67.91 | 66.53 | 67.88±1.33 |
| 1号 | 41.52 | 42.33 | 44.15 | 42.67±1.35 |
三、营养成分的分析
从步骤二收获的黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063和作为对照的黄伞（P.adipose）1号的头两潮菇中各自随机选取500g进行营养成分（氨基酸含量及维生素含量）的分析，由谱尼测试中心测定。氨基酸（表5中的18种氨基酸）中除色氨酸外，参照食品中氨基酸的测定参照GB/T 5009.124-2003；硫胺素（维生素B1）的测定参照GB/T 5009.84-2003；核黄素（维生素B2）的测定参照GB/T 5009.85-2003；维生素B6的测定参照GB/T 5009.154-2003；烟酸和烟酰胺（维生素B3、PP）的测定参照GB5413.15-2010。实验设置3个重复，结果取平均值。
其氨基酸及维生素含量如表5和表6所示。黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063与作为对照的黄伞（P.adipose）1号的子实体氨基酸含量相比相差不大；而在维生素水平上，黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063的维生素B2含量是黄伞（P.adipose）1号的近8倍，维生素B6是黄伞（P.addiose）1号的2倍，维生素B1和B3含量相差不大；因此，综合以上分析，黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063菌株的营养成分大于对照菌株黄伞（P.adipose）1号，可作为黄伞（P.adipose）1号的替代菌株进行推广应用。
表5黄伞（P.adipose）HS5CGMCC No.6063与黄伞（P.adipose）1号子实体中的18种氨基酸含量比较（单位：g/100g）
| 氨基酸 | 1号 | HS5 | 氨基酸 | 1号 | HS5 |
| 天门冬氨酸 | 1.47±0.01 | 1.25±0.05 | 蛋氨酸 | 1.04±0.02 | 1.05±0.05 |
| 苏氨酸 | 0.76±0.01 | 0.69±0.03 | 异亮氨酸 | 0.74±0.01 | 0.72±0.04 |
| 丝氨酸 | 0.78±0.01 | 0.67±0.03 | 亮氨酸 | 1.20±0.01 | 1.13±0.06 |
| 谷氨酸 | 3.23±0.05 | 2.32±0.09 | 酪氨酸 | 0.40±0.00 | 0.38±0.02 |
| 脯氨酸 | 0.71±0.03 | 0.57±0.05 | 苯丙氨酸 | 0.81±0.01 | 0.70±0.03 |
| 甘氨酸 | 0.67±0.01 | 0.58±0.02 | 赖氨酸 | 0.83±0.01 | 0.89±0.04 |
| 丙氨酸 | 0.89±0.01 | 0.79±0.03 | 组氨酸 | 0.33±0.00 | 0.33±0.02 |
| 胱氨酸 | 0.14±0.01 | 0.14±0.01 | 色氨酸 | 0.20±0.00 | 0.24±0.00 |
| 缬氨酸 | 0.71±0.00 | 0.65±0.03 | 精氨酸 | 1.11±0.02 | 0.85±0.04 |
注：单位g/100g，指的是每100g干子实体中含有相应氨基酸的克数。
表6黄伞（Pholiota adipose）黄伞HS5CGMCC No.6063与黄伞（Pholiota adipose）
1号子实体中的维生素含量比较（单位：mg/100g）
| 维生素 | 1号 | HS5 |
| 维生素B2 | 0.30±0.01 | 2.27±0.00 |
| 维生素B1 | 0.21±0.00 | 0.23±0.00 |
| 维生素B6 | 0.37±0.01 | 0.78±0.01 |
| 维生素B3 | 75.00±2.00 | 72.50±3.50 |
注：单位mg/100g，指的是每100g干子实体中含有相应维生素的毫克数。
综合上述结果，本发明所提供的黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063菌丝生长速度较快，产量高，营养成分丰富，可作为常规生产菌株黄伞（Pholiotaadipose）1号的替代菌株进行推广应用。
Claims (7)
1.黄伞（Pholiota adipose）HS5，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6063。
2.权利要求1所述黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063在作为亲本进行杂交育种中的应用。
3.栽培权利要求1所述黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063得到的子实体。
4.培养权利要求1所述黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063得到的菌丝体。
5.权利要求3所述子实体的栽培方法，包括如下步骤：
（1）接种及发菌：将权利要求1所述黄伞（Pholiota adipose）HS5CGMCC No.6063的栽培种接入栽培培养基，在环境温度为23℃-25℃，空气相对湿度为50%-60%，避光的条件下进行培养，至菌丝长满培养基；
（2）低温刺激：待菌丝长满培养基后，转移至-5℃-5℃条件下处理3-5d；
（3）出菇：转移至环境温度为15℃-20℃，空气相对湿度80%-90%，光照300-600Lux，二氧化碳浓度在2000-2300ppm之间的条件下培养得到子实体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述栽培培养基由棉籽壳、木屑、麦麸、玉米粉、石膏、石灰和水混合而成；其中，所述棉籽壳、所述木屑、所述麦麸、所述玉米粉、所述石膏和所述石灰的质量百分配比为60%∶18%∶15%∶5%∶1%∶1%；所述水在所述栽培培养基中的质量百分含量为60%-65%。
7.权利要求3所述子实体在食品加工中的应用。
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