CN103630626A - 一种厚壁微藻天然虾青素的提取和含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厚壁微藻天然虾青素的提取和含量测定方法。本发明厚壁微藻天然虾青素的提取方法通过液氮低温保护经二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇组成的提取溶剂在低温下提取得到虾青素。有效避免虾青素高温分解或氧化变质,操作简单,破壁完全,提取效率高,对厚壁微藻等生物体均适用。本发明厚壁微藻天然虾青素的提取方法与高效液相色谱法结合检测虾青素含量,既可获得总类胡萝卜素含量也可获得游离虾青素、虾青素单酯、虾青素双酯以及叶黄素和玉米黄质素等含量信息,将为开展微藻虾青素和其他类胡萝素的相关研究提供重要方法学。用高效液相色谱法检测虾青素含量,测定的准确度高,可靠性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种厚壁微藻天然虾青素的提取和含量测定方法。
背景技术
叶黄素、虾青素等类胡萝卜素普遍存在于绿藻中。雨生红球藻(Haematococcus,又称血球藻)是团藻目,红球藻科的绿藻。这种微藻累积的虾青素含量为可高达1.5%~6.0%,被看作是天然虾青素的“浓缩品”。大量研究表明雨生红球藻对虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高,而且雨生红球藻所含虾青素及其酯类的配比(约70%的单酯,25%的双酯及5%的单体)与水产养殖动物(虾、蟹、三文鱼等)中虾青素自身配比极为相似。雨生红球藻中虾青素的结构以3S-3’S型为主,与鲑鱼等水产生物体内虾青素结构基本一致。而通过化学合成和利用红发夫酵母等提取的虾青素,大多为3R-3’R型或者两者的混合型。作为天然食品添加剂,后两者无法和雨生红球藻来源的虾青素相媲美。
虾青素是一种具有邻羟基酮结构的非维生素A原的类胡萝卜素,是自然界已知最强的天然抗氧化剂。其抗氧化能力为维生素E的550倍、β-胡萝卜素的20倍,能快速清除体内由紫外线照射产生的活性氧自由基、抑制多不饱和脂肪酸的氧化,具有调节免疫、加速色素形成以及抗肿瘤等生物学功能,尤其是对紫外线引起的皮肤癌有很好的疗效。此外,虾青素还可以对抗血液中的胆固醇、低密度脂蛋白的氧化,对防治动脉粥样硬化等心血管疾病有较好的预防疗效,可作为添加剂广泛用于功能型食品、保健品及化妆品等抗衰老产品。虾青素对改善视力也具有独特的效果,是一种天然的“眼保健维生素”,可直接改善视力。
当前,雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物来源,因此,利用这种微藻提取虾青素具有十分广阔的发展前景,并已成为近年来国际上天然虾青素的研究最为热点的领域之一。但由于雨生红球藻、小球藻等产生虾青素的藻类往往在诱导累积虾青素后会形成孢子,具有十分坚硬的细胞壁,常规超声破壁、高温高压破壁、酸热法破壁(如专利CN103232375A)、或者碱热法破壁等细胞壁破碎方法一方面不能有效破碎微藻坚硬的细胞壁;另一方面复杂的处理过程往往伴随着高温、高压、强酸、强碱等极端条件会极大地程度地破坏微藻中虾青素的原始组成(游离态、单酯、双酯),甚至造成氧化分解或者光降解。这些样品的提取和制备方法严重影响了后续检测结果的准确性。因此,虾青素的快速高效提取、准确检测是虾青素生产和新产品开发所面临亟待解决的问题。
目前虾青素的检测方法主要是采用湖北荆州天然虾青素有限责任公司企业质量标准制定的方法(如专利CN102012368A)。该方法先用NaOH-甲醇水溶液破壁,再用醋酸-DMSO溶液提取虾青素,稀释定容至相应浓度后,在492nm波长下测定吸光度A,用下式计算所测溶液中虾青素浓度:
式中:C为被测溶液中虾青素的含量/(%),A492为492nm波长被测溶液吸光值,A1%1cm为消光系数/(2220)。
