CN106635822B - 一种榆黄蘑菌株及其杂交育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种榆黄蘑菌株及其杂交育种方法，所述榆黄蘑菌株为Pleurotus citrinopileatus 2‑2榆黄蘑2‑2，该菌株的保藏号为CCTCC NO:M 2016384，该菌株多糖含量达0.262g/g，菌株发菌速度快于亲本菌株，仅为11d；原基期出现也早于亲本，从接种到原基出现13d；第一潮菇菇峰期同样比亲本早，为24d，具有早熟性，其子实体菌盖直径介于双亲之间，平均为3.21cm，比亲本大0.41cm(云南昆明)、小0.79cm(北京密云)；菌盖厚度平均为0.43cm，菌柄长度与亲本(北京密云)类似，平均为6.9cm。杂交菌株Pleurotus citrinopileatus 2‑2的单菇鲜重在178‑225g之间，形态较饱满，色泽鲜黄，气味芳香浓郁，具有较高的推广价值。

Description

一种榆黄蘑菌株及其杂交育种方法

技术领域

本发明涉及一种榆黄蘑菌株，属于微生物技术领域。本发明还涉及上述榆黄蘑菌株杂交育种的方法。

背景技术

榆黄蘑味道鲜美、营养价值高，同时具有降脂、保肝、抗癌等下作用，但目前商业化栽培规模较小，主要原因是菌株的生产性状不稳定。

榆黄蘑含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素，具有很高的营养价值；蛋白质含量在菌蕾阶段最高。其属于中温型真菌，不耐高温；在生长阶段不需要光线，对氧要求不高，但需要通风(Ghosh N,1991.Ann Appl Bio,118(3):527-532)。榆黄蘑子实体呈浅黄或金黄色，菌盖为喇叭状，表面光滑，边缘平展呈波浪状；多数子实体合生在一起，菌盖层叠簇生，艳丽美观(图力古尔等,2001.中国食用菌,5(20):8-9)。

榆黄蘑的人工栽培最早开始于20世纪70年代，当时王柏松等人用菇木菌丝分离的方法获得了长白山野生榆黄蘑菌种，并对其生物学热性进行了研究(张晓倩等,2012.河北农业大学,1-2.)。近年来，报道研究主要集中在提高榆黄蘑产量的栽培技术和因地制宜、选择原料降低成本的方法；如有研究报道，在常规配方中加入30-50％的工厂化金针菇菌渣，不会对榆黄蘑产量造成很大影响，但却能够降低成本(韩建东等,2014.山东农业大学,46(3):117-119)。但这些研究对于推广榆黄蘑人工种植、提高其产量作用甚微，菌种生长性状的优异及稳定性才是其核心关键内容。

传统的菌种选育方法有诱变育种、杂交育种和基因工厂育种。其中杂交育种是目前食用菌新品种选育中使用最广泛、收效最明显的育种手段。食用菌杂交育种包括单孢杂交、双单杂交和多孢杂交三种方法。单孢杂交过程包括单孢收集、单核亲本交配及筛选(镜检锁状联合，结实性验证、生产性能比较)。杂交育种的目的在于使双亲的优势性状集中在一起或克服某一亲本的劣势，因 此该方法具有定向性。

自日本千原1970年报道，从香菇中分离出一种抗肿瘤多糖而轰动整个医药界后，全世界掀起了一股将食用菌多糖研究相结合，共食用菌中寻找抗新兴药物资源的热潮。榆黄蘑多糖也具有抗肿瘤活性，可将其开发为新型的抗肿瘤药物。然而，现有的榆黄蘑胞外多糖含量较低，不适合规模化提取。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有优良生长性状的榆黄蘑菌株，本发明还提供上述榆黄蘑菌株杂交育种的方法，通过单核杂交育种方法，可得到生长性能优异，遗传稳定性好的杂交子菌株，该菌株多糖含量高于现有的野生型菌株。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

一种榆黄蘑菌株，其特征在于所述榆黄蘑菌株为Pleurotus citrinopileatus 2-2榆黄蘑2-2，该菌株的保藏号为CCTCC NO:M 2016384。

上述菌株Pleurotus citrinopileatus 2-2，榆黄蘑2-2的保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期：2016年7月11日；保藏号：CCTCC NO:M 2016384。

