CN108728368A - 一种纯白色黑木耳菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纯白色黑木耳菌株及其用途，属于食用菌技术领域。纯白色黑木耳菌株JAUH‑W‑591，Auricularia heimuer，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.15374，保藏日期2018年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。优点是：纯白色黑木耳JAUH‑W‑591具有色泽洁白如玉，光滑透亮，吸水性好，泡发率高，可达到1:15左右，泡发后质地嫩、滑、粘糯，口感好，可以在东北地区越冬栽培。这在改变黑木耳原有色泽单一的同时，也有效改善了玉木耳质地、口感等商品性状，使得该产品在市场上具有独有性及竞争性。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌技术领域，尤其涉及一种纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591及其用途。
背景技术
黑木耳(拉丁文名称Auriculariaheimuer)，隶属于担子菌门(Basidiomycota)、蘑菇纲(Agaricomycetes)、木耳目(Ariculariales)、木耳科(Auriculariaceae)、木耳属(Auricularia)。又名光木耳、黑耳、云耳、黑菜等。中国是世界上最早栽培木耳的国家，关于最早木耳种植方法的记录为“煮浆粥安诸木上，以草覆之，即生蕈尔”，是唐代苏恭等在《唐本草注》中所提及的。黑木耳人工栽培大约在公元600年前后，起源于中国，是世界上人工栽培的第一个食用菌品种。2017年，我国黑木耳总产量达到600多万吨，是世界第四大栽培食用菌。
黑木耳营养丰富，具有非常重要的食用价值：据分析，黑木耳干品含蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维，还有钙、磷、铁等矿物质和多种维生素。有着“素中之荤”的美誉；黑木耳也是一种重要的药用菌。富含的胶质磷脂等物质，在人体消化系统内，对不溶性纤维、尘粒等具有较强附着力，是具有润肺、清涤胃肠和消化纤维素的作用的保健食品。由于黑木耳具有高蛋白、低脂肪、无污染、无公害、食药兼用的优势，现已受到世界各国广大消费者的普遍青睐。
众所周知，国内外黑木耳只有黑色品系。没有纯白色的黑木耳。故黑木耳一直因黑色，像耳状，称之为黑木耳，英文Black wood ear。
近年来李晓选育出的玉木耳，是白色的毛木耳品种，并不是黑木耳变异，却深受市场欢迎，关键原因是因为人们更喜欢白色食品。但是玉木耳仍然不能改变以下缺陷：(1)质地硬而脆，没有黑木耳筋道，口感不及黑木耳；(2)背部毛长，不够光滑。(3)泡发率低，泡发率仅为1：9左右。(4)不耐低温。温度长时间处于6℃以下，菌丝死亡，东北地区不能越冬栽培。
发明内容
本发明提供一种纯白色黑木耳菌株及其用途，本发明纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591是通过白色黑木耳菌株亲本杂交纯化后，再经系统选育获得，该菌株具有洁白如玉，光滑透亮，吸水性好，泡发率高，可达到1:15左右，泡发后质地嫩、滑、粘糯，口感好，可以在东北地区越冬栽培。
本发明采取的技术方案是：纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591，Auriculariaheimuer，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.15374，保藏日期2018年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
栽培纯白色黑木耳菌株得到的子实体。
所述纯白色黑木耳子实体在食品中的应用。
所述的纯白色黑木耳菌株的分子标记序列如SEQ ID No.1所示。
所述纯白黑木耳菌株的特异性引物对的序列如下：
5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3'，5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'。
本发明纯白色黑木耳JAUH-W-591的特征是：
1、形态特征
菌丝：菌丝体洁白、纤细，均匀一致，平贴培养基生长，菌落边缘整齐。子实体耳状，小孔出耳表现为单片簇生，耳片边缘呈波浪形，鲜耳纯白色，表面光滑有光泽，耳片直径4～6㎝，厚度0.07～0.15㎝，大孔出耳，干耳正面白色，背面白色，被白色短绒毛，褶状脉中等，商品性好。
