CN107211727B - 一种野生苇蘑人工培殖的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种野生苇蘑的人工培殖方法与应用，包括母种纯培养物的分离、母种培养条件、培养料配方优化、菌丝体向原基转化条件的建立、子实体培殖条件、人工培殖获得苇蘑子实体形态学与分子生物学方法特征描述。利用本发明所述的方法可进行野生苇蘑的人工培殖，具有生产成本低、操作简单、原基发生数量多、能够获得子实体等优点。本发明所培殖的苇蘑子实体生长周期为60天左右。本发明为保护湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、开展后期深入研究、实现野生苇蘑的合理有序开发利用提供了有力支持，野生苇蘑人工培殖方法有极高的保护、研究、开发、推广价值，经济、生态效益显著。

Description

一种野生苇蘑人工培殖的方法及应用

技术领域

本发明属于食用菌加工技术领域，涉及一种野生苇蘑的人工培殖方法与应用，更确切的说是一种野生苇蘑人工培殖获得子实体的方法。

背景技术

天津市七里海湿地为国家级湿地自然保护区，位于天津市东北部宁河区，总面积约95平方公里，该湿地内盛产一种野生蕈菌，当地人称之为苇蘑，口感独特、营养丰富，味道鲜美而独特，深受当地人喜欢，因其稀缺，价格昂贵，该蘑菇发生于夏季天气闷热，阴雨连绵之后的在厚积腐殖质中。近些年来，由于七里海生态环境遭到破坏，水源逐渐枯竭，湿地退化，越来越多的湿地被填充用于农业或建设，芦苇面积减少，再加上人为过度采摘以及其生长环境特殊，需在特定的温度，湿度、光照以及土壤等共同环境因素作用下生长，综合以上多种环境、人为因素，最终导致天津七里海湿地野生苇蘑产量和品质逐年降低，据2016年7月当地民间环保人士吕绍生全面跟踪调查统计，该域内野生苇蘑难觅踪影，极有可能面临绝迹的危险，经查阅资料且尚未见人工驯化成功的相关报道，无疑进一步加剧其面临绝迹的局面。因而为保护该域内湿地生态系统物种多样性、拯救和保护濒危野生蕈菌种质资源、实现天津七里海野生苇蘑的可持续合理有序开发利用，本发明在获得野生苇蘑菌株之后，结合形态学特征和分子生物学方法对其进行鉴定以确定其种属，并对其菌丝体培养条件进行优化，建立了人工培殖模式，并成功获得子实体，本发明为保护该域内湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、开展后期的深入研究、实现天津七里海野生苇蘑合理有序开发利用提供了有力支持，天津七里海野生苇蘑的人工培殖模式建立具有极大的开发前景，生态效益、经济效益极其显著。

发明内容

天津七里海野生苇蘑人工培殖模式建立包括菌种的分离、形态学与分子生物学方法鉴定、菌丝体最佳液体培养基、菌丝体适宜温度、pH筛选、培养料配方优化、菌丝体培养条件、菌丝体向原基转化条件的建立、子实体培殖。

本发明通过以下措施实现：

一种野生苇蘑的人工培殖的方法，其特征在于按如下的步骤进行

（1）菌种的分离

将采集到的野生苇蘑新鲜子实体外表用无菌水冲洗干净，然后用75%酒精消毒后晾干，移至超净台内，无菌条件下用镊子于菌柄与菌盖交接部位取绿豆大小组织块，接种于母种培养基平板内，用封口膜将培养皿封口后于29℃恒温培养10天可以获得浅黄色稀疏菌落即为母种纯培养物；苇蘑母种培养基为马铃薯200 g,琼脂20 g，葡萄糖20 g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3 g,维生素B₁10mg，水1000 mL, pH自然；

（2）母种培养条件

菌丝体液体培养基为:蔗糖20 g/L，酵母粉6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，KH₂PO₄ 1g/L，维生素B₁ 0.012 g/L，适宜菌丝生长的pH为5-7；适宜菌丝体生长温度范围19-34℃；优选温度为29℃，恒温、黑暗避光，培养15-20天即可长满75mm平板；

