CN104893978B - 一株雨生红球藻enn71及其培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株雨生红球藻ENN71及其培养方法与应用。所述雨生红球藻ENN71生长周期短，天然虾青素的含量高，遗传性能稳定。本发明实施例提供一株雨生红球藻ENN71，为Haematococcus pluvialis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5147，保藏日期为2011年8月17日。

Description

一株雨生红球藻ENN71及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株雨生红球藻ENN71及其培养方法与应用。

背景技术

虾青素是类胡萝卜素的一种，为世界上最强的抗氧化剂，能够有效清除细胞内的自由基，减少衰老细胞的堆积，具有抗衰老、缓解运动疲劳、增强免疫力、抑制肿瘤的作用。虾青素分为天然虾青素与人工合成虾青素两种，然而，天然虾青素的稳定性、生物安全性及吸收效果均优于人工虾青素，而雨生红球藻中的虾青素含量可以达到1.5-3％，被看做是天然虾青素的“浓缩品”，鉴于虾青素显著的生理功能，已被广泛应用于医疗保健、美容护肤等行业。

作为天然虾青素“浓缩品”的雨生红球藻具有两个生长阶段：绿色游动细胞与红色不动孢子阶段，所述红色不动孢子阶段即为虾青素积累的阶段。在生产虾青素时，由于雨生红球藻的生长速度缓慢、积累虾青素周期长，难以满足市场对虾青素的需求，如果能够诱变虾青素的含量较高的雨生红球藻株，缩短虾青素的积累周期，对天然虾青素的增产具非常重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一株雨生红球藻ENN71及其培养方法与应用，所述雨生红球藻ENN71生长周期短，天然虾青素的含量高，遗传性能稳定。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供一株雨生红球藻ENN71，为Haematococcus pluvialis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No.5147，保藏日期为2011年8月17日。

本发明所获得的雨生红球藻ENN71具有生长周期短，天然虾青素的含量高，性能稳定，环境适应性强的特点。

其中，所述雨生红球藻ENN71虾青素含量为所述雨生红球藻野生株的2倍以上。

另一方面，本发明实施例提供一种所述雨生红球藻ENN71的培养方法，包括：将ENN71藻细胞接种在BG11培养基中培养，期间，光照强度为50-300μmol/m²·s，培养温度为20-30℃，pH为6.5-9。

另一方面，本发明实施例提供一种所述雨生红球藻ENN71的虾青素诱导方法，包括：将处在不动孢子阶段的ENN71藻种接种在缺氮的BG11培养基中培养3天以上，期间，光照强度为200μmol/m2·s以上，培养温度为20-35℃，pH为6.5-9。

另一方面，本发明实施例还提供一种所述雨生红球藻ENN71在获取用于诱导虾青素的藻种中的应用。

其中，在相同的培养条件下，所述雨生红球藻ENN71生长速度比雨生红球藻野生株提高40％以上。

另一方面，本发明实施例还提供一种所述雨生红球藻ENN71在虾青素诱导中的应用。

其中，对处在不动孢子阶段的雨生红球藻进行虾青素诱导培养3天以上，所述雨生红球藻ENN71的虾青素含量为所述雨生红球藻野生株的2倍以上。

再一方面，本发明实施例还提供一种所述雨生红球藻ENN71在继代培养中的应用。

其中，将继代培养1年以上的所述雨生红球藻ENN71与雨生红球藻野生株在相同的培养条件下培养，所述雨生红球藻ENN71生长速度比雨生红球藻野生株提高40％以上，对处在不动孢子阶段的雨生红球藻进行虾青素诱导3天以上，所述雨生红球藻ENN71的虾青素含量为所述雨生红球藻野生株的2倍以上。

由此可见，本发明实施例提供的一株雨生红球藻ENN71及其培养方法与应用，所获得的雨生红球藻ENN71具有生长周期短，天然虾青素的含量高，遗传性能稳定的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一株雨生红球藻ENN71与野生株ENN wt的生长速度曲线对比图；