2、生物学特性
纯白色黑木耳JAUH-W-591栽培营养成分按照黑木耳栽培来源为：硬杂木屑、麦麸、豆粕、轻质碳酸钙、石灰等，其中，含水量58％～59％。设置纯白色黑木耳JAUH-W-591菌丝体培养温度20～28℃，湿度65％～75％，CO2浓度2000ppm～3000ppm，培养周期25d～35d。子实体生长温度范围是6～32℃，最适温度15～25℃。菌丝体耐低温，在母种培养基上0℃放置24h后转接，仍能恢复生长。与现有东北地区广泛栽培的黑木耳、玉木耳相比较生长速度、分解木屑速度、产量、泡发率比较，纯白色黑木耳JAUH-W-591明显优于黑木耳。在产量和分解料的速度上虽然没有玉木耳快，但是在泡发率方面明显高于玉木耳。
3、遗传学特性
纯白色黑木耳JAUH-W-591的DNA经特异性引物
5’-CCGTTCATGATGTCTTTGATTTAG-3’和
5’-TTGTACTGAGACTGAGACCCAGAAC-3’的PCR扩增获得573bp大小的分子标记片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。
本发明优点是：纯白色黑木耳JAUH-W-591具有色泽洁白如玉，光滑透亮，吸水性好，泡发率高，可达到1:15左右，泡发后质地嫩、滑、粘糯，口感好，可以在东北地区越冬栽培。这在改变黑木耳原有色泽单一的同时，也有效改善了玉木耳质地、口感等商品性状，使得该产品在市场上具有独有性及竞争性。本发明营养丰富，含有粗蛋白11.9％，粗脂肪2.96％，可食膳食纤维26.4％，粗多糖6.85％，并含有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸18种氨基酸。研究结果显示，多糖及部分成分高于黑木耳。
附图说明
图1是JAUH-W-591亲本图；
图2A是JAUH-W-591与亲本毛木耳之间正面拮抗图，图中JAUH-W-591与毛木耳之间明显的拮抗线，说明JAUH-W-591完全不同于毛木耳；
图2B是JAUH-W-591与亲本毛木耳之间背面拮抗图，图中JAUH-W-591与毛木耳之间明显的拮抗线，说明JAUH-W-591完全不同于毛木耳；
图2C是JAUH-W-591与亲本黑木耳之间正面拮抗图，图中JAUH-W-591与黑木耳之间明显的拮抗线，说明JAUH-W-591完全不同于黑木耳；
图2D是JAUH-W-591与亲本黑木耳之间背面拮抗图，图中JAUH-W-591与黑木耳之间明显的拮抗线，说明JAUH-W-591完全不同于黑木耳；
图2E是JAUH-W-591与亲本玉木耳之间正面拮抗图，图中JAUH-W-591与玉木耳之间明显的拮抗线，说明JAUH-W-591完全不同于玉木耳；
图2F是JAUH-W-591与亲本玉木耳之间背面拮抗图，图中JAUH-W-591与玉木耳之间明显的拮抗线，说明JAUH-W-591完全不同于玉木耳；
图3是纯白黑木耳亲本JAUH-W-02单孢菌丝荧光显微图；
图4是纯白黑木耳亲本JAUH-W-02多孢杂交图；
图5A是纯白黑木耳亲本JAUH-W-02孢子萌发12h时的状态图；
图5B是纯白黑木耳亲本JAUH-W-02孢子萌发24h时的状态图；
图6是纯白黑木耳亲本JAUH-W-02多孢杂交出耳图，多孢杂交会出现黑的、白色以及过渡色；
图7是JAUH-W-591子实体原基图；
图8是JAUH-W-591子实体最佳采收期图；
图9是待测菌株DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中1为JAUH-W-591，2为JAUH-W-01，3为玉MC6，4为JAUH-B-S4，M为marker，marker是DL2000 DNA Marker；
图10是通用引物ITS1和IT4对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为JAUH-W-591，2为JAUH-W-01，3为玉MC6，4为JAUH-B-S4，M为marker；
图11是JAUH-W-591的系统发育树；
图12A是随机引物B1对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为JAUH-W-591，2为JAUH-W-01，3为玉MC6，4为JAUH-B-S4，M为marker；
图12B是随机引物B2对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为JAUH-W-01，2为JAUH-W-591，3为玉MC6，4为JAUH-B-S4，M为marker；
图12C是随机引物B3对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为JAUH-W-591，2为JAUH-W-01，3为玉MC6，4为JAUH-B-S4，M为marker；
图12D是随机引物B4对4个菌株的PCR扩增电泳图谱，其中1为JAUH-W-591，2为JAUH-W-01，3为玉MC6，4为JAUH-B-S4，M为marker。
具体实施方式
实施例1本发明纯白色黑木耳JAUH-W-591栽培方法
(1)母种制作，纯白色黑木耳JAUH-W-591的母种培养基为PDA培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL，pH＝6.5～6.7，将去皮后马铃薯切1cm3见方小块，在沸水中煮15～20min后用6层纱布进行过滤，将滤液再次煮沸加入琼脂并不断搅拌，待琼脂完全溶解后加入葡萄糖，定容至1000mL，装入试管或三角瓶内，胶塞或棉塞封口覆盖铝箔纸，121℃高压条件下灭菌30min，冷却到25℃左右，在超净工作台内接入JAUH-W-591菌种，然后放入25℃恒温培养箱，暗光培养12天左右，母种即可长好；
(2)纯白色黑木耳JAUH-W-591枝条原种制作，将准备好的枝条分散开泡入加有0.5％的石灰水中，待枝条泡至无白芯，将其捞出沥干枝条表面多余的水分，将枝条表面沾满含水量为50％的麦麸，每30支枝条为一组装入规格为12cm×20cm的菌袋内，菌袋内空隙用含水量55％的麦麸填充，在每组枝条中间插入插棒，作为接种预留口，121℃灭菌60min，灭菌结束待高压灭菌锅压力将为0MPa时，温度降至60℃以下即可出锅。将完成灭菌的枝条放入超净工作台内，待其冷却至25～30℃，在无菌条件下进行接种，接入上面准备好的JAUH-W-591母种，完成接种的枝条做好标记后，放入25℃恒温培养箱，暗光培养30～35d左右，原种即可长好；
(3)纯白色黑木耳JAUH-W-591的菌包制作，纯白色黑木耳JAUH-W-591出耳菌包配方为：粗木屑48％、细木屑40％、麦麸9％、豆粉1.5％、石膏1％、石灰0.5％，含水量55％，灭菌前调节pH＝7.5～8.0，按配方要求准确称量粗木屑并提前24h进行预湿，准确称量各种原料后细木屑与麦麸进行混匀，豆粉、石灰和石膏进行混匀，两者混匀后再将两者与预湿好的粗木屑混合在一起，加水调节含水量为55％，并将所有原料充分混匀，使用卧式装袋机进行装袋处理，保证每个菌包种1.25kg，将菌袋上方多余菌袋窝入料的预留孔内，插入插棒，预留孔以方便接入上面准备好的JAUH-W-591原种，将制作好的菌包放置于常压灭菌锅内，待锅内温度升至100℃后，保持12h，灭菌完成待锅内温度降至60℃以下进行出锅，将菌包摆进接种箱内，并用二氧化氯药剂进行药熏处理，待药味下降，烟雾散尽即可进行接种操作；
(4)纯白色黑木耳JAUH-W-591的菌包培养，培养室在菌包进入前三天进行消毒处理，并进行环境监测，检测合格后方可放入菌包进行培养，将完成接菌的菌包放置于环境合格的培养室内进行培养，菌包进行培养室的前三天仍进行熏药处理，菌包培养的前7天培养室温度保持在25±1℃，7～15天培养室温度降至23±1℃，菌包培养15天后，温度降至20±1℃。菌包进入培养室7天后，每天早8点和晚6点进行两次通风处理，待菌包完成培养即可进行出耳工作；
(5)纯白色黑木耳JAUH-W-591催芽管理，将培养好的菌包按照编号进行分类处理，每个编号菌包单独处理，使用前对打孔机进行调节，打孔机上安装18排滚轮且各滚轮间距相等，调节打孔深度为5～8mm，调整好的打孔机表面用75％酒精进行消毒，完成调整和消毒后即可对菌包进行打孔处理，每个菌包打孔234个，将完成打孔的菌包按编号码好，进行催芽工作，将完成打孔后的菌包上方覆盖塑料薄膜及草帘子，以保证温度及湿度，湿度控制在80～85％，即菌包表面始终保持存在一层薄薄的水汽，当温度低于16℃不能进行浇水工作；催芽期间菌包对氧气的消耗量较小，不需要大通风，只需保证上午十点左右进行通风即可；纯白色黑木耳JAUH-W-591催芽期间最适的温度为20～24℃，催芽期间避免阳光直射，散射光有助于原基的形成；
(6)纯白色黑木耳JAUH-W-591菌包挂袋，待菌袋表面形成原基后，即可进行挂袋处理；
(7)纯白色黑木耳JAUH-W-591出耳管理，出耳管理主要包括两个阶段，即原基分化耳片阶段和耳片展片阶段，原基分化耳片阶段空气湿度始终保持85～90％，减少避免干湿交替的次数；温度控制在20～22℃，避免温度超过24℃；原基分化阶段需要高浓度氧气，加大通风，二氧化碳浓度不得高于3000ppm，当原基分化成1cm大小耳片时，停止浇水48h，待耳片完全干后，再次浇水，耳片展开阶段，当温度高于22℃时停止浇水，当温度处于16～22℃之间时，每次浇水10～20min，以纯白色黑木耳JAUH-W-591耳片全部湿透为标准。