（3）培养料配方：野生苇蘑育菇培养料配方为52%稻草、24%麸皮、24%原土,含水量65%，pH自然；

（4）出菇菌棒发菌：接种后将菌棒于29℃恒温、黑暗避光，湿度60%，培养30-35天即可长满菌袋；

（5）菌丝体向原基转化条件的建立：将长满袋菌丝体于25℃培养12h，然后15℃培养12h，持续温差10℃刺激7-10天，即有原基大量产生；

（6）子实体培殖条件：将具有大量原基的菌袋于25℃恒温条件下，湿度85-90%，1000-1500lx散射光，培殖10-15天即可获得子实体。

本发明所述的人工培殖的方法，其中的人工培殖获得苇蘑子实体形态学特征描述：子实体肉质，柔软，易腐败，菌盖直径大小5-10cm、菌盖浅黄色、菌盖光滑无鳞片、肉质，中央凹陷，成熟后边缘成波浪状、菌褶蜡质边缘尖锐，延生、稀疏分布、有向菌盖变宽的趋势，菌柄位置为中生、中实、无菌环、菌托，成熟后孢子印白色。

人工培殖获得苇蘑子实体分子生物学特征描述：

将人工培殖获得苇蘑子实体对其基因组DNA后提取进行PCR扩增ITS序列片段，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索以获得同源性较高的多个种的ITS序列,再进行相似度比较，根据比对结果鉴定为蜡伞科(Hygrophoropsidaceae)、拟蜡伞属(Hygrophoropsis)的一种蘑菇，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明更进一步公开了野生苇蘑人工培殖的方法在提高人工驯化天津七里海地区苇蘑方面的应用。实验结果显示：采用本发明公开的培殖方法，经过60天左右人工驯化就可以获得天津七里海野生苇蘑子实体，为天津七里海内湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、开展后期的深入研究、实现天津七里海野生苇蘑合理有序开发利用提供了有力支持。

本发明典型的以天津七里海野生苇蘑人工培殖做更加详细的描述：

天津七里海野生苇蘑人工培殖获得子实体经鉴定属于为蜡伞科(Hygrophoropsidaceae)、拟蜡伞属(Hygrophoropsis)的一种蘑菇，其特征在于它是采集于天津七里海湿地野生苇蘑标本经过组织分离获得菌丝纯培养物，其生物学特征菌盖大小约5--8cm，浅黄色、菌盖表面光滑无鳞片，半蜡质或肉质，中央凹陷；菌褶常成蜡质，延生，较为稀疏；孢子印白色，菌种中生，中实，无菌环、菌托，成熟后菌盖上卷，边缘波浪状卷曲。PDA培养基上菌落特征为初期菌丝浅黄色，边缘灰白色，生长缓慢，菌丝稀疏，辐射生长，培养中期有菌核结构出现，菌核密集分布，结构松散，培养后期老化菌丝细胞自溶释放黑色素，24-26℃长满75mm平板时间为25天，25天后菌落全部褐化，转接活力下降，甚至不再萌发。

1、母种纯培养物的分离

采用PDA培养基，无菌条件下于菌柄与菌盖交接部位取绿豆大小组织块，接种于PDA培养基平板内，封口膜将培养皿封口后于25℃恒温培养10天可以获得浅黄色稀疏菌落即为母种纯培养物。

2、天津七里海野生苇蘑人工培殖菌丝体获得子实体形态学及其分子生物学方法鉴定

结合形态学特征菌盖大小约5--8cm，浅黄色、菌盖表面光滑无鳞片，半蜡质或肉质，常常显示出非常鲜明的颜色，中央凹陷；菌褶常成蜡质，延生，稀疏分布；孢子印白色，菌种中生，中实，无菌环、菌托，成熟后菌盖上卷，边缘波浪状。

PDA 培养基上菌落特征为初期菌丝浅黄色，边缘灰白色，生长缓慢，菌丝稀疏，辐射生长，培养中期有菌核结构出现，菌核密集分布，结构松散，培养后期老化菌丝自溶释放黑色素，24-26℃长满75mm平板时间为25天，25天后菌落全部褐化，转接继代菌丝萌发活力下降，甚至不再萌发。