图2为本发明实施例提供的一株雨生红球藻ENN71与野生株ENN wt培养第12天对比图；

图3为本发明实施例提供的另一株雨生红球藻ENN71与野生株ENN wt培养第12天对比图；

图4为本发明实施例提供的一株雨生红球藻ENN71继代培养1年后与野生株ENN wt的生长速度曲线对比图；

图5为本发明实施例提供的另一株雨生红球藻ENN71继代培养2年后与野生株ENNwt培养第12天对比图；

图6为本发明实施例提供的再一株雨生红球藻ENN71继代培养3年后与野生株ENNwt培养第12天对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

一方面，本发明实施例提供一株雨生红球藻ENN71，为Haematococcus pluvialis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No.5147，保藏日期为2011年8月17日。

其中，所述雨生红球藻ENN71也可以称为雨生红球藻突变株ENN71。

本发明所获得的雨生红球藻突变株ENN71具有生长周期短，天然虾青素的含量高，性能稳定，环境适应性强的特点。

其中，所述雨生红球藻突变株ENN71虾青素含量为所述雨生红球藻野生株的2倍以上。

另一方面，本发明实施例提供一种所述雨生红球藻突变株ENN71的培养方法，包括：将ENN71藻细胞接种在BG11培养基中培养2-7天，期间，光照强度为50-300μmol/m²·s，培养温度为20-30℃，pH为6.5-9。

其中，所述将ENN71藻细胞接种在BG11培养基中，细胞密度可以为0.2-1.5g/L。在所述培养方法中，向所述培养基中通入二氧化碳与空气的混合气体，其中，所述二氧化碳可以占0.5-10％。

需要说明的是，与所述雨生红球藻野生株在同样的条件下进行培养，所述雨生红球藻突变株ENN71生长速度比雨生红球藻野生株提高40％以上。

另一方面，本发明实施例提供一种所述雨生红球藻突变株ENN71的虾青素诱导方法，包括：将处在不动孢子阶段的ENN71藻种接种在缺氮的BG11培养基中培养3天以上，期间，光照强度为200μmol/m²·s以上，培养温度为20-35℃，pH为6.5-9。

其中，将处在不动孢子阶段的ENN71藻种接种在缺氮的BG11培养基中，细胞密度可以为0.2-1.5g/L。在所述培养方法中，向所述培养基中通入二氧化碳与空气的混合气体，其中，所述二氧化碳可以占0.5-20％。

另一方面，本发明实施例还提供一种所述雨生红球藻突变株ENN71在获取用于诱导虾青素的藻种中的应用。

诱导虾青素之前所述雨生红球藻突变株ENN71处于游动细胞阶段，需要对所述游动细胞进行培养以获得用于诱导虾青素的藻种。

其中，在相同的培养条件下，所述雨生红球藻突变株ENN71生长速度比雨生红球藻野生株提高40％以上。

另一方面，本发明实施例还提供一种所述雨生红球藻突变株ENN71在虾青素诱导中的应用。

其中，所述虾青素诱导方法不做限定，例如：可以为缺氮、缺磷诱导，可以为光照强度诱导，也可以为化学诱导。

优选的，对处在不动孢子阶段的雨生红球藻进行虾青素诱导培养3天以上，所述雨生红球藻突变株ENN71的虾青素含量为所述雨生红球藻野生株的2倍以上。

再一方面，本发明实施例还提供一种所述雨生红球藻突变株ENN71在继代培养中的应用。

其中，所述继代培养的期限不做限定，可以为继代培养1年，也可以为继代培养2年，以继代培养3年的所述雨生红球藻突变株ENN71为例进行说明，以雨生红球藻野生株为对照，对其进行培养并诱导虾青素，可以获得所述雨生红球藻突变株ENN71生长速度比雨生红球藻野生株快，所述雨生红球藻突变株ENN71的虾青素含量比所述雨生红球藻野生株高。

优选的，将继代培养1年以上的所述雨生红球藻突变株ENN71与雨生红球藻野生株在相同的培养条件下培养，所述雨生红球藻突变株ENN71生长速度比雨生红球藻野生株提高40％以上，对处在不动孢子阶段的雨生红球藻进行虾青素诱导3天以上，所述雨生红球藻突变株ENN71的虾青素含量为所述雨生红球藻野生株的2倍以上。