上述榆黄蘑菌株杂交育种方法：

(1)孢子收集：取发育健壮、无病虫害、尚未开伞的供试菌株的子实体，用酒精棉擦拭其表面，然后用无菌水进行冲洗数次后置于超净工作台吹干待用；用灭过菌的解剖刀切取带菌褶的子实体块，大小为2×2cm；用无菌铁钩的一端勾住子实体块，钩子另一端挂在装有10mL无菌水与3颗玻璃珠的三角瓶的瓶口，使子实体正好悬挂于三角瓶中，菌褶面朝下；用无菌棉塞封住瓶口，在25℃恒温培养箱中放置24h，制得孢子悬浮液。

(2)单孢分离：逐级稀释孢子悬浮液，稀释至400倍显微镜视野中含1～3个孢子，此时浓度为最佳稀释浓度；移取0.5mL最佳稀释浓度孢子悬浮液至固体培养基上，涂布，在25℃下，倒置遮光培养4-5d；所述固体培养基中含有质量百分比为20％的马铃薯，2％的葡萄糖和1.8％的琼脂，固体培养基为自然pH值。

(3)单核菌丝鉴定：当菌落长至直径为3-4cm时，挑取边缘菌丝，制水 片，置于高倍显微镜下观察，若无锁状联合，即可认为是单核菌丝。

(4)杂交配对：用直径为0.5cm的金属打孔器将两个亲本单核菌丝接种到同一平板培养基上，两者相距2cm，于25℃恒温培养箱培养；单核菌株配对采用全排列组合，两两配对。

(5)杂交菌株的鉴定：通过镜检锁状联合和拮抗实验筛选得到杂交菌株。

(6)杂交后代菌株的筛选：采用平板菌丝生长速度检测、摇瓶液体发酵培养、菌丝胞内多糖含量检测及对绿霉抗性的实验，筛选得到性状较优的杂交后代。

榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2(CCTCC NO:M 2016384)的平板菌丝生长特征：菌丝长势强，菌丝浓密，菌丝颜色洁白，菌落边缘整齐；这些特征均优于两亲本。

榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2(CCTCC NO:M 2016384)的液体培养特征：生成的菌丝球大小均匀，个体较小，菌丝球密度高；因此，生物量显著高于亲本(2.580g/100mL)，且菌丝多糖含量也较高，分别比亲本高159.41％、201.15％；具有结实性。

榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2(CCTCC NO:M 2016384)的栽培应用：

对Pleurotus citrinopileatus 2-2(CCTCC NO:M 2016384)栽培时，可采用现有的传统栽培方式。其袋栽培养特征：发菌速度快于亲本菌株；原基期出现也早于亲本；第一潮菇菇峰期同样比亲本早，具有早熟性。

榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2(CCTCC NO:M 2016384)的子实体菌盖直径介于双亲之间，比(云南昆明)亲本大、比(北京密云)亲本小；菌盖厚度、菌柄长度与亲本(北京密云)类似。杂交菌株Pleurotus citrinopileatus2-2的单菇形态较饱满，色泽鲜黄，气味芳香浓郁，具有较高的推广价值。

附图说明

图1为两供试菌株(亲本)拮抗实验结果。

图2为苯酚硫酸法葡萄糖标准曲线。

图3为酯酶同工酶电泳图谱。

具体实施方式

实施例1

(1)采集云南昆明和北京密云两主产地的榆黄蘑作为出发菌株，两亲本菌株均可从公开的商业途径购买获得。两亲本菌株生长性状的比较。本实验说明两亲本(供试菌株)的生长特性检测方法，并利用此实验结果作为杂交育种的选育基础。

供试菌株拮抗情况：将供试菌株接种用直径为0.5cm的金属打孔器接种于固体培养基上，两菌块相距4cm，做3组平行，置于25℃恒温培养箱中培养，观察拮抗情况，如图1。

上述固体培养基包括质量百分比为20％的马铃薯、2％的葡萄糖、0.5％的酵母膏和1.8％的琼脂，自然pH值。

(2)单核杂交

1)孢子收集

取发育健壮、无病虫害、尚未开伞的供试菌株的子实体，用酒精棉擦拭其表面，然用无菌水进行冲洗数次后置于超净工作台吹干待用。用灭过菌的解剖刀切取带菌褶的子实体块，大小为2×2cm；用无菌铁钩的一端勾住子实体块，钩子另一端挂在装有10mL无菌水与3颗玻璃珠的三角瓶的瓶口，使子实体正好悬挂于三角瓶中，菌褶面朝下。用无菌棉塞封住瓶口，在25℃恒温培养箱中放置24h，制得孢子悬浮液。

2)单孢分离

逐级稀释孢子悬浮液，稀释至400倍显微镜视野中含1～3个左右的孢子，此时浓度为最佳稀释浓度。移取0.5mL最佳稀释浓度孢子悬浮液至固体培养基上，涂布，在25℃下，倒置遮光培养4～5d。上述固体培养基含有质量百分比为20％的马铃薯、2％的葡萄糖和1.8％的琼脂，自然pH值。

3)单核菌丝鉴定

当菌落长至直径为3～4cm时，挑取边缘菌丝，制水片，置于高倍显微镜下观察。若无锁状联合，即可认为是单核菌丝。

4)杂交配对

用直径为0.5cm的金属打孔器将两个亲本单核菌丝接种到同一平板培养基上，两者相距2cm，于25℃恒温培养箱培养。单核菌株配对采用全排列组合，两两配对。通过反复多次的杂交、初筛和复筛操作，得到生产性状优良的杂交菌株，将其命名为Pleurotuscitrinopileatus 2-2，上述菌株Pleurotus citrinopileatus 2-2(榆黄蘑2-2)于2016年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M 2016384。

(3)杂交菌株的特性研究

1)酯酶同工酶分析

a.样品制备

发酵液经过滤得到菌丝球，称取2.5g菌丝球，加2.5g石英砂，1mL样品提取液，于研钵冰浴研磨。研磨液用1.5mL离心管收集，在4℃下，10000rpm(转/分钟)离心10min，取上清。将上清液、蔗糖溶液、溴酚蓝溶液按体积比为8:3:1的比例混合，此即为电泳样品，4℃冰箱保存。

b.凝胶制备：分离胶浓度为10％；浓缩胶浓度为5％。

c.加样：用移液枪吸取20μL样品于点样孔中。

d.电泳：在220V下稳压电泳，直至溴酚蓝指示带到达胶板底部，停止电泳。

e.染色：将取出的凝胶浸没于染色液中，37℃染色15-30min，蒸馏水冲洗数次后置于乙酸溶液中固定。

按照上述方法观察两个亲本菌株和杂交后获得的榆黄蘑Pleurotuscitrinopileatus 2-2菌株的酯酶同工酶电泳图谱如图3所示。其中，Y：亲本，云南昆明；B：亲本，北京密云；2-2为杂交后获得的榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2菌株。

在亲本以及杂交后代菌株酯酶同工酶谱中共检测到10条相对迁移率不同的酶带，其中有3条酶带酶带颜色很深，有3条酶带酶带颜色较深，其余酶带颜色较浅，具体分析见表2，结果表明2-2菌株与亲本的遗传差异较大。

表1酯酶同工酶谱带相对迁移率

2)基因提取测序

取榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2的基因组为模版，以下列核苷酸序列为引物扩增：

引物F(ITS1):TCCGTAGGTGAACCTGCGG

引物R(ITS4):TCCTCCGCTTATTGATATGC

PCR反应条件：98℃预变性30s，一个循环；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，三十个循环；72℃延伸5min。

回收PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳检测后送交测序，比对测序结果。

测序结果如下：

TTTTTGAGCTGATGCTGGCCCTTAGGGGCATGTGCACGCTTCATTAGTCCCCTTTCACAC

CCCTGTGCACCTTTGATAGATTCGCTGGAAAGACGGTCGCCTCACGGTGACTTGAACTCC

GGTGGGTCTATAACCATTACACACACAAACGTATGTCTACGAATGTCATTTATATGGGCC

ATGCTGCCTATAAAAACCTAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGA

TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA

TCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATT

AAATTCTCAAACCTACCTTTTGCTTTGCTGTAAATCGTAATGTTTGGATTGTTGGGGGTT

GCTGGCTTGTCACCGAGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCGGGACTTTGTTGTTGCCTC

TGCTACATGGTGTGATAATTATCTACGCCAGACCGTACGCAATGATACTTATTGGAGTCC

AGCTCTCTAATCGTCTTCGGACAGCTTTTGACCATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTAC

CCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAAACGGAGGA

实施例2

(1)菌株菌丝生长情况：用直径为0.5cm的金属打孔器将活化后的榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2菌株固体培养基的中心位置，于25℃恒温培养箱中培养。采用十字划线测量法，每天测量并记录菌落半径，观察菌丝形态、色泽及长势；待菌丝长满平皿时，结束培养。计算菌丝生长速度，计算公式为：

菌丝生长速度(mm/d)＝菌落半径(mm)/生长天数(d)

(2)菌株液体培养情况：用接种铲切取0.5×0.5cm大小的上述获得的菌株菌丝块，尽量少带培养基，使菌丝块接种后能浮在液体培养基表面，每瓶接种3块，装液量为50/250mL。在25℃下，150rpm(转/分钟)振荡培养7d(天) 后作为种子液，以10％的接种量移至新鲜液体培养基中，相同条件下培养7d，结束后测量生物量及菌丝多糖量。

上述液体培养基包括质量百分比为0.5％的玉米粉、0.5％的豆饼粉、2.5％的葡萄糖、0.3％的酵母膏、0.1％的磷酸二氢钾和0.1％的硫酸镁，其余为水，自然pH值。

a.生物量测定方法：事先将纱布烘干至恒重，用电子天平准确称重，记为m(g)，将50mL培养液用纱布过滤，于60℃烘箱烘干至恒重，天平称重，记M(g)，计算生物量，生物量计算公式：

生物量(g/mL)＝(M-g)/50

b.菌丝多糖提取：液体培养收集菌丝球，过滤洗涤，于60℃烘箱烘干至恒重，研磨，取1g菌丝球干粉，置于250mL锥形瓶(料液比1:40水)，超声波处理10min后水浴提取多糖，提取温度70℃，提取时间4h，离心(8000r/min,10min)，取上清，加乙醇使其终浓度为75％、4℃条件下静止24h，离心(8000r/min，10min)，沉淀物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥获得多糖粗品。将多糖粗品溶于水后，加入1/4多糖粗品溶液体积的Sevag试剂(V_氯仿:V_正丁醇＝5:2)，震荡20min后，静置30min，离心去除蛋白沉淀。

c.菌丝多糖浓度检测：准确称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，加水定容至100mL，制得葡萄糖标准溶液。分别吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖标准液，置于15mL具塞试管中，加蒸馏水至2mL，加6％苯酚1mL，摇匀，加入5mL浓硫酸，摇匀，静置5min，置沸水浴中加热15min，迅速冷却至室温，于490nm处测吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，作标准曲线，如图2所示。取待测试样2mL到15mL具塞试管中，同样操作，测490nm的吸光值，对照标准曲线，计算试样中的多糖含量。两亲本菌丝 生物量及胞内多糖含量如表2。菌株2-2的生物量高于亲本，分别比亲本高出159.41％、201.15％。

表2 菌丝生物量及胞内多糖含量

编号	生物量(10<sup>-2</sup>g/mL)	胞内多糖含量(g/g)
			Y	2.541	0.101
B	2.450	0.087
			2-2	2.580	0.262

其中，Y：亲本，云南昆明；B：亲本，北京密云；2-2：榆黄蘑Pleurotuscitrinopileatus 2-2，下同。

(3)绿霉抗性实验：将杂交菌株接种到平板上，4d后接入绿霉菌株，与菌种块之间相距3.5cm，在25℃培养，每天观察记录菌株与绿霉的拮抗情况，测量拮抗线宽度。不同菌株拮抗线宽度如表3所示。实验结果表明，杂交菌株2-2对绿霉抗性较佳。

表3 不同菌株拮抗线宽度

菌株	拮抗线宽度/cm
		2-2	2.64
Y	2.31
		B	1.89

(4)袋栽菌丝培养：栽培种采用17×32×0.05cm聚丙烯袋，每袋300g干料(含有棉籽壳78％(质量百分比，下同)、麸皮20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量60％)，松紧度上下一致，高压灭菌2h，冷却至室温时接种，接种量4％，24℃恒温黑暗培养。结果见表4。

表4 不同菌株袋栽菌丝生长特征

编号	日均生长度(mm/d)	长势	色泽
				2-2	7.5	+++	洁白
Y	7.5	++	白
				B	7.2	+	洁白

由表4看出，榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2菌丝长势强，菌丝浓密，菌丝颜色洁白，菌落边缘整齐，这些特征均优于两亲本。

(5)袋栽出菇培养：采用生料栽培方式，用19×52×0.02cm聚丙烯袋，每袋800g干料(棉仔壳88％，麸皮10％，蔗糖1％，石膏1％，含水量60％)，接种量10％。装袋时先在底部装入一层菌种封料面，一共四层菌种三层料。25℃培养，长满袋后放入菇房，摆放在菇架上出菇，出菇室温度控制在20℃，空气相对湿度在85-95％。如表5所示，杂交菌株2-2发菌速度快于亲本菌株，仅为11d；原基期出现也早于亲本，从接种到原基出现13d；第一潮菇菇峰期同样比亲本早，为24d，具有早熟性。

表5 不同菌株袋栽培养特征

不同菌株的子实体形态特征如表6所示。

表6 不同菌株的子实体形态特征

菌株	菌盖直径(cm)	菌盖厚度(cm)	菌柄长度(cm)	单菇鲜重(g)
					2-2	3.2	0.44	6.8	220
Y	2.8	0.44	4.4	190
					B	4	0.34	7.1	230

榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2(CCTCC NO:M 2016384)的子实体形态较饱满，出菇整齐，原基发生量大，色泽鲜黄，中等偏大，边缘一直圆整，气味芳香浓郁。

实施例3

将榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2菌株在固体培养基上培养，至长满培养皿后，取尖端菌丝进行传代培养；重复培养操作5次，获得第5代菌株。之后操作与实施例1方法相同。

菌丝生物量及胞内多糖含量如表7。

表7 菌丝生物量及胞内多糖含量

编号	生物量(10<sup>-2</sup>g/mL)	胞内多糖含量(g/g)
			Y	2.541	0.101
B	2.450	0.087
			2-2	2.579	0.261

不同菌株拮抗线宽度如表8所示。

表8 不同菌株拮抗线宽度

菌株	拮抗线宽度/cm
		2-2	2.63
Y	2.31
		B	1.89

实验结果表明，杂交菌株2-2对绿霉抗性较佳。

袋栽菌丝培养结果见表9。

表9 不同菌株袋栽菌丝生长特征

编号	日均生长度(mm/d)	长势	色泽
				2-2	7.5	+++	洁白
Y	7.5	++	白
				B	7.2	+	洁白

由表9看出，榆黄蘑Pleurotus citrinopileatus 2-2菌丝长势强，菌丝浓密，菌丝颜色洁白，菌落边缘整齐，这些特征均优于两亲本。

袋栽出菇培养结构如表10。

表10 不同菌株袋栽培养特征

不同菌株的子实体形态特征如表11所示。

表11 不同菌株的子实体形态特征

菌株	菌盖直径(cm)	菌盖厚度(cm)	菌柄长度(cm)	单菇鲜重(g)
					2-2	3.22	0.43	6.7	222
Y	2.8	0.44	4.4	190
					B	4	0.34	7.1	230

实施例4

用接种铲切取0.5×0.5cm大小的菌株Pleurotus citrinopileatus 2-2菌丝块，尽量少带培养基，使菌丝块接种后能浮在液体培养基表面，每瓶接种3块， 装液量为50/250mL。在25℃下，150rpm(转/分钟)振荡培养7d(天)后作为种子液，以6％的接种量移至气升式发酵罐，发酵罐装有事先灭过菌的新鲜培养基。发酵温度为25℃，罐压0.03MPa,调整空气流量是通气压力为0.15MPa。培养10d(天)后，测其菌丝生物量及胞内多糖含量如表12。

上述液体培养基包括质量百分比为0.5％的玉米粉、0.5％的豆饼粉、2.5％的葡萄糖、0.3％的酵母膏、0.1％的磷酸二氢钾和0.1％的硫酸镁，其余为水，自然pH值。

表12 Pleurotus citrinopileatus 2-2菌丝生物量及胞内多糖含量

传代数	生物量(10<sup>-2</sup>g/mL)	胞内多糖含量(g/g)
			1	2.575	0.271
2	2.582	0.273
			3	2.585	0.277
4	2.584	0.273
			5	2.585	0.275

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。。

Claims (2)

1.一种榆黄蘑菌株，其特征在于所述榆黄蘑菌株为榆黄蘑（Pleurotus citrinopileatus）2-2，该菌株的保藏号为CCTCC NO:M 2016384。

2.根据权利要求1所述的榆黄蘑菌株，其特征在于：其子实体平均菌盖直径为3.21 cm，平均菌盖厚度为0.43 cm，平均菌柄长度为6.9 cm，子实体单菇鲜重在178～225g之间。