该方法具有以下明显的缺点和不足之处:(1)样品前处理和测定过程不能有效排除叶绿素等其他色素的干扰;(2)检测过程仅能获得总虾青素含量信息,无法区分样品中所含的其他β-胡萝卜素以及虾青素的各种组成形式;(3)紫外法测吸光度,准确度较低;(4)检测过程采用NaOH和醋酸作为破壁的碱和酸将会大大增加虾青素和其它类胡萝卜素组成改变和氧化降解的风险。在提取后的检测方法方面,也有如专利CN102749240A提供的一种虾青素的高效薄层色谱扫描检测方法,用甲醇、二氯甲烷混合溶剂溶解,在正己烷、丙酮做展开剂,展开10min后,在薄层扫描仪进行全波长扫描,每个板重复扫描5次,通过峰面积进行线性回归计算虾青素含量。该法虽然可分别检测不同虾青素和其它胡萝卜素的浓度和组成,但是,此发明方法操作繁琐,检测过程时间较长并需要在室温下开展,容易引起虾青素等类胡萝卜素的氧化分解和光降解,因此,准确度不高。另外,点样过程重现性较差、薄层扫描检测的灵敏度非常有限,主观偶然因素引起的偶然误差也较大,这些会对虾青素及类胡萝卜素等色素的检测结果造成一定的影响。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种厚壁微藻天然虾青素的提取方法。
本发明的目的还在于提供一种厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种厚壁微藻天然虾青素的提取方法,包含如下步骤:往微藻中加入石英砂,再倒入液氮冷冻;待微藻充分冷冻后,加入提取溶剂充分研磨,分离残渣和上清液;所述的提取溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合溶剂。
所述的提取溶剂中二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的体积比优选为1:1~5。
上述厚壁微藻天然虾青素的提取方法在测定厚壁微藻天然虾青素含量中的应用。
一种厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法,包含如下步骤:
(1)将微藻置于研钵中,加入石英砂、液氮和提取溶剂充分研磨;
(2)研磨后将微藻和提取试剂转入离心管中,再用提取溶剂冲洗研钵至无残留,冲洗液也转入离心管中,离心分离残渣和上清液,收集上清液;
(3)往残渣中再加液氮和提取溶剂进行研磨;
(4)重复步骤(2)和(3)至离心上清液无色,合并上清液;
(5)浓缩除去上清液中的提取溶剂得到取虾青素样品;
(6)用提取溶剂将虾青素样品稀释定容至合适体积,通过高效液相色谱法测定虾青素含量。该方法中的提取溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合溶剂,二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的体积比优选为1:1~5。
步骤(2)中所述的离心的转速优选为1000~3000r/min。
步骤(5)中所述的浓缩的方法优选为氮气吹干。
步骤(6)中高效液相色谱法测定虾青素含量,优选包含如下步骤:
1)测定虾青素的色谱条件如下:C18柱,洗脱剂为流动相A和流动相B,流速为1.0mL/min,柱温为40℃,二级管阵列紫外-可见光检测器,360~800nm全波长扫描;其中流动相A的组分及体积百分比为5%二氯甲烷+85%甲醇+5.5%乙腈+4.5%水,流动相B的组分及体积百分比为25%二氯甲烷+28%甲醇+5.5%乙腈+4.5%水。
2)高效液相色谱法的梯度洗脱条件如下表所示:
顺序 | 时间(min) | 流速(mL/min) | A% | B% |
1 | 0 | 1.0 | 100 | 0 |
2 | 8 | 1.0 | 100 | 0 |
3 | 14 | 1.0 | 0 | 100 |
4 | 50 | 1.0 | 0 | 100 |
5 | 65 | 1.0 | 100 | 0 |
3)按下式计算虾青素含量:
其中,C为虾青素浓度,μg/mL;P为在480nm波长处的对称吸收峰峰面积(mV.s.)总和;
按下式计算虾青素所占微藻干重百分含量:
C为虾青素浓度,mg/mL;X为稀释定容体积,mL;m为雨生红球藻干重,mg。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明提取虾青素方法,通过液氮低温保护经二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇组成的提取溶剂在低温下提取得到虾青素,可以有效避免虾青素高温分解或氧化变质,操作简单,破壁完全,提取效率高,对厚壁微藻等生物体均适用。