利用ITS序列测序进行鉴定,其测序结果经GenBank核酸序列数据库比对,天津七里海也是苇蘑为真菌界、担子菌门、伞菌纲、伞菌目、蜡伞科、拟蜡伞属的一种蘑菇。

3、菌丝体最佳液体培养基筛选

采用碳源、氮源单因素初筛和四因素（碳源、氮源、无机盐、维生素）三水正交设计相结合的方法，以不同液体培养基对其菌丝体干重作为测量指标，最终得到其菌丝体最佳液体培养基为蔗糖20 g/L，酵母粉6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，维生素B₁0.012 g/L，并在29℃暗培养下，其菌丝体生物量干重可达1.132 g/L。

4 、菌丝体生长适宜温度筛选

马铃薯综合培养基培养，分别采用14℃, 19℃, 24℃, 29℃，34℃一共5个不同温度处理。每个温度处理5次重复，取其平均值。使用平板培养法，接种后第15天，使用卡尺测量菌丝直径，并记录菌丝长势、菌丝颜色以及菌落边缘特征。菌丝体日均生长速度=菌落半径增长长度（mm）/培养天数(d)，结果显示菌丝在29℃时，菌丝长势粗壮、浓密。故菌丝生长的最适温度为29℃。

5、菌丝生长体适宜pH筛选

采用马铃薯综合培养基，灭菌前分别用浓度为1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCL，将PDA培养基的pH值分别调节至3.0，4.0，5.0, 6.0, 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0一共10个不同pH处理,每个处理5个平行重复。测量记录菌丝的生长速度、色泽长势及边缘整齐度，结果显示适宜菌丝生长的pH为6.0。

6、培养料配方优化

一共设计了16种培养料配方，分别以麦粒、麦麸、原土、稻草、棉籽皮为原料进行熟料培植，优化到育菇培养料配方为52%稻草、24%麸皮、24%原土,含水量65%，pH自然。

7、菌丝体培养条件

天津七里海野生苇蘑母种菌丝体培养条件其特征为29℃恒温、黑暗避光，培养15-20天即可长满75mm平板，出菇菌棒菌丝体培养条件其特征为25℃恒温、黑暗避光，湿度60%，培养30-35天即可长满菌袋（规格15×30×0.04mm聚丙烯塑料袋，装料湿重250g）。

8、菌丝体向原基转化条件的建立

天津七里海野生苇蘑原基分化其特征在于将以低温为主的刺激，即将发菌满袋的菌棒于25℃培养12h，15℃培养12h，温差10℃刺激7-10天，即有原基大量产生。

9、子实体培殖

天津七里海野生苇蘑子实体的培殖其特征在于将具有大量原基的菌袋于25℃恒温条件下，湿度85-90%，1000-1500lx散射光，培殖10-15天即可获得子实体。

10、关于本发明所获得的子实体的评价如下：

（1）人工培殖获得苇蘑子实体形态学特征描述

人工培殖获得苇蘑子实体主要特征在于子实体肉质，柔软，易腐败，菌盖直径大小5-10cm、菌盖浅黄色、菌盖光滑无鳞片、肉质，中央凹陷，成熟后边缘成波浪状、菌褶蜡质边缘尖锐，延生、稀疏分布、有向菌盖变宽的趋势，菌柄位置为中生、中实、无菌环、菌托，成熟后孢子印白色；

（2）人工培殖获得苇蘑子实体分子生物学特征描述

将人工培殖获得苇蘑子实体对其基因组DNA后提取进行PCR扩增ITS序列片段，在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索以获得同源性较高的多个种的ITS序列,再进行相似度比较，比对结果显示为鉴定为蜡伞科(Hygrophoropsidaceae)、拟蜡伞属(Hygrophoropsis)的一种蘑菇。具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

（3）人工培殖七里海野生苇蘑子实体的口感: 味道鲜美，颜色。

人工培殖获得苇蘑子实体形态学特征描述：子实体肉质，柔软，易腐败，菌盖直径大小5-10cm、菌盖浅黄色、菌盖光滑无鳞片、肉质，中央凹陷，成熟后边缘成波浪状、菌褶蜡质边缘尖锐，延生、稀疏分布、有向菌盖变宽的趋势，菌柄位置为中生、中实、无菌环、菌托，成熟后孢子印白色。