下边通过实验例来进一步说明本发明。
以下实验例中的所述“JAUH-W-01”菌株是吉林农业大学黑木耳栽培示范基地发现的一种白色变异黑木耳菌株，它的子实体原基为灰白色，随着子实体发育，逐渐分化出黑白双色子实体，经过多次分离纯化后进行栽培，在栽培袋上，白色子实体渐多，通过多次分离纯化后，获得“JAUH-W-02”菌株，其子实体白色近透明。采用多孢杂交方法，获得遗传稳定的纯白色黑木耳“JAUH-W-591”菌株。
实验例1变异菌株“JAUH-W-01”分离纯化
本发明白色黑木耳变异菌株“JAUH-W-01”分离纯化过程包括如下步骤：
1)自然晾晒白色黑木耳变异菌株，标本保藏于吉林农业大学食用菌教育部工程研究中心；
2)配制培养基
PDA培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，pH＝6.5～6.7，将去皮后马铃薯切1cm3见方小块，在沸水中煮15～20min后用6层纱布进行过滤，将滤液再次煮沸加入琼脂并不断搅拌，待琼脂完全溶解后加入葡萄糖，定容至1000ml。装入试管或三角瓶内，胶塞或棉塞封口覆盖铝箔纸。121℃高压条件下灭菌30min；
3)“JAUH-W-01”菌种分离(组织分离)
将PDA斜面试管、无菌培养皿、青霉素、镊子等放入超净工作台中，紫外灭菌30min。紫外灭菌完成后，用75％酒精棉对双手、镊子和待分离耳片进行消毒，减少杂菌的基数。在两个培养皿内各加入10ml的75％酒精及青霉素一支，命名为1号及2号。用镊子将白色变异耳片边缘内卷的部分去掉，在无褶皱的耳片光滑的地方夹取约3mm2的耳片所需数量放入1号培养皿中，放置1min，之后取出放入2号培养皿内，放置1min，用灭菌冷却后的镊子夹取耳片从酒精灯火焰上快速穿梭1s后放入试管内。将分离后的试管放入26℃恒温培养箱内，进行培养。待培养4～6天，在培养皿内挑取生长整齐的前端菌丝快速转接到另一个PDA斜面培养基或培养皿上进行纯化培养，作为纯菌种，放置于26℃恒温培养箱内进行培养。挑选出菌丝洁白、粗壮、浓密、均一，生长速度快的菌株，该菌株编号为“JAUH-W-01”。
实验例2白色黑木耳菌株“JAUH-W-02”的分离纯化
1)液体培养基制作
取蛋白胨10g、葡萄糖10g、氯化钠5g、牛肉膏5g放入大烧杯中；再加水1000ml，待完全溶解后，调节pH6.8～7.5；分装于小三角瓶(200ml)，塞上瓶塞牛皮纸扎好；培养基灭菌保温时间为121℃，15min；
2)液体菌种制作
用揭盖夹揭开平板盖，用托平板的夹子夹住平板；用接种钩刮掉平板表面JAUH-W-02的气生菌丝；用接种刀在距离老接种块2cm处上下左右均匀切取3-5mm大小JAUH-W-02的菌种块；将平板固定在托平板的夹子中，放到三脚架上灼烧接种钩，放在工具架上冷却；取下铝铂纸，用坩埚钳拔去瓶塞，并将坩埚钳和瓶塞放在工具架上，保持瓶塞无物体接触；用接种钩取4块JAUH-W-02的菌种，移入摇瓶；盖上瓶塞，封上铝铂纸；在摇瓶上记录母种日期和接种日期，放入摇床25℃，180r/min培养；
3)栽培培养基制作
木屑培养基：粗木屑45％、细木屑40％、麦麸12％、豆粉1.5％、石膏1％、石灰0.5％，含水量55％，灭菌前调节pH＝7.5～8.0，按配方要求准确称量粗木屑并提前24h进行预湿，准确称量各种原料后细木屑与麦麸进行混匀，豆粉、石灰和石膏进行混匀，两者混匀后再将两者与预湿好的粗木屑混合在一起，加水调节含水量为55％，并将所有原料充分混匀，使用卧式装袋机进行装袋处理，保证每个菌包种1.25kg；将菌袋上方多余菌袋窝入料的预留孔内，插入插棒，预留孔以方便接种，将制作好的菌包放置于常压灭菌锅内，待锅内温度升至100℃后，保持12h，灭菌完成待锅内温度降至60℃以下进行出锅，将菌包摆进接种箱内，并用二氧化氯药剂进行药熏处理，待药味下降，烟雾散尽即可进行接种操作；
4)接种与培养
按照无菌操作规程，将液体菌种按每袋25ml接入栽培袋中，将完成接菌的菌包放置于恒温培养箱。菌包培养的前7天培养室温度保持在25±1℃，7～15天培养室温度降至23±1℃，菌包培养15天后，温度降至20±1℃，菌包进入培养室7天后，每天早8点和晚6点进行两次通风处理，待菌包完成培养即可进行出耳工作，记录早、中、晚培养室内温度及菌丝长满菌袋时间；
5)催芽出耳
将培养好的菌包按照编号进行分类处理，每个编号菌包单独处理，使用前对打孔机进行调节，打孔机上安装18排滚轮且各滚轮间距相等，调节打孔深度为5～8mm，调整好的打孔机表面用75％酒精进行消毒，完成调整和消毒后即可对菌包进行打孔处理，每个菌包打孔234个，将完成打孔的菌包按编号码好，进行催芽工作；
湿度控制在80～85％，即菌包表面始终保持存在一层薄薄的水汽，当温度低于16℃不能进行浇水工作；催芽期间菌包对氧气的消耗量较小，不需要大通风，只需保证上午十点左右进行通风即可；催芽期间最适的温度为20～24℃，催芽期间避免阳光直射，散射光有助于原基的形成。记录空间温湿度及各编号菌包原基形成时间；
待菌袋表面形成原基后，空气湿度始终保持85～90％，减少避免干湿交替的次数；温度控制在20～22℃，避免温度超过24℃，原基分化阶段需要高浓度氧气，加大通风，CO2浓度不得高于3000ppm。当原基分化成1cm大小耳片时，停止浇水48h，待耳片完全干后，再次浇水，耳片展开阶段，当温度高于22℃时停止浇水，当温度处于16～22℃之间时，每次浇水10～20min，以耳片全部湿透为标准，记录早、中、晚空间温度和湿度及各编号菌包耳片展开时间。
6)挑选纯白色黑木耳菌株：通过系统筛选，从1600片白色变异菌株中，获得一个洁白无瑕，温润如玉，耳片圆整，朵型较好的白色黑木耳标本，该标本及其组织分离纯化的菌株命名为“JAUH-W-02”。
实验例3多孢杂交获得“JAUH-W-591”
1)亲本子实体为以上选育的“JAUH-W-02”，保藏于吉林农业大学食用菌教育部工程研究中心；
2)本实验例使用的培养基PDA培养基、液体培养基、木屑培养基同实验例1；
3)孢子收集
将三角瓶底部均匀布满0.5cm×7cm的黑色纸条，然后将三角瓶密封好(防止灭菌过程中水蒸气进入)和滤纸进行灭菌，121℃灭菌30min；将“JAUH-W-02”耳片表面用75％酒精进行消毒，消毒后放入无菌水内浸泡；待耳片浸泡复水后，用灭菌后滤纸吸干耳片表面水分，在三角瓶内进行悬挂；将悬挂好木耳的三角瓶放入24℃的气候箱中(将气候箱玻璃外贴上一层黑白膜，防治透光。一组将气候箱中灯打开，一组完全避光)。观察记录耳片孢子弹射时间及情况，实验重复3次，收集到的孢子条可以即刻使用，其余保藏于冷冻管中；
4)多孢杂交
在无菌环境下用使用注射器吸取10ml无菌水反复抽打几次直至混合均匀，形成孢子悬浮液。悬液接入灭菌后的液体培养基三角瓶中，三角瓶在26℃、150r/min摇床中避光培养，8天后，接种到木屑培养基中；
5)催芽出耳同实验例1，
6)挑选纯白色黑木耳菌株：通过系统筛选，从300袋中，选出129包全部为白色耳片的为研究对象，从14693片白色变异菌株中，选取一个洁白近乎透明，圆边，少褶，肉厚、朵型较好的白色黑木耳，组织分离纯化后，该菌株命名为“JAUH-W-591”；
本发明纯白色黑木耳JAUH-W-591菌株已于2018年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15374，菌株经检验，分类地位为木耳属黑木耳Auricularia heimuer。
实验例4生物学特性实验
本实验例通过对本发明纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591与现有东北地区广泛栽培的黑29JAUH-B-S4以及吉林农业大学选育的白色毛木耳品种玉木耳玉MC6生长速度、分解木屑速度、产量做对比，来说明本发明纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591的优势和特点。
本实验例使用的培养基PDA培养基、液体培养基、木屑培养基同实验例1。
表1生长速度、分解木屑速度
表2产量及泡发率
与同种类别黑木耳品种黑29JAUH-B-S4比较，纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591菌丝生长速度较快，但差异不显著，分解木屑的速度也较黑29快。同样16.5*33的菌袋，装袋高度21cm，装袋重量平均1.25kg，产量为JAUH-W-591平均干重52g/袋，高于黑木耳，但是低于玉木耳，不过JAUH-W-591泡发率却远远高于玉木耳，由此可以看出，JAUH-W-591作为黑木耳的白色变异菌株具有较明显的商品优势和栽培价值。
实验例5 JAUH-W-591农艺性状实验
本实验例将实验例4采收的各个菌株的子实体留样保存，记录干、鲜耳片形态特征，记录入下表(因本实验均采用小孔出耳方式，所以采收的子实体直径均控制在4.5～5.5cm之间，故耳片直径不做记录范围)：
表3农艺性状比较
通过表3可以看出，JAUH-W-591耳片有少量褶皱，耳片边缘波浪状，小孔出耳的耳片形状近圆形，短、近无，色泽洁白，鲜耳片厚度接近玉木耳，通过对其整体比较，JAUH-W-591商品性状最好，表现为单片，小孔出耳圆边，少褶，耳片较厚，颜色洁白。
实验例6拮抗实验
本实验例以本发明纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591和毛木耳、玉木耳菌株玉MC6、黑29JAUH-B-S4为实验材料，所用培养基为PDA培养基。
JAUH-W-591和毛木耳、JAUH-B-S4在平板培养基上分别对峙接种和培养，接种点相距2cm，25℃恒温培养12d。
拮抗实验结果参照表4，在对峙培养菌落交界处的正面和背面，JAUH-W-591与毛木耳拮抗明显，说明JAUH-W-591不是毛木耳；JAUH-W-591与玉MC6拮抗明显，说明JAUH-W-591不是玉木耳；JAUH-W-591与JAUH-B-S4拮抗明显。
表4拮抗实验
实验例7 ITS测序鉴定
在本实验例中，ITS测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称“生工”)进行，包括以下过程：
基因组的提取：按照生工真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。将所得到的DNA溶液置于-20℃，冷藏备用。
PCR扩增及体系建立(25μL)：将检测好的DNA使用ITS1和ITS4为上、下游引物进行种属关系的鉴定，ITS1序列5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4的序列为5’-TCCTCCGGTTATTGATATGC-3’，10×Buffer 2.5μl,MgCl2 2.5μl,dNTP 0.6μl,上游引物(pmol/L)1μl,下游引物(pmol/L)1μl,基因组DNA(μL)5μl,Taq DNA Polymerase(5U/L)0.25μl,ddH2O 14.65μl，PCR程序：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火60℃30s；延伸72℃30s；72℃后延伸10min，扩增得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，其电泳结果，见图10。
本实验菌株JAUH-W-591的ITS序列测序结果见SEQ ID No.1，其序列为573bp的DNA片段，从GenBank中查得，JAUH-W-591菌株ITS序列与木耳属黑木耳的ITS序列相似性最高，并从GenBank中查得与木耳属黑木耳相近种的ITS序列，应用MEGA软件构建出供试菌株的系统发育树，利用系统发育树鉴定供试菌株种属关系，主要分布于两大分支，其中JAUH-W-591和JAUH-B-S4、JAUH-B-01属于黑木耳类群，玉mc6隶属于毛木耳类群，请参阅图11。
实验例8 SRAP分析
本实验例以本发明纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591和JAUH-W-01，玉MC6，JAUH-B-S4为分析对象，利用SRAP分析技术，进一步鉴定本发明纯白色黑木耳菌株的遗传特性。根据优化实验的结果，25μL反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，模板DNA 40ng，Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.3mmol/L，上下游引物各5mmol/L，TaqDNA聚合酶(TaKaRa Biotech,Japan)1.0U，用双蒸水调整体系使终体积为25μL。反应程序如下：94℃预变性3min；反应前5个循环为94℃变性l min，35℃复性l min，72℃延伸l min；随后的35个循环退火温度提高到50℃，最后72℃延伸10min。采用2％的琼脂糖凝胶电泳，60W电泳1.5h后检测，所有DNA样品至少做2次重复。
参阅表5，SRAP分析中，从56个随机引物中筛选出4个引物能清晰的区分出JAUH-W-591和玉MC6,黑木耳菌种JAUH-B-S4，该随机引物是B1(me1和em3)，B2(me3和em3)，B3(me6和em7)，B4(me2和em1)。
表5和表6 SRAP正向引物和反向引物。
表5.SRAP正向引物
表6.SRAP反向引物
SRAP分析的结果如下：
引物B1(me1、em3)对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图12A，本发明玉mc6有特异性DNA条带，JAUH-B-S4、JAUH-W-591和JAUH-B-01均无该条带，所以引物B1(me1、em3)能区别玉MC6与JAUH-W-591和JAUH-B-S4、JAUH-B-01。
引物B2(me3、em3)对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图12B，本发明玉mc6、JAUH-B-S4和JAUH-B-01有特异性DNA条带，所以引物B2(me3、em3)能区别本发明JAUH-W-591和JAUH-B-S4、玉MC6、JAUH-B-01。
引物B3(me6、em7)对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图12C，本发明玉mc6、JAUH-B-S4有特异性DNA条带，JAUH-W-591和JAUH-B-01均无该条带，所以引物B3(me6、em7)能区别玉MC6与JAUH-W-591和JAUH-B-S4、JAUH-B-01。
引物B4(me2、em1)对应的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱为图12D，本发明玉mc6有特异性DNA条带，JAUH-B-S4、JAUH-W-591和JAUH-B-01均无该条带，所以引物B4(me2、em1)能区别玉MC6与JAUH-W-591和JAUH-B-S4、JAUH-B-01。
综述所述，引物B2能区分出JAUH-W-591和JAUH-B-S4、玉MC6，JAUH-W-591是纯白色黑木耳新菌株。
序列表
<110> 李晓
<120> 一种纯白色黑木耳菌株及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 573
<212> DNA
<213> Auricularia heimuer(Auricularia)
<400> 1
gttggctggg atctaggctt cggtcttatt tcggctgtgc gctcaggctg cacgccgata 60
acctctcaca cctgtgcacc ttttcggttg cggtttcggc cgcttccgct tttacatgca 120
accacgaaaa gtctagaatg tgaagaaaac tataaagtaa caactttcaa caacggatct 180
cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa 240
ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctcc ttggtattcc atggagcatg 300
cctgtttgag tgtcacgtaa accctcaccc ctgcgatgta acagtcgcct gcggtggact 360
tggaccgtgc cggtaatcgg ctcgtcttga aatgcattag ctggcgcttt tagagtgctg 420
ggcgaacggt gtgataatta tctgcgccga ctgccctggg cctcttcagc ggcgctgctt 480
acagccgtcc cttgtggaca actattttaa agctttggcc tcaaatcagg taggactacc 540
cgctgaactt aagcatatca aaagccggag gaa 573
Claims (5)
1.一种纯白色黑木耳菌株，其特征在于：纯白色黑木耳菌株JAUH-W-591，Auriculariaheimuer，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.15374，保藏日期2018年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.栽培如权利要求1所述的纯白色黑木耳菌株得到的子实体。
3.如权利要求2所述的纯白色黑木耳子实体在食品中的应用。
4.如权利要求1所述的纯白色黑木耳菌株，其特征在于：分子标记序列如SEQ ID No.1所示。
5.如权利要求1所述纯白黑木耳菌株，其特征在于：特异性引物对的序列如下：5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3'，5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'。
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