本发明虾青素含量的定量检测采用高效液相色谱法,与一般的比色法只能测定总类胡萝卜素含量相比,该法既可获得总类胡萝卜素含量也可获得游离虾青素、虾青素单酯、虾青素双酯以及叶黄素和玉米黄质素等含量信息,将为开展微藻虾青素和其他类胡萝素的相关研究提供重要方法学。用高效液相色谱法检测虾青素含量,测定的准确度高,可靠性强。
附图说明
图1是实施例1中采用高效液相色谱法测定雨生红球藻提取物的色谱图。
图2是实施例2中采用高效液相色谱法测定雨生红球藻提取物的色谱图。
图3是实施例3中采用高效液相色谱法测定雨生红球藻提取物的色谱图。
图4是实施例4中采用高效液相色谱法测定雨生红球藻提取物的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用雨生红球藻中的游离虾青素、叶黄素、虾青素酯、总类胡萝素实际含量分别为0.03%、0.15%、3.04%、3.21%。
实施例1雨生红球藻新鲜藻液提取物的制备及含量检测
(1)虾青素的提取
1)藻细胞干重测定:取50mL新鲜雨生红球藻藻液用定性滤纸(定性滤纸在80℃烘箱中已烘至恒重)过滤,然后,将过滤后的滤纸置于80℃烘箱中烘至恒重,称得雨生红球藻干重31.5mg、31.3mg(平行试验)。
2)虾青素提取:另取50mL新鲜藻液以8000r/min的转速离心,去上清液,将离心后的雨生红球藻藻细胞转入研钵中,依次加入适量石英砂,并在研钵中倒入液氮冷冻。待藻细胞充分冷冻后,加入0.5mL提取溶剂(二氯甲烷-甲醇(v:v=1:3))充分研磨后,将藻细胞连同提取溶剂一起转移至离心管中,并用提取溶剂冲洗研钵,洗至无残留,以2000r/min转速离心分离残渣和上清液,收集上清液。然后重复上述液氮研磨提取步骤,直至离心上清液无色,合并上清液。
3)虾青素供试液制备:采用氮气吹扫浓缩法,浓缩上述提取虾青素样品,再用提取溶剂稀释定容至10mL,涡旋震荡摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得虾青素样品的供试液。
(2)虾青素的检测
1)所使用的高效液相色谱仪:岛津LC-20A型高效液相色谱仪,生产厂商日本岛津公司。
2)高效液相色谱法(HPLC)检测条件:C18(4.6mm柱内径×250mm柱长度)柱,洗脱剂为流动相A(5%二氯甲烷+85%甲醇+5.5%乙腈+4.5%水,体积百分比)和流动相B(25%二氯甲烷+28%甲醇+5.5%乙腈+4.5%水,体积百分比),流速为1.0mL/min,柱温为40℃,二级管阵列紫外-可见光检测器,360~800nm全波长扫描。HPLC的梯度洗脱条件如下表所示。
顺序 | 时间(min) | 流速(mL/min) | A% | B% |
1 | 0 | 1.0 | 100 | 0 |
2 | 8 | 1.0 | 100 | 0 |
3 | 14 | 1.0 | 0 | 100 |
4 | 50 | 1.0 | 0 | 100 |
5 | 65 | 1.0 | 100 | 0 |
高效液相色谱法测定雨生红球藻提取物的色谱图如图1所示。
(3)虾青素含量计算
其中,C为虾青素/叶黄素/总虾青素酯/总类胡萝素浓度,μg/mL;P为在480nm波长处的对称吸收峰峰面积(mV.s.)总和。算得游离虾青素浓度为:1.03μg/mL,1.04μg/mL(平行样品);叶黄素的浓度为:4.58μg/mL,4.63μg/mL(平行样品);总虾青素酯的浓度为:93.56μg/mL,94.21μg/mL(平行样品);总类胡萝素的浓度为:99.17μg/mL,99.88μg/mL(平行样品)。
代入公式中,其中:C为虾青素/叶黄素/总虾青素酯/总类胡萝素浓度,mg/mL;X为稀释定容体积,mL;m为雨生红球藻干重,mg。算得游离虾青素占雨生红球藻的干重百分含量为:0.03%,0.03%(平行样品);叶黄素百分含量为:0.15%,0.15%(平行样品);虾青素酯百分含量为:2.97%,3.01%(平行样品);总类胡萝素百分含量为:3.15%,3.19%(平行样品)。
实施例2雨生红球藻干藻粉提取物的制备及含量检测
(1)虾青素的提取
1)虾青素提取:取50.0mg雨生红球藻干藻粉于研钵中,依次加入适量石英砂,并在研钵中倒入液氮冷冻。待藻细胞充分冷冻后,加入1mL提取溶剂(二氯甲烷-甲醇(v:v=1:1))充分研磨后,将藻细胞连同提取溶剂一起转移至离心管中,并用提取溶剂冲洗研钵,洗至无残留,以3000r/min转速离心分离残渣和上清液,收集上清液。然后重复上述液氮研磨提取步骤,直至离心上清液无色,合并上清液。
2)虾青素供试液制备:采用氮气吹扫浓缩法,浓缩上述提取虾青素样品,再用提取溶剂稀释定容至10mL,涡旋震荡摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得虾青素样品的供试液。
(2)虾青素的检测
用实施例1中高效液相色谱方法,检测虾青素,色谱图如图2所示。
(3)虾青素含量计算
代入实施例1中公式,算得游离虾青素浓度为:1.66μg/mL,1.66μg/mL(平行样品);叶黄素的浓度为:7.39μg/mL,7.37μg/mL(平行样品);总虾青素酯的浓度为:151.03μg/mL,150.47μg/mL(平行样品);总类胡萝素的浓度为:160.08μg/mL,159.50μg/mL(平行样品)。游离虾青素占雨生红球藻干重百分含量为:0.03%,0.03%(平行样品);叶黄素百分含量为:0.15%,0.15%(平行样品);虾青素酯百分含量为:3.02%,3.01%(平行样品);总类胡萝素百分含量为:3.20%,3.19%(平行样品)。
实施例3雨生红球藻新鲜藻液提取物的制备及含量检测
(1)虾青素的提取
1)藻细胞干重测定:取100mL新鲜雨生红球藻藻液用定性滤纸(定性滤纸在80℃烘箱中已烘至恒重)过滤,然后,将过滤后的滤纸置于80℃烘箱中烘至恒重,称得雨生红球藻干重62.9mg、62.7mg(平行样品)。
2)虾青素提取:另取100mL新鲜藻液用定性滤纸过滤后,用提取溶剂(三氯甲烷-甲醇(v:v=1:5))吹洗滤纸上的藻细胞至研钵中,直至无藻细胞残留在滤纸上,依次加入适量石英砂,并在研钵中倒入液氮冷冻。待藻细胞充分冷冻后,加入0.7mL提取溶剂充分研磨后,将藻细胞连同提取溶剂一起转移至离心管中,并用提取溶剂冲洗研钵,洗至无残留,以1000r/min转速离心分离残渣和上清液,收集上清液。然后重复上述液氮研磨提取步骤,直至离心上清液无色,合并上清液。
3)虾青素供试液制备:采用氮气吹扫浓缩法,浓缩上述提取虾青素样品,再用提取溶剂稀释定容至25mL,涡旋震荡摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得虾青素样品的供试液。
(2)虾青素的检测
用实施例1中高效液相色谱方法,检测虾青素,色谱图如图3所示。
(3)虾青素含量计算
代入实施例1中公式,算得游离虾青素浓度为:0.82μg/mL,0.83μg/mL(平行样品);叶黄素的浓度为:3.65μg/mL,3.68μg/mL(平行样品);总虾青素酯的浓度为:74.47μg/mL,75.24μg/mL(平行样品);总类胡萝素的浓度为:78.94μg/mL,79.75μg/mL(平行样品)。游离虾青素占雨生红球藻干重百分含量为:0.03%,0.03%(平行样品);叶黄素百分含量为:0.15%,0.15%(平行样品);虾青素酯百分含量为:2.96%,3.00%(平行样品);总类胡萝素百分含量为:3.14%,3.18%(平行样品)。
实施例4雨生红球藻干藻粉提取物的制备及含量检测
(1)虾青素的提取
1)虾青素提取:取80.0mg雨生红球藻干藻粉于研钵中,依次加入适量石英砂,并在研钵中倒入液氮冷冻。待藻细胞充分冷冻后,加入1.0mL提取溶剂(三氯甲烷-甲醇(v:v=1:2))充分研磨后,将藻细胞连同提取溶剂一起转移至离心管中,并用提取溶剂冲洗研钵,洗至无残留,以2000r/min转速离心分离残渣和上清液,收集上清液。然后重复上述液氮研磨提取步骤,直至离心上清液无色,合并上清液。
2)虾青素供试液制备:采用氮气吹扫浓缩法,浓缩上述提取虾青素样品,再用提取溶剂稀释定容至10mL,涡旋震荡摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得虾青素样品的供试液。
(2)虾青素的检测
用实施例1中高效液相色谱方法,检测虾青素,色谱图如图4所示。
(3)虾青素含量计算
代入实施例1中公式,算得游离虾青素浓度为:2.48μg/mL,2.46μg/mL(平行样品);叶黄素的浓度为:11.99μg/mL,12.01μg/mL(平行样品);总虾青素酯的浓度为:238.42μg/mL,239.19μg/mL(平行样品);总类胡萝素的浓度为:252.89μg/mL,253.66μg/mL(平行样品)。游离虾青素占雨生红球藻干重百分含量为:0.03%,0.03%(平行样品);叶黄素百分含量为:0.15%,0.15%(平行样品);虾青素酯百分含量为:2.98%,2.99%(平行样品);总类胡萝素百分含量为:3.16%,3.17%(平行样品)。
上述各实施例中测定的雨生红球藻中游离虾青素、叶黄素、虾青素酯、总类胡萝素的含量与实际含量几乎完全一致,表明本发明的提取虾青素的方法提取效率高,并能准确测定游离虾青素、叶黄素、虾青素酯、总类胡萝素的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种厚壁微藻天然虾青素的提取方法,其特征在于包含如下步骤:往微藻中加入石英砂,再倒入液氮冷冻;待微藻充分冷冻后,加入提取溶剂充分研磨,分离残渣和上清液;所述的提取溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合溶剂。
2.根据权利要求1所述的厚壁微藻天然虾青素的提取方法,其特征在于:所述的提取溶剂中二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的体积比为1:1~5。
3.权利要求1或2所述的厚壁微藻天然虾青素的提取方法在测定厚壁微藻天然虾青素含量中的应用。
4.一种厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法,其特征在于包含如下步骤:
(1)将微藻置于研钵中,加入石英砂、液氮和提取溶剂充分研磨;
(2)研磨后将微藻和提取试剂转入离心管中,再用提取溶剂冲洗研钵至无残留,冲洗液也转入离心管中,离心分离残渣和上清液,收集上清液;
(3)往残渣中再加液氮和提取溶剂进行研磨;
(4)重复步骤(2)和(3)至离心上清液无色,合并上清液;
(5)浓缩除去上清液中的提取溶剂得到取虾青素样品;
(6)用提取溶剂将虾青素样品稀释定容至合适体积,通过高效液相色谱法测定虾青素含量;
所述的提取溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的混合溶剂。
5.根据权利要求4所述的厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法,其特征在于:所述的提取溶剂中二氯甲烷或三氯甲烷与甲醇的体积比为1:1~5。
6.根据权利要求4所述的厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法,其特征在于:步骤(2)中所述的离心的转速为1000~3000r/min。
7.根据权利要求4所述的厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法,其特征在于:步骤(5)中所述的浓缩的方法为氮气吹干。
8.根据权利要求4所述的厚壁微藻天然虾青素含量的测定方法,其特征在于:步骤(6)中高效液相色谱法测定虾青素含量,包含如下步骤:
1)测定虾青素的色谱条件如下:C18柱,洗脱剂为流动相A和流动相B,流速为1.0mL/min,柱温为40℃,二级管阵列紫外-可见光检测器,360~800nm全波长扫描;其中流动相A的组分及体积百分比为5%二氯甲烷+85%甲醇+5.5%乙腈+4.5%水,流动相B的组分及体积百分比为25%二氯甲烷+28%甲醇+5.5%乙腈+4.5%水;
2)高效液相色谱法的梯度洗脱条件如下表所示:
3)按下式计算虾青素含量:
其中,C为虾青素浓度,μg/mL;P为在480nm波长处的对称吸收峰峰面积总和;
按下式计算虾青素所占微藻干重百分含量:
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