CN107029038B - 一种响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺，采用回流提取，在单因素试验结果的基础上，采用Box‑Behnken响应面设计法，选取乙醇浓度、乙醇用量和提取时间三个因素作为响应变量，以龙眼叶总黄酮提取得率作为响应值，对各因素进行多项式拟合回归，得到回归方程，对回归方程进行计算，得到龙眼叶总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度53％，乙醇用量57mL，回流时间83min，此条件下总黄酮的提取率为15.479％，与预测值15.482％相差甚微。本发明方法不仅提取率高，而且简单可行，提取成本较低，运用响应面设计优化确定最优提取因素,保证了最优提取因素的科学性，能为龙眼叶的进一步研究提供理论参考。

Description

一种响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，特别是一种响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺。
背景技术
龙眼叶，广西特色民族药，始载于《滇南本草图说》。为著名的亚热带水果—龙眼(Dimocarpus longan)树的叶子或嫩芽。其性味甘、淡、平，具发表清热、利湿解毒之功效。主要用于治疗感冒发热、疟疾、疔疮、湿疹等。前期研究表明，龙眼叶中含有黄酮类、多酚类、挥发油、鞣质、有机酸等多种化学成分，而黄酮类化合物为其主要活性物质，具有抗氧化、抑制血清脂质增加以及抑制动脉粥样硬化形成，抗炎镇痛、免疫调节、抗衰老、抗辐射等重要作用。该化合物在治疗肿瘤、心血管疾病、糖尿病以及抗HIV病毒等多方面均具有活性。目前，国内外对龙眼叶药材的提取工艺多采用正交试验设计进行优化，正交试验设计的特点是只能对单个的点进行分析，不能对连续的变量进行分析，导致实验的精度不够,同时不能较好的考察各因素间的交互作用，不能较好地筛选出龙眼叶中总黄酮的最佳提取工艺。
响应面法是对响应曲面及等高线的分析寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合响应值与因素之间函数关系的一种优化统计方法。响应面法的优点是在实验条件优化过程中可以连续地对试验因素的各个水平进行分析，克服了正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析和不能给出直观图形的缺陷。但目前尚未见使用响应面分析法对龙眼叶药材的提取工艺进行优化的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取率高、提取工艺条件准确可靠而且简单可行的响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺，为龙眼叶的进一步研究提供理论参考。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种响应面法优化龙眼叶总黄酮的提取工艺，所述提取工艺为龙眼叶粉末加入一定量的乙醇溶液进行回流提取，在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken响应面设计法，选取乙醇浓度、乙醇用量和提取时间三个因素作为响应变量，以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，分别编码-1、0、1，以龙眼叶总黄酮提取得率作为响应值，对各因素进行多项式拟合回归，得到回归方程：
Y＝15.37+0.30A-0.059B+0.17C+0.067AB+0.18AC+0.060BC-0.78A2-0.20B2-0.063C2，
式中，A为乙醇体积浓度，B为乙醇溶液用量，C为提取时间，Y为龙眼叶总黄酮得率；对上述回归方程进行计算，得到龙眼叶总黄酮的最佳提取工艺条件。
所述单因素试验的方法步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品0.0203g置于100mL容量瓶中，加入体积浓度70％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即成0.203mg·mL-1的芦丁对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取龙眼叶药材粉末1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，称重后按一定条件提取，后用提取溶剂补足重量，摇匀，滤过，精密量取10mL续滤液至25mL容量瓶中，定容至刻度，即为龙眼叶供试品溶液；
(3)测定方法及波长的选择：精密量取对照品和供试品溶液各1.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加入质量浓度5％的NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min；然后加入质量浓度10％的Al(NO3)3溶液1mL，摇匀，放置6min；再加入质量浓度4％的NaOH溶液10mL，摇匀，用提取溶剂定容至刻度，放置15min，最后再以相应试剂作空白，照紫外可见分光光度法，在400～800nm测定吸收光谱图；最后选择506nm作为测定波长；
(4)提取方式的试验：分别取龙眼叶药材粉末3份，每份约1g，精密称定，加入20mL体积浓度95％乙醇溶液，分别采用超声、回流和浸渍各提取30分钟,分别精密量取步骤(2)所述的龙眼叶供试品溶液3份各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按步骤(3)方法测定并计算龙眼叶总黄酮含量；结果表明回流提取的提取率最高，故选择回流提取作为龙眼叶药材的提取方式；
(5)提取溶剂的试验：分别取龙眼叶药材粉末3份，每份约1g，精密称定，分别加入20mL的水、体积浓度100％甲醇、体积浓度95％乙醇溶液，分别回流提取30分钟，分别精密量取步骤(2)所述的龙眼叶供试品溶液3份各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按步骤(3)方法测定并计算龙眼叶总黄酮含量；结果表明乙醇作为溶剂的提取率最高，故选择乙醇作为提取溶剂；
(6)溶剂浓度的试验：分别取龙眼叶药材粉末6份，每份1g，精密称定，分别加入30mL的体积浓度分别为30％、40％、50％、60％、70％、95％乙醇溶液，分别回流提取30分钟，分别精密量取步骤(2)所述的龙眼叶供试品溶液6份各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按步骤(3)方法测定并计算龙眼叶总黄酮含量；结果表明用体积浓度50％乙醇提取龙眼叶总黄酮提取率最高；
(7)溶剂用量的试验：分别取龙眼叶药材粉末6份，每份1g，精密称定，分别加入体积浓度50％的乙醇溶液20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL，分别回流提取30分钟，分别精密量取步骤(2)所述的龙眼叶供试品溶液6份各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按步骤(3)方法测定并计算龙眼叶总黄酮含量；结果表明体积浓度50％乙醇溶液用量为60mL提取龙眼叶总黄酮提取率最高；
(8)提取时间的试验：分别眼叶药材粉末4份，每份1g，精密称定，分别加入体积浓度50％乙醇溶液60ml,分别回流提取30min、60min、90min、120min，分别精密量取步骤(2)所述的龙眼叶供试品溶液4各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按步骤(3)方法测定并计算龙眼叶总黄酮含量；结果表明回流时间为60min提取龙眼叶总黄酮的提取率最高。
所述龙眼叶总黄酮最佳提取工艺条件为：按1g的龙眼叶粉末，乙醇体积浓度52.81％，乙醇溶液用量56.67mL，提取时间82.89min。
本发明的优点：提取率高，提取工艺条件准确可靠，而且简单可行，提取成本较低，运用响应面设计优化确定最优提取因素,保证了最优提取因素的科学性，为龙眼叶的进一步研究提供理论参考。
附图说明
图1是本发明实施例1中芦丁对照品紫外-可见光谱图。
图2是本发明实施例1中龙眼叶供试品紫外-可见光谱图。
图3是本发明实施例1中乙醇浓度和乙醇用量交互作用下的龙眼叶总黄酮得率的响应曲面图。
图4是本发明实施例1中乙醇浓度和乙醇用量交互作用下的龙眼叶总黄酮得率的等高线图。
图5是本发明实施例1中乙醇浓度和提取时间交互作用下的龙眼叶总黄酮得率的响应曲面图。
图6是本发明实施例1中乙醇浓度和提取时间交互作用下的龙眼叶总黄酮得率的等高线图。
图7是本发明实施例1中乙醇用量和提取时间交互作用下的龙眼叶总黄酮得率的响应曲面图。
图8是本发明实施例1中乙醇用量和提取时间交互作用下的龙眼叶总黄酮得率的等高线图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作详细说明，但不构成对权利要求保护范围的限制。
实施例1：
1.仪器与试药的准备：
1.1仪器：UV-1780紫外可见分光光度计，SQP电子分析天平，KQ-500DA超声波清洗器，HH-4数显恒温水浴锅。
1.2试药
龙眼叶药材采自广西贺州市，经鉴定Dimocarpus longan Lour.的叶。芦丁对照品,NaOH,NaNO2,Al(NO3)3,体积浓度95％乙醇溶液,所用试剂均为分析纯。
2.方法与结果：
2.1对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品0.0203g置于100mL容量瓶中，加入体积浓度70％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即成0.203mg·mL-1的芦丁对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备：取龙眼叶药材粉末1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，称重后按一定条件提取，后用提取溶剂补足重量，摇匀，滤过，精密量取10mL续滤液至25mL容量瓶中，定容至刻度，即为龙眼叶供试品溶液。
2.3测定方法及波长的选择：精密量取对照品和供试品溶液各1.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加入质量浓度5％的NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min；然后加入质量浓度10％的Al(NO3)3溶液1mL，摇匀，放置6min；再加入质量浓度4％的NaOH溶液10mL，摇匀，用提取溶剂定容至刻度，放置15min，最后再以相应试剂作空白，照紫外可见分光光度法，在400～800nm测定吸收光谱图。结果表明芦丁对照品溶液和龙眼叶供试品溶液的最大吸收波长均为506nm，故将506nm作为测定波长。
2.4线性关系考察：分别精密量取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于25mL容量瓶中，按第2.3步从“加入5％NaNO2溶液1mL”起同法操作，在506nm波长处测定吸光度。以吸收值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到求出回归方程为Y＝13.958X+0.015858，r＝0.9995。结果表明，芦丁对照品在0.00812mg·mL-1～0.04872mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5单因素考察：
2.5.1提取方式的考察：取龙眼叶药材粉末3份，每份1g，精密称定，分别加入20mL体积浓度95％乙醇溶液，分别采用超声、回流、浸渍方法各提取30分钟,然后按第2.2步制备供试品溶液。然后分别精密量取3份供试品溶液各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，按第2.3步从“加入质量浓度5％NaNO2溶液1mL”起同法操作，计算龙眼叶总黄酮含量。结果总黄酮含量分别为8.40％、10.38％、6.62％，故选择回流提取作为龙眼叶药材的提取方式。
2.5.2提取溶剂的考察：取龙眼叶药材粉末3份，每份1g，精密称定，分别加入20mL的水、体积浓度100％甲醇、体积浓度95％乙醇溶液，分别回流提取30分钟，然后按第2.2步制备供试品溶液。然后分别精密量取3份供试品溶液各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按第2.3步从“加入质量浓度5％NaNO2溶液1mL”起同法操作，计算龙眼叶总黄酮含量。结果总黄酮含量分别7.58％、6.65％、8.43％，故选择乙醇作为提取溶剂。
2.5.3溶剂浓度的考察：取龙眼叶药材粉末6份，每份1g，精密称定，分别加入30mL的体积浓度分别为30％、40％、50％、60％、70％、95％乙醇溶液，分别回流提取30分钟，然后按第2.2步制备供试品溶液。然后分别精密量取6份供试品溶液各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按第2.3步从“加入质量浓度5％NaNO2溶液1mL”起同法操作，计算龙眼叶总黄酮含量。结果总黄酮含量分别为12.92％、13.22％、13.39％、12.75％、12.88％、10.55％，表明用体积浓度50％乙醇提取龙眼叶总黄酮提取率最高。
2.5.4溶剂用量的考察：取龙眼叶药材粉末6份，每份1g，精密称定，分别加入体积浓度50％的乙醇溶液20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL，分别回流提取30分钟，然后按第2.2步制备供试品溶液。然后分别精密量取6份供试品溶液各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按第2.3步从“加入质量浓度5％NaNO2溶液1mL”起同法操作，计算龙眼叶总黄酮含量。结果总黄酮含量分别为12.29％、13.11％、13.94％、14.68％、14.94％、14.43％，表明体积浓度50％乙醇溶液用量为60mL提取龙眼叶总黄酮提取率最高。
2.5.5提取时间的考察：取龙眼叶药材粉末4份，每份1g，精密称定，分别加入体积浓度50％乙醇溶液60ml,分别回流提取30min、60min、90min、120min，然后按第2.2步制备供试品溶液。然后分别精密量取4份供试品溶液各1.00mL，分别置于50mL量瓶中，分别按第2.3步从“加入质量浓度5％NaNO2溶液1mL”起同法操作，计算龙眼叶总黄酮含量。结果总黄酮含量分别为14.94％、15.43％、15.33％、14.94％，表明回流时间为60min提取龙眼叶总黄酮的提取率最高。
2.6 Box-Behnken响应面优化
2.6.1因素水平的选取及实验设计
通过如第2.5步对单因素进行考察，确定本实验设计的因素和水平，即选取乙醇浓度(A)、乙醇溶液用量(B)、提取时间(C)三个因素，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，以龙眼叶中总黄酮的得率为考察指标，设计出三因素三水平17个实验点的响应面分析，其中心点试验重复5次，以估测实验误差。其中实验设计的中心及水平见表1，设计组合及总黄酮提取率见表2。
表1响应面实验设计中心水平
Figure BDA0001287701820000061
表2响应面实验设计组合及总黄酮提取率
Figure BDA0001287701820000062
1.6.2回归模型的建立及相关分析
采用Design-Expert 8.0.6统计软件对实验结果进行多项式拟合回归，得到回归方程Y＝15.37+0.30A-0.059B+0.17C+0.067AB+0.18AC+0.060BC-0.78A2-0.20B2-0.063C2，其方差分析见表3。
表3回归模型的方差分析
Figure BDA0001287701820000071
注：P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异。
由表3可知，实验模型“Pr＞F”值小于0.0001十分显著，表明该模型用于评价本实验的可信度较高。结果显示A、C、AC、A2、B2对考察指标总黄酮含量的影响最为显著，B、AB、BC、C2对其影响不显著。失拟项(P＝0.1051>0.05)不显著，表明该方程拟合度良好，误差较小。R2＝0.9814,表明最佳条件下响应的预测值和实测值偏差较小。
根据回归方程Y可绘制出相应的响应曲面图，它是响应值在各因素交互作用下构成的一个三维空间曲面，可以用来较为直观分析两交互作用对响应值的影响情况。分析当乙醇浓度、乙醇用量和提取时间三个因素其中有一个因素固定时，另外两个因素及其交互作用对所提取的总黄酮含量的影响。根据方程做出模型的响应曲面及其等高线见图3～图5。
由图3～图5的响应曲面图可知，随着乙醇浓度的增大,所提取的总黄酮含量也随之增加，但当乙醇浓度增大到一定程度后，总黄酮含量有下降的趋势，表明乙醇浓度对总黄酮含量的影响十分显著。同样由图得知，提取时间对总黄酮含量影响较显著，乙醇用量对总黄酮含量的影响相对不显著。
利用Design-Expert 8.0.6统计软件求解方程得到，龙眼叶药材总黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度52.81％，乙醇用量56.67mL，提取时间82.89min，此条件下总黄酮的提取预测值为15.482％。客观考虑实验进行的可行性，将乙醇浓度定为53％，乙醇用量定为57mL，提取时间定为83min，依据所确定的最佳提取工艺进行实际验证(n＝3)，实际测得龙眼叶总黄酮平均提取率为15.479％，这与理论预测值十分接近。因此，采用Box-Behnken的中心组合试验设计优化得到的龙眼叶提取工艺条件准确可靠，具有实用价值。《龙眼叶中黄酮类物质提取条件的优化》(陈颖峰，梁志，广东化工，2009年第8期，第36卷总第196期)中，龙眼叶中黄酮类物质的提取工艺流程：龙眼叶一除杂质一水洗--70℃烘箱烘干一粉碎一称重一减压蒸馏提取一过滤一黄酮类物质提取液；采用正交实验法优化上述提取工艺得到最佳提取工艺为料液比为1∶25、提取时问为3h、提取温度为80℃、提取剂为50％乙醇溶液，最高提取率2.776089％，平均得率为2.5667％。与其相比，本发明方法得到的龙眼叶药材总黄酮最佳提取工艺，提取率远远高于现有技术正交实验法。

Claims (1)

1.一种龙眼叶总黄酮的提取工艺，其特征在于，所述提取工艺为龙眼叶粉末加入一定量的乙醇溶液进行回流提取，其提取工艺条件为：按1g的龙眼叶粉末，乙醇体积浓度52.81%，乙醇溶液用量56.67mL，提取时间82.89min。
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