（4） 七里海野生苇蘑与人工驯化苇蘑子实体形态比较

本发明公开的天津七里海野生苇蘑人工培殖的方法所具有的积极效果在于：

（1）利用本发明所述的方法可进行天津市七里海野生苇蘑的人工培殖，苇蘑子实体生长周期为60天左右。具有生产成本低、操作简单、原基发生数量多、能够获得子实体等优点。

（2）天津七里海野生苇蘑人工培殖模式的建立对于天津七里海特有濒危食用菌苇蘑具有极高的拯救、保护、研究、开发、推广价值。

（3）本发明为保护该域内湿地生态系统物种多样性、拯救濒危野生蕈菌种质资源、开展后期深入研究、实现天津七里海野生苇蘑的合理有序开发利用提供了有力支持，天津七里海野生苇蘑的人工培殖模式建立具有极大的开发前景，生态效益、经济效益极其显著。

附图说明

图1为天津七里海野生苇蘑菌种分离纯培养菌落形态图 ；野生蕈菌菌落生长状况(左上图7天，右上图14天 ，左下图21天，右下图28天)；

图2为野生蕈菌菌丝显微观察图；

图3为人工培殖出菇图及子实体形态结构图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中的野生苇蘑采摘于天津七里海。

实施例1菌种分离

本发明采用组织分离方法获取菌种，选择野生蕈菌色泽正常、未受病虫侵害的部分子实体，将表面杂物清除后，并用75%酒精擦拭，在无菌条件下，将供分离部分子实体纵切一分为二，在菌柄菌盖交界处取绿豆大小组织块，用镊子迅速将组织块接入PDA平板内，于恒温培养箱中29℃，暗培养10-15d备用。

实施例2 形态学、分子生物学鉴定

（1）菌落形态结构观察：每隔一周观察其在平板上的生长情况，同时拍照记录菌丝体的色泽、长势。

（2）插片培养：插片培养，待菌丝爬至盖玻片后，取出制成临时装片，在光学显微镜下观察菌丝结构，类型，分支等情况。

（3）子实体形态学特征观察：菌盖大小、颜色、形状、菌褶、菌柄等特征记录。

3 ITS鉴定流程

（1）实验材料培养

取在平板中生长旺盛的野生苇蘑菌落，于超净台中无菌操作转接配好液体培养基中，于29℃下暗培养，大约15天左右，便可长出菌丝体。

（2）基因组DNA提取试剂

①用玻璃棒挑取适量新鲜的、长势良好菌丝体，用滤纸吸水至按压时滤纸为干后，置于预先放入冰箱冷冻24h的研钵中，快速加入适量的液氮，并用同样预冷的研磨棒充分研磨成粉末状，必要时重复一次；②在粉末低温的状态下将粉末转入2mL的离心管中，并立即加入已预热成液体的600μL SDS裂解液，并快速将离心管放入提前预热的65℃水浴锅中水浴2h，在此期间每隔10min轻轻摇匀一次，充分裂解细胞；③取出离心管，待其晾凉至室温后，用高速冷冻离心机中在4℃、10000 rpm下离心10min，转移上清液至以高温灭菌的4ml离心管中；④加入约相同体积的酚-氯仿-异戊醇（比例为25:24:1），充分混合均匀，在4℃，12000 rpm下离心6min，转移上清液至新管；⑤每管加约2倍体积的无水乙醇，轻轻的摇晃混合均匀，在﹣20℃冷冻室中冷冻30min，然后再以12000 rpm离心6min，上清丢弃，保留沉淀的DNA，并用70%乙醇溶液洗涤沉淀两次，在4℃，8000 rpm下离心6min，保留沉淀；⑥等待其风干后，用移液枪加入600μL TE（pH 8.0）以溶解DNA；⑦加入5μL RNA酶RNase（0.01mg/L），再次以37℃水浴1h，并重复步骤④、⑤一次，即可得到基因组DNA固体；⑧加入100μL TE（pH8.0）以溶解DNA固体沉淀，取出5μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像仪分析照胶，以确定基因组DNA的提取质量及片段大小，样品于﹣20℃冷冻室保存待用。

（3）PCR扩增：

①在PCR管的盖子上写好标号，依次向每个离心管中加入50μl体系，体系的具体成分详见下表：

表1 PCR反应体系

PCR扩增所用的通用引物为ITS1及ITS4，其引物序列为：

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′ SEQ ID NO:2

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′SEQ ID NO:3

②将上述标号的PCR管中液体充分混匀，盖紧盖子，将其放入高速离心机中旋转五秒左右，将管中液体甩至管底，之后将其放入预热超过半小时的PCR仪中，设置程序如下表：

表2 PCR反应程序

③将操作完成的PCR管从PCR仪中取出，放入冰箱中4°C冷藏。

（4）琼脂糖凝胶电泳

表3 DNA提取及PCR电泳检测条件

①按照上表将配置好的TBE储存液稀释至使用液，放入污染区的细口瓶中；②按照上表称取对应质量的琼脂糖，倒入污染区的锥形瓶内，加入配置的相应的TBE电泳缓冲液，此时锥形瓶应轻拿轻放，尽量减少晃动，避免琼脂糖粘到锥形瓶壁上，影响凝胶浓度。用电热炉加热锥形瓶，加热前一定要保持锥形瓶外壁没有水分，以免加热时锥形瓶炸裂，产生危险，将溶解后的琼脂糖自然晾凉到60℃左右。③将梳子和胶板用蒸馏水彻底洗净，将梳子插入到胶板上的凹槽中，向锥形瓶中加入1.5μL溴化乙锭（EB），缓缓地倒入已放置好梳子的胶板中，过程应缓慢而持续以避免气泡产生，若不慎产生气泡，应用移液枪枪头吸出气泡或将气泡赶至胶板的一侧。④静置胶板至液体凝固微微发白呈半透明状，此过程约需要20min。⑤待胶完全凝固后，双手同时用力，轻轻将梳子垂直从交办的凹槽处取出，此过程应小心，注意不要破坏点样孔。⑥戴沥去残留在胶上的液体，将胶板置于装有电泳缓冲液TBE的电泳槽中，注意一定要使凝胶沉入到缓冲液中，使点样孔充满缓冲液并处于阴极。⑦取5μLmarker和提取的DNA，与1μL 的6× Loading Buffer混匀后，按次序加入到凝胶孔中，最后一孔加入ddH₂O最为对照。接通电源，并将电压电流分别调节到120V，50mA进行电泳。⑧将凝胶板扣在紫外荧光检测仪上观察结果。DNA片段由荧光强弱显示DNA含量，而DNA片段的大小则由DNA迁移率反映。

（5）ITS片段测序及序列分析 挑选凝胶条带较好的样品，送往测序公司测序。

实施例3 菌丝体生长适宜温度筛选

PDA综合培养基培养，分别采用14℃, 19℃, 24℃, 29℃，34℃一共5个不同温度处理。每个温度处理5次重复，使用游标卡尺测量菌丝直径，取其平均值，并记录菌丝长势、菌丝颜色以及菌落特征。

1、平板培养基的制作

将培养皿洗净后121℃，0.10～0.12Mpa高压灭菌30min后备用。打开超净台紫外灯，灭菌20min，将融化的PDA培养基倒入培养皿(体积为20ml)，封盖、冷却。

2、接种操作

待PDA培养基凝固进行接种。开启紫外灯灭菌，20min后关闭紫外灯。无菌操作挑取5mm见方菌种块，然后迅速将接种块接到PDA培养基中央。封口膜密封平板于不同温度的温箱中恒温培养20d。

菌丝体日均生长速度=菌落半径增长长度（mm）/培养天数(d)

计算出各处理菌丝体日均生长速度，进一步计算重复间平均数（下同），并利用Excel软件作图。

实施例4 菌丝体生长适宜pH筛选

采用马铃薯综合培养基，灭菌前分别用浓度为1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl，将PDA培养基的pH值分别调节至3.0，4.0，5.0, 6.0, 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0一共10个不同pH值处理,每个处理5个平行重复。测量记录菌丝的生长速度、色泽长势及边缘整齐度。

实施例5 菌丝体液体培养基筛选

1.培养基制作

(1)PDA培养基：马铃薯（浸提液）200g/L，琼脂粉20 g/L，葡萄糖20 g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgS0₄·7H₂O 1.5 g/L，VB₁ 0.01 g/L；

(2)碳源初选培养基：蛋白胨4g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄·7H₂O1.5g、VB₁0.004g，分别以葡萄糖20g、蔗糖20g、麦芽糖20g、可溶性淀粉10g、马铃薯（浸提液）200g为供试碳源，定容至1000ml，pH自然，平均分配于20个100ml三角瓶中，3次重复，0.12Mpa高压灭菌30min，备用。