本发明的一实施例中，所述雨生红球藻突变株ENN71遗传性能稳定，具有与原代雨生红球藻突变株ENN71相似的特点，即生长周期短、天然虾青素含量高以及遗传性能稳定。

具体实施方式

这些实施例仅是为了具体说明本发明而提出的示例，本领域技术人员可以知道的是本发明的范围不受这些实施例、对照例以及试验例的限制。

本发明提供的一实施例中，所述雨生红球藻突变株ENN71的筛选与获得具体为：

将野生雨生红球藻藻液经2次紫外诱变，EMS化学诱变处理，加入除草剂进行反复压力处理和初筛、复筛，获得性能优良的高产虾青素突变株ENN71。该雨生红球藻突变株ENN71保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.5147。

在本发明提供的又一实施例中，所述雨生红球藻突变株ENN71的常规培养包含多种实现方式，在此不做限定，仅以以下实施例为例进行具体说明。

实施例1

在40mm内径、600mm长度的柱式反应器中，将ENN71藻细胞接种于BG11培养基中，细胞密度为0.5g/L，以野生ENN wt为对照。培养过程中光照强度为100μmol/m²·s，培养温度为25-28℃，在培养期内，向所述培养基中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，使得所述培养基的pH值为7-9，每天进行显微镜镜检，整个培养过程中细胞形态的变化与野生株相似，定时取样测定藻细胞干重，获得藻株生长速度曲线对比图。

参见图1为本发明实施例提供的一株雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt的生长速度曲线对比图，由图可知，常规条件下培养ENN71与野生株ENN wt，所述突变株ENN71生长明显优于野生株ENN wt，生长速度较对照野生株ENN wt提高40％。

实施例2

所述实施例2与所述实施例1基本完全相同，唯一不同的是，将ENN71藻细胞接种于BG11培养基中，细胞密度为1.5g/L，培养过程中光照强度为300μmol/m²·s，培养温度为25-30℃，向所述培养基中通入5-10％的二氧化碳和空气的混合气体，所述培养基的pH值为6.5-8。在培养第12天时，对所述雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt取样测定藻细胞干重，获得所述一株雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt的培养第12天的对比图。

参见图2，由图可知，常规条件下培养12天的ENN71与野生株ENN wt所获得的藻粉干重相比，所述突变株ENN71生长明显优于野生株ENN wt，生长速度较对照野生株ENN wt提高41％。

实施例3

所述实施例3与所述实施例1基本完全相同，唯一不同的是，将ENN71藻细胞接种于BG11培养基中，细胞密度为0.2g/L，培养过程中光照强度为50μmol/m²·s，培养温度为20-25℃，向所述培养基中通入0.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，所述培养基的pH值为6.5-8。在培养第12天时，对所述雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt取样测定藻细胞干重，获得所述一株雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt的培养第12天的对比图。

参见图3，由图可知，常规条件下培养12天的ENN71与野生株ENN wt所获得的藻粉干重相比，所述突变株ENN71生长明显优于野生株ENN wt，生长速度较对照野生株提高40.5％。

本发明提供的又一实施例中，所述雨生红球藻突变株ENN71的虾青素诱导包含多种实现方式，在此不做限定，仅以以下实施例为例进行具体说明。

实施例4

在30mm内径、600mm长度的柱式反应器中，将处在不动孢子阶段的ENN71接种于缺氮的BG11培养基中，细胞密度为0.2g/L，以野生ENN wt为对照。培养过程中光照强度为200μmol/m²·s，培养温度为25-28℃，在培养期内，向所述培养基中通入0.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，使得所述培养基的pH值为7-9，培养7天，可以得出所述雨生红球藻突变株ENN71细胞明显变红。将所述雨生红球藻突变株ENN71藻液离心收集藻细胞，所获得的藻泥真空冷冻干燥24h，获得干藻粉A，同样的，将所述野生ENN wt藻液离心收集藻细胞，所获得的藻泥真空冷冻干燥24h，获得干藻粉A′。

实施例5

所述实施例5与所述实施例4基本相同，唯一不同的是，将处在不动孢子阶段的ENN71接种于缺氮的BG11培养基中，细胞密度为1.5g/L，培养过程中光照强度为500μmol/m²·s，培养温度为30-35℃，在培养期内，向所述培养基中通入15-20％的二氧化碳和空气的混合气体，使得所述培养基的pH值为6.5-8，培养5天，可以得出所述雨生红球藻突变株ENN71细胞明显变红。将藻液离心收集藻细胞，所获得的藻泥真空冷冻干燥24h，获得干藻粉B，同样的，将所述野生ENN wt藻液离心收集藻细胞，所获得的藻泥真空冷冻干燥24h，获得干藻粉B′。

实施例6

所述实施例6与所述实施例4基本相同，唯一不同的是，将处在不动孢子阶段的ENN71接种于缺氮的BG11培养基中，细胞密度为0.8g/L，培养过程中光照强度为400μmol/m²·s，培养温度为28-30℃，在培养期内，向所述培养基中通入5-10％的二氧化碳和空气的混合气体，使得所述培养基的pH值为6.5-8，培养3天，可以得出所述雨生红球藻突变株ENN71细胞明显变红。将藻液离心收集藻细胞，所获得的藻泥真空冷冻干燥24h，获得干藻粉C，同样的，将所述野生ENN wt藻液离心收集藻细胞，所获得的藻泥真空冷冻干燥24h，获得干藻粉C′。

获得干藻粉A-C与A′-C′后，为了对所述实施例4-6的效果进行客观评价，对所述干藻粉A-C与A′-C′进行虾青素含量分析，具体如下：

1)虾青素提取：

分别准确称取一定量的藻粉A-C与A′-C′于10ml的小玻璃瓶中，向其中加入4ml的提取液(二氯甲烷：甲醇＝25:75)，磁力搅拌下在避光冰浴条件下提取1h，3500转离心5min，转移上清液于另一瓶中，可重复上述步骤直至藻渣变白。在上述合并提取液中加入1/6体积的NaOH-甲醇溶液，震荡后在5℃水浴黑暗处理12h，提取液分别用0.22um的注射式膜过滤，-20℃保存备用。

2)虾青素含量分析：

用高效液相色谱分别检测所述提取液中的虾青素含量，流动相为：甲醇：乙腈＝75:25，流速：0.8ml/min，柱温：25-28℃，检测波长：450nm，进样量：20μl。根据不同浓度的虾青素标准品绘制标准曲线，从而计算虾青素的含量。

所述高效液相色谱测量的统计结果如下表1所示：

表1

藻粉	A-C虾青素含量(％)	A′-C′虾青素含量(％)
			实施例4	4.09	1.98
实施例5	4.10	2.03
			实施例6	4.13	2.06

从表1可得出：本发明实施例提供的雨生红球藻突变株ENN71虾青素含量达到4.09％以上，明显高于所述野生株ENN wt的虾青素含量，约为所述野生株虾青素含量的2倍以上。

可见，本发明实施例提供的雨生红球藻突变株ENN71虾青素含量较大，能够用于生产虾青素，并提高虾青素的产量。

本发明的再一实施例中，所述雨生红球藻突变株ENN71在继代培养中的应用也包含多种实现方式，在此不做限定，仅以以下实施例为例进行具体说明。

实施例7

将继代培养1年的雨生红球藻突变株ENN71继续培养，与所述实施例2的培养方法基本相同，不同的是，所采用的雨生红球藻突变株ENN71为继代培养1年后的藻株，在此对所述培养方法不再赘述。

同时对所述突变株与野生株定时镜检及测量藻细胞干重。

参见图4，为本发明实施例提供的继代培养1年后的雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt的生长速度曲线对比图，可得出：常规条件下培养ENN71生长明显优于野生株ENN wt，生长速度较对照野生株ENN wt提高41.5％。

实施例8

所述实施例8与所述实施例7基本相同，唯一不同的是，所述实施例8所采用的雨生红球藻突变株ENN71为继代培养2年后的藻株，在此对所述培养方法不再赘述。

参见图5，为本发明实施例提供的继代培养2年后的雨生红球藻突变株ENN71与野生株的培养第12天对比图，可得出：常规条件下培养12天的ENN71与野生株ENN wt所获得的藻粉干重相比，ENN71生长明显优于野生株ENN wt，生长速度较对照野生株ENN wt提高40％。

实施例9

所述实施例9与所述实施例7基本相同，唯一不同的是，所述实施例8所采用的雨生红球藻突变株ENN71为继代培养3年后的藻株，在此对所述培养方法不再赘述。

参见图6，为本发明实施例提供的继代培养3年后的雨生红球藻突变株ENN71与野生株ENN wt的培养第12天对比图，可得出：常规条件下培养ENN71生长明显优于野生株ENNwt，生长速度较对照野生株ENN wt提高40.5％。

实施例10

所述实施例10为继代培养1年后的雨生红球藻突变株ENN71进行虾青素诱导的应用的一种实现方式。

其中，所述虾青素诱导方法与所述实施例4的方法基本相同，不同的是，所采用的雨生红球藻突变株ENN71为继代培养1年后的藻株，在此对所述培养方法不再赘述。

同样，对所述突变株与野生株培养3天后的藻株进行冷冻干燥，制成藻粉，并用与所述实施例3同样的方法对所述干藻粉进行虾青素含量分析。

可以得出：雨生红球藻突变株ENN71虾青素含量达到4％以上，明显高于所述野生株ENN wt的虾青素含量，约为所述野生株ENN wt虾青素含量的2倍以上。

实施例11

所述实施例11为继代培养2年后的雨生红球藻突变株ENN71进行虾青素诱导的应用的一种实现方式。

其中，所述虾青素诱导方法与所述实施例5的方法基本相同，不同的是，所采用的雨生红球藻突变株ENN71为继代培养2年后的藻株，在此对所述培养方法不再赘述。

同样，对所述突变株与野生株培养5天后的藻株进行冷冻干燥，制成藻粉，并用与所述实施例5同样的方法对所述干藻粉进行虾青素含量分析。

可以得出：雨生红球藻突变株ENN71虾青素含量达到4％以上，明显高于所述野生株ENN wt的虾青素含量，约为所述野生株ENN wt虾青素含量的2倍以上。

实施例12

所述实施例12为继代培养3年后的雨生红球藻突变株ENN71进行虾青素诱导的应用的一种实现方式。

其中，所述虾青素诱导方法与所述实施例6的方法基本相同，不同的是，所采用的雨生红球藻突变株ENN71为继代培养3年后的藻株，在此对所述培养方法不再赘述。

同样，对所述突变株与野生株培养7天后的藻株进行冷冻干燥，制成藻粉，并用与所述实施例6同样的方法对所述干藻粉进行虾青素含量分析。

可以得出：雨生红球藻突变株ENN71虾青素含量达到4％以上，明显高于所述野生株ENN wt的虾青素含量，约为所述野生株ENN wt虾青素含量的2倍以上。

综上所述，实施例10-12提供的继代培养后的雨生红球藻突变株ENN71仍然具有生长周期短、天然虾青素含量高的特点，说明所述雨生红球藻突变株ENN71能够良好的保持其所具有的生理特性，遗传性能稳定。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一株雨生红球藻ENN71，为Haematococcus pluvialis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5147，保藏日期为2011年8月17日。

2.一种如权利要求1所述的雨生红球藻ENN71的培养方法，其特征在于，包括：将ENN71藻细胞接种在BG11培养基中培养，期间，光照强度为50-300μmol/m²·s，培养温度为20-30℃，pH为6.5-9。

3.一种如权利要求1所述的雨生红球藻ENN71的虾青素诱导方法，其特征在于，包括：将处在不动孢子阶段的ENN71藻种接种在缺氮的BG11培养基中培养3天以上，期间，光照强度为200μmol/m²·s以上，培养温度为20-35℃，pH为6.5-9。

4.一种如权利要求1所述的雨生红球藻ENN71在获取用于诱导虾青素的藻种中的应用。

5.一种如权利要求1所述的雨生红球藻ENN71在虾青素诱导中的应用。

6.一种如权利要求1所述的雨生红球藻ENN71在继代培养中的应用。