CN114965354A - 一种基于近红外光谱技术的dha含量原位无损测定方法 - Google Patents
一种基于近红外光谱技术的dha含量原位无损测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114965354A CN114965354A CN202210572866.4A CN202210572866A CN114965354A CN 114965354 A CN114965354 A CN 114965354A CN 202210572866 A CN202210572866 A CN 202210572866A CN 114965354 A CN114965354 A CN 114965354A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dha
- infrared spectrum
- content
- sample
- near infrared
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000009499 grossing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000009659 non-destructive testing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004497 NIR spectroscopy Methods 0.000 claims 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 claims 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 17
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 80
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 40
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 40
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000012625 in-situ measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 241001533172 Thladiantha dubia Species 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/35—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light
- G01N21/359—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light using near infrared light
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
- G06F18/00—Pattern recognition
- G06F18/20—Analysing
- G06F18/24—Classification techniques
- G06F18/241—Classification techniques relating to the classification model, e.g. parametric or non-parametric approaches
- G06F18/2411—Classification techniques relating to the classification model, e.g. parametric or non-parametric approaches based on the proximity to a decision surface, e.g. support vector machines
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06N—COMPUTING ARRANGEMENTS BASED ON SPECIFIC COMPUTATIONAL MODELS
- G06N20/00—Machine learning
- G06N20/10—Machine learning using kernel methods, e.g. support vector machines [SVM]
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Software Systems (AREA)
- Evolutionary Computation (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Artificial Intelligence (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Computing Systems (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，包括以下步骤：配置含有不同浓度DHA的样品；利用近红外光谱仪分别测定样品的吸光度和透射比，得到红外光谱数据；对红外光谱数据进行选择，得到合适谱段；对选定的谱段进行平滑、基线校正，得到DHA红外光谱信息；利用气相色谱测定DHA含量的化学值；建立DHA红外光谱数据信息与其化学值的相关模型；将模型进行集成化设计，得到便于直接测定DHA样品含量的仪器设备；采用仪器设备对含有DHA的样品进行含量检测。上述技术方案中提供的基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，能有效解决现有DHA测定方法繁琐复杂、时间长且会对生物类样品造成不可逆损伤的问题。
Description
技术领域
本发明涉及DHA含量测定技术领域，具体涉及一种基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法。
背景技术
DHA，二十二碳六烯酸，俗称脑黄金。是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，属于Omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要元素，是大脑和视网膜的重要构成脂肪酸，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％；对婴儿智力和视力发育至关重要。
目前，公知的DHA测定方法是不同的产品(本身为油脂类产品除外)经氯仿-甲醇法提取油脂，油脂(包括油脂类产品)经皂化、甲酯化后，利用气相色谱毛细管柱进行分离，用氢火焰离子化检测器检测，使用内标法定量。但是这种测定方法不仅程序繁琐、过程复杂，还会消耗大量的材料成本和时间，最重要的是还会对生物类样品造成不可逆的损伤。因此，亟需设计一种新的技术方案，以综合解决现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，能有效解决现有DHA测定方法繁琐复杂、时间长且会对生物类样品造成不可逆损伤的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：