(3)氮源初选培养基：葡萄糖20g，KH₂PO₄ 3.6g，MgSO₄·7H₂O1.8g，维生素B₁ 0.004g，分别以蛋白胨4 g、酵母粉6.4 g、牛肉膏4.95 g、豆粕（浸提液）1.275 g、(NH₄)₂SO₄ 2.76 g、NH₄NO₃ 1.675 g为供试氮源，定容至1000ml，pH自然，平均分配于20个100ml三角瓶中3次重复,0.12Mpa灭菌30min，备用。

PDA培养基（以1L为例）制作步骤如下：

马铃薯洗净去皮，称取200g，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，VB₁ 10mg，琼脂粉20g。将马铃薯切成1厘米见方小块，放于1.2L的水中至沸腾15min后，用四层纱布过滤，取上清液。当琼脂粉熔化后向其中加入葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、VB₁。平均分配于5个250ml三角瓶中，0.12Mpa,121℃灭菌30min。将灭菌完的培养基与平板一同放入已用酒精擦拭消毒的洁净工作台内，打开紫外灯，计时20min，无菌操作向平板内倒入培养基冷凝后备用。

2碳源、氮源初步筛选

从活化备用的菌种挑取直径约为0.8cm大小的菌种块，接种于碳源氮源初选培养基上，每瓶3块，29℃恒温、暗培养20d后，将滤纸编号、称重，再将培养产物进行真空泵抽滤，将抽滤完的滤纸连同其上的菌丝体一并置于干燥箱中，95℃烘干至滤纸恒重，再次称重滤纸并记录重量数据，计算出菌丝体干重。

3液体培养基正交设计

根据上述菌丝体干重结果，从中选取两个菌丝体生物量较高的碳源和氮源，以及不同浓度梯度的无机盐和VB₁，设计L₉（3⁴）四因素、三水平正交试验共有9个试验配方，每个试验配方3个重复，同上述方法接种、称重，并计算出菌丝体的干重，得到理论上的最优组合，验证得到的最佳碳氮源组合及含量配比。

表4正交试验因素和水平

注：无机盐由MgSO₄·7H₂O和KH₂PO₄组成

实施例6 人工培殖模式中培养料配方优化及其配置过程

此次培殖试验一共设计了16种培养料配方，以麦粒、麦麸、原土、稻草、棉籽皮为原料，熟料培植，16种配方如下，每个配方10个重复，121℃灭菌2h。将菌种袋放入超净工作台，接种量为每平板接3袋。

（1）麦粒类培养基: ①100%麦粒；②95%麦粒+5%石膏；③95%麦粒+5%原土；

（2）麸皮类培养基：④100%麸皮，含水量50%；⑤90%麸皮+10%原土，含水量50%；

(3)稻草类培养基：⑥66%稻草+34%麸皮，含水量71%；⑦52%稻草+24%麸皮+24%原土,含水量65%；⑧52%稻草+24%麦粒+24%原土，含水量65%；

（4）棉籽皮类培养基：⑨90%棉籽皮+10%麸皮，含水量65%；⑩80%棉籽皮+10%麸皮+10%原土，含水量65%；⑪80%棉籽皮+10%麦粒+10%原土，含水量65%。

（5）原土类培养基：⑫90%原土+10%麦粒，含水量23%；⑬90%原土+10%麸皮，含水量33%；⑭80%原土+10%麸皮+10%麦粒，含水量28%；

（6）混合类培养基：⑮25%稻草+25%棉籽皮+25%麸皮+25%原土，含水量65%；⑯25%稻草+25%棉籽皮+25%麦粒+25%原土，含水量均为40%。

接种完毕于29℃温箱中恒温培养。观察并记录菌袋初期、中期、末期菌丝生长情况。

实施例7 菌丝体培养及其原基诱导分化

天津七里海野生苇蘑母种菌丝体培养条件特征为29℃恒温、黑暗避光，培养15天即可长满75mm平板，出菇菌棒菌丝体培养条件其特征为25℃恒温、黑暗避光，空间湿度60%，培养30-35天即可长满菌袋（规格15×30×0.04mm聚丙烯塑料袋，装料湿重250g）。

天津七里海野生苇蘑原基分化其特征在于将满袋的菌丝体25℃培养12h，15℃培养12h，持续温差10℃刺激7-10天，即有原基大量产生。

实施例8子实体培殖

天津七里海野生苇蘑子实体的培殖其特征在于将具有大量原基的菌袋于25℃恒温条件下，湿度85-90%（优选85%），1000-1500lx散射光（优选1500lx），培殖10-15天（优选15天）即可获得子实体。附苇蘑ITS序列长度785base，测试报告由上海生工技术有限公司提供。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种野生苇蘑人工培殖的方法及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 785

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgaattctt tttgagaggg ggaaagggag 60

gagcagactg ttgctggctt tttttttcga cgacggtgac gctggataac ggccgaaccg 120

ttgtgagaat gtataggcat cgtgcacgtt tgtgactttt ttttcttctg atcaatagct 180

ttctccaacc cacacctgtg cactcgttgt aggctctttg aaaaaaaagg cctatgtttt 240

tctacacaca cccaatcgta tgtctataga atgtcttttt ttacgattac tgagcgcttc 300

ttcgagaaga tggtcagtaa gtaaagttta ttacaacttt cagcaatgga tctcttggct 360

ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaatcgc gatacgtaat gtgaattgca gattttcagt 420

gaatcatcga atctttgaac gcaccttgcg ctccttggta ttccgaggag catgcctgtt 480

tgagtgtcat taaattctca actccctttg attttgctat cgaggggggc ttggacagtg 540

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gaaccttttg acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg 780

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<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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Claims (3)

1.一种野生苇蘑人工培殖的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）母种纯培养物的分离

将采集到的野生苇蘑新鲜子实体外表用无菌水冲洗干净，然后用75%酒精消毒后晾干，移至超净台内，无菌条件下用镊子于菌柄与菌盖交接部位取绿豆大小组织块，接种于母种培养基平板内，用封口膜将培养皿封口后于29℃恒温培养10天可以获得浅黄色稀疏菌落即为母种纯培养物；

（2）苇蘑母种纯培养物及其菌丝体液体培养条件

将母种纯培养物无菌条件下接种于苇蘑母种培养基中，苇蘑母种培养基为:马铃薯200g,琼脂20 g，葡萄糖20 g，硫酸镁1.5 g，磷酸二氢钾3 g,维生素B₁10mg，水1000 mL, pH自然；将长满平板的苇蘑母种纯培养物无菌条件下转接于苇蘑菌丝体液体培养基上，菌丝体液体培养基为:蔗糖20 g/L，酵母粉6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，维生素B₁0.012 g/L，适宜菌丝生长的pH为5-7；适宜菌丝体生长温度范围19-34℃；恒温、黑暗避光，培养15-20天即可长满75mm平板；

（3）培养料配方：将长满平板的苇蘑母种纯培养物无菌条件下接种于野生苇蘑育菇培养料菌袋中，野生苇蘑育菇培养料配方为52%稻草、24%麸皮、24%原土,含水量65%，pH自然；

（4）出菇菌棒发菌：将接种完苇蘑母种纯培养物菌袋于29℃恒温、黑暗避光，湿度60%，培养30-35天即可长满菌袋；

（5）菌丝体向原基转化条件的建立：将长满袋菌丝体于25℃培养12h，然后15℃培养12h，持续温差10℃刺激7-10天，即有原基大量产生；

（6）子实体培殖条件：将已经原基转化并具有大量原基的菌袋于25℃恒温条件下，湿度85-90%，1000-1500lx散射光，培殖10-15天即可获得子实体；其中所述的适宜菌丝体生长温度为29℃，恒温、黑暗避光，培养15-20天；所述的人工培殖获得苇蘑子实体形态学特征描述：子实体肉质，柔软，易腐败，菌盖直径大小5-10cm、菌盖浅黄色、菌盖光滑无鳞片、肉质，中央凹陷，成熟后边缘成波浪状卷曲、菌褶蜡质边缘尖锐，延生、稀疏分布、有向菌盖变宽的趋势，菌柄位置为中生、中实、无菌环、菌托，成熟后孢子印白色。

2.权利要求1所述人工培殖的方法，其中所述的人工培殖获得苇蘑子实体，具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。

3.采用权利要求1所述野生苇蘑人工培殖方法在提高人工驯化天津七里海地区苇蘑方面的应用。