一种基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，包括以下步骤：
步骤S1.配置不同浓度的DHA样品；
步骤S2.利用近红外光谱仪分别测定样品的吸光度和透射比，得到红外光谱数据；
步骤S3.对处理后的红外光谱数据进行趋势化处理，得到处理后的DHA红外光谱信息；
步骤S4.对处理的DHA红外光谱采用连续投影算法(SPA)得到特征波长900-1700nm；
步骤S5.利用气相色谱测定DHA含量的化学值；
步骤S6.建立DHA红外光谱数据信息与其化学值的相关模型，并进行验证；
步骤S7.采用S6中得到的模型对含有DHA的样品进行含量检测。
其中，步骤S3是采用平滑、基线校正和去趋势化法对各组样品的光谱进行选择处理的。
其中，步骤S6中是采用Matlab中数据处理模块中的支持向量机(SVM)和高斯过程回归算法进行不断学习计算，得到效果最优的模型。
上述技术方案中提供的基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，依托近红外光谱仪测定，省去了传统方法中提取、皂化、甲酯化等一系列操作步骤，在节省了大量人力物力的同时，还能保留样品的完整性。本发明的测定方法可以对不同物理状态样品的DHA含量进行快速、无损、准确地测定，快速准确地测定样品中的DHA含量，且不会破坏样品的完整性和活性。
附图说明
图1为实施例1微藻液体样品两次原位测定的近红外谱图；
图2为实施例2中含DHA干粉样品两次原位测定的近红外谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式，并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。
取定量的DHA于4ml离心管中，用正己烷进行梯度稀释，得到两组不同浓度的DHA样品液，在近红外光谱仪中，设置步长为0.5nm，波长选择900-2500nm，进行测定，选取吸光度和透射比导出数据保存，为后续的测定DHA含量采集基础数据。
实施例1
取2mL大溪地金藻悬浮液样品(生物量浓度2.0g/L)，利用近红外光谱仪测定900-2500nm波长吸光度；对波长谱段进行平滑、基线校正；采用去趋势化进行光谱处理，采用连续投影算法(SPA)对各组样品的光谱特征波长进行选择，即计算一个波长在其余波长上的投影，比较各波长相应的投影值，选择最大投影值对应的波长作为待选波长，多次循环比较后，选择出最优变量组。利用微藻悬浮液样品的DHA含量模型首先确定数据点为一个高斯过程的采样点.y(x)～N(μ(x)，k(x，x′))然后确定均值函数，设为0。其次确定协方差函数为高斯核函数，并进行修正。
接下来根据后验概率确定预测点的表达式
随后最大似然估计求解超参数
最后代入数据得出DHA含量，具体结果如下表所示。
实施例2
取50mg含DHA奶粉样品，利用近红外光谱仪测定900-2500nm波长吸光度，选定的谱段进行平滑、基线校正，采用去趋势化法进行光谱处理，采用连续投影算法(SPA)对各组样品的光谱进行选择处理，得到DHA红外光谱信息利用模型得出DHA含量，具体结果如下表所示。
对比例1
取100mL大溪地金藻悬浮液样品，经过高速离心(5000RPM)5分钟，分离出固相产物，进行冷冻干燥，冻干后取藻粉20mg左右，藻粉称完后加转甲基化试剂2mL，混匀器上混匀10s。80℃水浴锅消解2.5小时，冷却后加0.1mol/L NaCl 1mL，混匀器混匀10s，加正己烷(含内标，内标浓度配制为0.4mg/mL)2mL，混匀器上混匀约2min，静置5-10分钟，离心取上清液约1-1.5mL于气相小瓶中。
随后进行气相色谱测定，条件设置如下：色谱仪配备FID检测器，和DB-FFAP毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；1μL进样量；1∶10分流比；450mL/min空气流速，45mL/min载气N2，40mL/min H2；250℃进样温度；300℃检测温度。炉温开始140℃保持2min，然后以10℃/min升至240℃，在240℃保持2min。用停留时间与标准DHA物质进行比对确定脂肪酸种类；DHA的浓度用标准曲线来确定，标准曲线是标准DHA的峰面积与浓度的对应关系，用内标物质(C8:0)校正得到。DHA的干重用DHA的浓度与提油溶液体积(2mL)相乘得到，结果如下表所示。
对比例2
取20mg左右含DHA奶粉，称完后加转甲基化试剂2mL，混匀器上混匀10s。80℃水浴锅消解2.5小时，冷却后加0.1mol/L NaCl 1mL，混匀器混匀10s，加正己烷(含内标，内标浓度配制为0.4mg/mL)2mL，混匀器上混匀约2min，静置5-10分钟，离心取上清液约1-1.5mL于气相小瓶中。
随后进行气相色谱测定，条件设置如下：色谱仪配备FID检测器，和DB-FFAP毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；1μL进样量；1∶10分流比；450mL/min空气流速，45mL/min载气N2，40mL/min H2；250℃进样温度；300℃检测温度。炉温开始140℃保持2min，然后以10℃/min升至240℃，在240℃保持2min。用停留时间与标准DHA物质进行比对确定脂肪酸种类；DHA的浓度用标准曲线来确定，标准曲线是标准DHA的峰面积与浓度的对应关系，用内标物质(C8:0)校正得到。DHA的干重用DHA的浓度与提油溶液体积(2mL)相乘得到，结果如下表所示。
上述实施例的测试结果如下表所示：
由上表可知，采用本发明的方法，即实施例1和实施例2，与对比例1和对比例2相比，本发明方法耗费时间短，材料成本低，实施例1和实施例2准确度均可以与分别各自的对比例相比较，对比例认为是准确度高的化学计量值，实例1和实例2测得数值均比对比例低，相对误差分别是17.9％和5.6％，在检测时间大大缩减和检测成本大大降低的情况下，具有较好的准确性。
上面结合实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在获知本发明中记载内容后，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其作出若干同等变换和替代，这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1.配置含有不同浓度DHA的样品；
步骤S2.利用近红外光谱仪分别测定样品的吸光度和透射比，得到红外光谱数据；
步骤S3.对红外光谱数据进行去趋势化处理，得到DHA有效光谱数据；
步骤S4.对处理后的DHA红外光谱采用连续投影算法得到特征谱段；
步骤S5.利用气相色谱测定DHA含量的化学值；
步骤S6.建立DHA红外光谱数据信息与其化学值的相关模型，并进行验证；
步骤S7.采用S6中模型对含DHA的样品进行含量检测。
2.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，其特征在于：步骤S3是采用平滑、基线校正和去趋势化法对各组样品的光谱进行选择的。
3.根据权利要求1所述的基于近红外光谱技术的DHA含量原位无损测定方法，其特征在于：步骤S6中是采用Matlab中数据处理模块中的支持向量机和高斯过程回归的算法进行不断学习计算。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210572866.4A CN114965354A (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 一种基于近红外光谱技术的dha含量原位无损测定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210572866.4A CN114965354A (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 一种基于近红外光谱技术的dha含量原位无损测定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114965354A true CN114965354A (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=82956156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210572866.4A Pending CN114965354A (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 一种基于近红外光谱技术的dha含量原位无损测定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114965354A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116297318A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-06-23 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种基于近红外光谱法测定甘薯茎尖总酚的方法 |
-
2022
- 2022-05-24 CN CN202210572866.4A patent/CN114965354A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116297318A (zh) * | 2023-03-24 | 2023-06-23 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种基于近红外光谱法测定甘薯茎尖总酚的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meenu et al. | A critical review on analytical techniques to detect adulteration of extra virgin olive oil | |
| CN103913433B (zh) | 一种丹红注射液双效浓缩过程在线检测方法 | |
| Zhao et al. | Discrimination of adulterated sesame oil using mid-infrared spectroscopy and chemometrics | |
| CN105738504B (zh) | 一种气相色谱质谱联用测定山核桃脂肪酸含量的方法 | |
| EP3865872A1 (en) | Information processing device, information processing device control method, program, calculation device, and calculation method | |
| CN114965354A (zh) | 一种基于近红外光谱技术的dha含量原位无损测定方法 | |
| Li et al. | Identification of aged-rice adulteration based on near-infrared spectroscopy combined with partial least squares regression and characteristic wavelength variables | |
| CN102621092A (zh) | 一种丹红注射液醇沉过程在线检测方法 | |
| CN104316489A (zh) | 一种近红外光谱检测灵芝提取物掺假的方法 | |
| Mascrez et al. | Enhancement of volatile profiling using multiple-cumulative trapping solid-phase microextraction. Consideration on sample volume | |
| CN107727640A (zh) | 一种利用表面增强拉曼光谱法鉴别烟用香精香料的方法 | |
| Tong et al. | Simultaneous quantification of crocetin esters and picrocrocin changes in Chinese saffron by high-performance liquid chromatography-diode array detector during 15 years of storage | |
| WO2024061126A1 (zh) | 聚羟基脂肪酸酯含量的检测方法、装置、系统、设备 | |
| Liu et al. | Classification and quantification analysis of peach kernel from different origins with near-infrared diffuse reflection spectroscopy | |
| CN107029038B (zh) | 一种响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺 | |
| CN106442788B (zh) | 一种基于色素的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法 | |
| CN112666114A (zh) | 利用光谱识别水牛奶与马奶的方法 | |
| Yan et al. | Rapid detection of cAMP content in red jujube using near-infrared spectroscopy | |
| CN107796780B (zh) | 太赫兹光谱定量检测血液中血脂含量的分析方法 | |
| CN102759515A (zh) | 基于水平atr的中红外光谱快速测定农产品含油率的方法 | |
| US20170219484A1 (en) | Determination of a constituent related property of a multi-constituent sample | |
| Sayehmiri et al. | THE PREVALENCE OF HEPATITS B INFECTION IN HEALTH CARE WORKERS TN IRAN-A SAYSTEMATIC REVIEW AND META-ANALYSIS | |
| CN114239692B (zh) | 一种鉴别生鲜乳脂肪掺假的方法及装置 | |
| Wang et al. | Study of peanut kernel storage quality discrimination based on odor pattern | |
| Huang et al. | Rapid quantitative typing spectra model for distinguishing sweet and bitter apricot kernels |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |