CN106442820B

CN106442820B - 含果胶的样品的前处理方法、测定方法、试剂盒及用途

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Publication number: CN106442820B
Application number: CN201610899898.XA
Authority: CN
Inventors: 范坚强; 包可翔; 王金华; 陈少滨; 王永泽; 陈义强; 何伟; 陈善义; 李菁菁
Original assignee: Hubei University of Technology; China Tobacco Fujian Industrial Co Ltd
Current assignee: Hubei University of Technology; China Tobacco Fujian Industrial Co Ltd
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2016-10-17
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2036-10-17
Also published as: CN106442820A

Abstract

本发明属于检测分析领域，涉及一种含果胶的样品的前处理方法，包括如下步骤：(1)用酸性醇溶液浸渍样品，分离出残渣；其中，酸性醇溶液的pH值为2～2.52；(2)向步骤(1)得到的残渣中加入酸溶液进行水解，分离得到液体和残渣；其中，酸溶液的pH值为1～1.52；(3)将所述液体的pH值调整为3～5，加入果胶酶溶液I进行酶解，分离得到上清液A。本发明还涉及测定样品中的果胶或测定半乳糖醛酸的方法、试剂盒及用途。本发明方法将烟草或烟草制品中的果胶较大程度地转化为半乳糖醛酸，产生较少的副产物，本发明方法还能准确、快速测定出烟草或烟草制品的果胶含量。

Description

含果胶的样品的前处理方法、测定方法、试剂盒及用途

技术领域

本发明属于检测分析领域，具体涉及一种含果胶的样品的前处理方法，还涉及样品中果胶的测定方法、半乳糖醛酸的测定方法、试剂盒及用途。

背景技术

烟叶尤其是上部烟叶中含有相当数量的果胶，约占烟叶干质量的6％-20％。烟叶燃吸过程中，高含量的果胶给烟气带来刺激性，不利于吸烟的安全性，同时，高含量的果胶还会导致卷烟的焦油含量上升。因此，准确测定果胶含量对于烟草或烟草制品的品质把控具有重要意义，果胶含量己成为评价烟草或烟草制品品质的一个重要指标。

按照测定原理，果胶含量的检测方法主要有四类：

第一类，重量法。用草酸铵溶液提取出样品中的果胶，再加盐酸的乙醇溶液沉淀出果胶，然后用稀氨水溶解沉淀，得到果胶，再加入氢氧化钠使所有果胶被水解，变成可溶解的果胶酸盐，最后用氯化钙沉淀为果胶酸钙，以果胶酸钙的含量表示果胶的含量(参见国家标准GB/T 10742-2008)，这种方法不依赖于复杂设备，但操作较为复杂且重复性差。

第二类，将果胶水解为半乳糖醛酸，再用化学显色剂显色的方法。这一方法的原理在于：烟叶中的果胶主要由乳糖、阿拉伯糖、多聚糖、糖酸甲酯等组成，以游离和钙盐两种形式存在；果胶在酸、碱或酶条件下能进一步分解为半乳糖醛酸，而半乳糖醛酸作为还原性化合物能与许多显色剂反应显色。这类方法主要包括3,5二硝基水杨酸法、硫酸咔唑法和对间羟基联苯显色法，但这些方法都存在一定的缺点：3,5二硝基水杨酸法中，烟叶本身所含的还原糖会形成一些干扰，虽然经样品预处理可提前去除部分中性还原糖，但预处理过程中也不可避免地会损失掉一部分果胶物质，导致检测的准确性不高。硫酸咔唑法中，半乳糖醛酸遇酸容易形成内酯物质，导致检测误差，而且，酸性条件下果胶还容易释放出一些中性还原糖，干扰了半乳糖醛酸与咔唑的反应。对间羟基联苯显色法中，因显色剂是对间羟基联苯，与干扰物质—中性还原糖的反应程度低，因此联合连续流动分析仪使其成为一种主要的果胶含量分析方法；但该方法的显色反应中还要有浓硫酸存在，当样品含大量中性糖时，极易与浓硫酸形成棕色的显色干扰组分，因此，通常采用去除烟叶的中性还原糖或乙醇沉淀纯化果胶的方法来减少中性还原糖的干扰，但这种处理要经过多次回流和过滤，操作极为繁琐。

第三类方法，将果胶用酶水解为半乳糖醛酸，采用电位滴定法测定半乳糖醛酸的含量。酶解—电位滴定法消除了浓硫酸对显色反应的干扰，操作简单，重复性好，回收率高，设备投资小，能满足烟草样品果胶含量的批量测定，但是，对于样品中的中性还原糖对电位滴定的影响，目前还没有进行深入的评估。

第四类方法，采用色谱法检测果胶降解后产生的半乳糖醛酸或其衍生物的含量。如离子交换色谱法，采用酶降解果胶产生半乳糖醛酸，离子交换柱分离半乳糖醛酸和中性还原糖后，安培检测器分别测定各组分含量。还有一种方法，是采用酸降解果胶产生半乳糖醛酸，然后再用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)进行衍生，这样就能用常见的碳十八柱配合紫外检测器来对半乳糖醛酸含量进行检测(CN 102507760 A)。这类方法除了色谱检测外，还需离子交换分离、衍生化等步骤，操作较为繁琐。

目前，尚需一种简便、高效、准确的测定烟草和/或烟草制品中果胶含量的方法。

发明内容

本发明人惊奇地发现了一种含果胶的样品的前处理方法，该方法能较大程度地将烟草和/或烟草制品中的果胶转化为半乳糖醛酸，产生较少的副产物。本发明人还获得了一种测定果胶的方法，该方法通过测定果胶所转化成的半乳糖醛酸的含量，能够准确、快速地检测出烟草和/或烟草制品中的果胶含量，灵敏度高，操作简便。在此基础上，本发明人还提出了一种测定半乳糖醛酸的方法、一种试剂盒和该试剂盒的用途。

本发明第一方面涉及一种含果胶的样品的前处理方法，包括如下步骤：

(1)用酸性醇溶液浸渍样品，分离出残渣；其中，酸性醇溶液的pH值为2～2.52(酸性醇溶液中的氢离子浓度为0.003～0.01mol/L)；

(2)向步骤(1)得到的残渣中加入酸溶液进行水解，分离得到液体和残渣；其中，酸溶液的pH值为1～1.52(酸溶液中的氢离子浓度为0.03～0.1mol/L)；

(3)将步骤(2)得到的液体的pH值调整为3～5，加入第一果胶酶溶液进行酶解，分离得到第一上清液。

本发明第一方面的一个实施方式中，所述的前处理方法还包括如下步骤：

(4)向步骤(2)得到的残渣中加入第二果胶酶溶液进行酶解，分离得到第二上清液。

本发明第一方面的一个实施方式中，所述的前处理方法还包括下述步骤：

(5)将第一上清液和第二上清液进行混合，得到混合提取液。

本发明第一方面的一个实施方式中，所述样品为烟草和/或烟草制品。

在一个实施方案中，所述样品选自烟叶、烟丝、烟叶组合物和卷烟中的一种或多种。

本发明第一方面的一个实施方式中，步骤(1)中形成醇溶液酸性的物质选自盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的一种或多种，优选为盐酸溶液。

本发明第一方面的一个实施方式中，所述前处理方法包括如下1)至20)中的任意一项或者多项：

1)步骤(1)中，所述酸性醇溶液的pH值为2～2.3，优选为2.3(酸性醇溶液中的氢离子浓度为0.005～0.01mol/L，优选为0.005mol/L)；

2)步骤(1)中，浸渍的料液比为1:(10～200)(g/mL)，优选为1:(50～150)(g/mL)，更优选为1:100(g/mL)；

3)步骤(1)中，所述醇溶液选自乙醇溶液、异丙醇溶液和甲醇溶液中的一种或多种，优选为乙醇溶液；优选地，所述醇溶液为醇水溶液；

4)步骤(1)中，所述醇溶液的浓度为60％～90％(W/W)，优选为70％～85％(W/W)，更优选为70％(W/W)、75％(W/W)、78％(W/W)、80％(W/W)或85％(W/W)；

5)步骤(1)中，分离的方式为过滤，优选为砂芯漏斗过滤；

6)步骤(1)还包括，在浸渍之前，将样品进行粉碎的步骤；优选地，将样品粉碎至粒径为40目；

7)步骤(2)中，所述酸溶液的pH值为1～1.3，优选为1.3(酸溶液中的氢离子浓度为0.05～0.1mol/L，优选为0.05mol/L)；优选地，所述酸溶液为酸水溶液；

8)步骤(2)中，所述酸溶液的用量为80～120mL/(g样品)，优选为90～110mL/(g样品)，更优选为100mL/(g样品)；

9)步骤(2)中，所述酸溶液选自盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的一种或多种，优选为盐酸溶液；

10)步骤(2)还包括，在水解之前，用乙醇溶液洗涤步骤(1)得到的残渣的步骤；

优选地，乙醇溶液的浓度为60％～90％(W/W)，更优选为70％～85％(W/W)，进一步优选为70％(W/W)、75％(W/W)、78％(W/W)、80％(W/W)或85％(W/W)；

优选地，乙醇溶液的温度为70℃～80℃；

11)步骤(1)的浸渍和/或步骤(2)的水解在回流条件下进行；

优选地，回流温度为60℃～100℃，回流时间为0.5～6小时；

更优选地，回流温度为70℃～90℃，回流时间为1～5小时；

进一步优选地，回流温度为70℃或80℃，回流时间为1小时；

12)步骤(3)中，将步骤(2)得到的液体的pH值调整为4；

13)步骤(3)中，通过向步骤(2)得到的液体中加入固体碱或碱溶液调整pH值，优选加入碱溶液；

优选地，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液和氢氧化钾溶液；

优选地，所述碱溶液的浓度为1～10mol/L，更优选为10mol/L；

14)每毫升第一果胶酶溶液或每毫升第二果胶酶溶液中的酶活为800～5000U，优选为1000～4000U，更优选为1000U或4000U；

15)步骤(3)和/或步骤(4)酶解体系中的酶活为40000～500000U，优选为50000～400000U、40000～70000U或300000～500000U，更优选为40000U、50000U、60000U、70000U、330000U或400000U；

16)步骤(3)和步骤(4)酶解体系中的酶活不同；

优选地，步骤(4)酶解体系中的酶活大于步骤(3)酶解体系中的酶活；

更优选地，步骤(4)酶解体系中的酶活为步骤(3)酶解体系中酶活的6-10倍，进一步优选为8倍；

17)步骤(3)和/或步骤(4)中，酶解温度为35℃～70℃，酶解时间为0.5～10小时；

优选地，酶解温度为45℃～65℃，酶解时间为1～8小时；

更优选地，酶解温度为45℃、50℃或55℃，酶解时间为1小时、2小时或3小时；

18)第一果胶酶溶液和/或第二果胶酶溶液为含果胶酶的乙酸/乙酸钠缓冲溶液；

优选地，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的pH值为3～5，更优选为4；

优选地，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.05～0.3mol/L，更优选为0.2mol/L；

19)步骤(3)和/或步骤(4)中，通过离心进行分离；优选地，离心转速为8000～12000r/min，离心时间为5～20分钟；更优选地，离心转速为10000r/min，离心时间为5分钟；

20)步骤(3)和/或步骤(4)还包括，在分离之前，将酶解体系中的酶进行灭活的步骤；优选地，采用沸水浴进行灭活；优选地，灭活时间为10～30分钟，更优选为20分钟。

不拘于理论的限制，步骤(4)的酶解体系采用与步骤(3)的酶解体系相同的较低的酶活时，步骤(2)得到残渣中的果胶转化为半乳糖醛酸的转化率较低，而且还会产生大量杂质，干扰测定的准确度。故相比于步骤(3)的酶解体系，步骤(4)的酶解体系采用较高的酶活。

本发明第二方面涉及一种测定样品中果胶含量的方法，包括按照本发明第一方面任一项所述的前处理方法得到第一上清液、第二上清液或混合提取液的步骤；以及对第一上清液、第二上清液或混合提取液中的半乳糖醛酸的含量进行测定的步骤，或者对由第一上清液、第二上清液或混合提取液定容之后得到的液体中的半乳糖醛酸的含量进行测定的步骤。

本发明第二方面的一个实施方式中，采用液相色谱—蒸发光散射检测器进行测定。

本发明第二方面的一个实施方式中，还包括，根据所述半乳糖醛酸的含量的测定结果，计算样品中以半乳糖醛酸计的果胶含量的步骤。

本发明第二方面的一个实施方式中，还包括，在测定之前，将第一上清液、第二上清液、混合提取液或者由第一上清液、第二上清液或混合提取液定容之后得到的液体进行过滤的步骤；优选地，过滤所用滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

本发明第二方面的一个实施方式中，蒸发光散射检测器的操作条件包括如下i)至iv)中的任意一项或者多项：

i)漂移管温度为35～55℃，优选为45℃；

ii)喷雾器为冷却状态；

iii)气体压强为26～42psi，优选为35psi；

iv)增益为1～7，优选为1或7。

本发明第三方面涉及一种测定半乳糖醛酸的方法，包括采用液相色谱—蒸发光散射检测器测定液态样品中的半乳糖醛酸的步骤；

其中，蒸发光散射检测器的操作条件包括如下i)至iv)中的任意一项或者多项：

i)漂移管温度为35～55℃，优选为45℃；

ii)喷雾器为冷却状态；

iii)气体压强为26～42psi，优选为35psi；

iv)增益为1～7，优选为1或7。

本发明第二方面或第三方面的一个实施方式中，采用外标法进行测定；优选地，外标物为半乳糖醛酸。

本发明第二方面或第三方面的一个实施方式中，液相色谱的操作条件包括如下a至f中的任意一项或者多项：

a.液相色谱仪为waters e2695；

b.色谱柱为Aminex HPX-87糖分析柱；

c.流动相由乙腈和水组成，其中乙腈和水的体积比为(60～80):(20～40)，优选为60:40；

d.流动相的流速为0.2～1mL/min，优选为0.8mL/min；

e.柱温为40～55℃，优选为45℃；

f.进样量为5～22μL，优选为20μL。

本发明第四方面涉及一种试剂盒，包含pH值为1～1.5的盐酸水溶液、pH值为2～2.52的乙醇水溶液、含果胶酶的乙酸/乙酸钠缓冲溶液、孔径为0.22μm或0.45μm的滤膜和Aminex HPX-87糖分析柱。

本发明第四方面的一个实施方式中，乙醇水溶液的浓度为60％～90％(W/W)，优选为70％～85％(W/W)，更优选为70％(W/W)、75％(W/W)、78％(W/W)、80％(W/W)或85％(W/W)。

本发明第四方面的一个实施方式中，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.05～0.3mol/L，优选为0.2mol/L。

本发明第四方面的一个实施方式中，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的pH值为3～5，优选为4。

本发明第五方面涉及本发明第四方面任一所述试剂盒在含果胶的样品的前处理或者在测定样品的果胶中的用途；优选地，所述样品为烟草或烟草制品；更优选地，所述样品选自烟叶、烟丝、烟叶组合物和卷烟中的一种或多种。

本发明中，

术语“果胶”是指存在于高等植物细胞壁及细胞间隙的一种复杂多糖。由半乳糖醛酸以α-1,4方式连结起来的一种直链多糖,半乳糖醛酸分子中的羧基常甲基化。在酸性溶液中能凝结成胨。是制造果酱、胶胨、化妆品、乳化剂、脱水剂等的原料。

术语“果胶酶”是指催化果胶降解的酶，促使单糖之间的糖苷键断裂。例如，山东泰安信得利生物工程有限公司销售的食品级果胶酶、郑州蓝驰实业有限公司销售的食品级果胶酶、江苏锐阳生物科技有限公司销售的食品级果胶酶、南宁东恒华道生物科技有限责任公司销售的食品级果胶酶和济宁和美生物工程有限公司销售的食品级果胶酶。

术语“浸渍”是指用液体泡、浸泡、渗透。

术语“烟草”是指茄科，烟草属(Nicotiana L.)，一年生或多年生草本，嗜好类作物。本属约有60多个种，大多是野生种。主要栽培种有红花烟草和黄花烟草。二者均原产南美洲,都是自然产生的双二倍体。红花烟草又称普通烟草,是世界性商品生产用烟种。又因调制方法及种源、地区、栽培措施不同而形成多种类型：烤烟、白肋烟、马里兰烟、雪茄烟、熏烟、香料烟、晒红烟、晒黄烟等。每一类型中又有很多栽培品种。黄花烟草以前苏联和印度栽培较多，中国新疆、甘肃等地有少量栽培。本属中的花烟草(N.alata Link and Otta)和粉蓝烟草(N.glauca Graham)栽种供观赏。

术语“烟草制品”是指全部或部分由烟叶为原材料生产的、供抽吸、吸吮、咀嚼或鼻吸的制品。所述烟草制品包括但不限于卷烟和嚼烟。

术语“砂芯漏斗”是指耐酸玻璃滤过仪器，系采用优良硬质高硼玻璃组成，具有较高的理化性能。产品适用于化学分析、卫生检验、石油工业、制药工业、染料工业等方面。

术语“水解”是指物质加水或吸水引起的分解作用。

术语“回流”是指为了加快有些反应速度很慢或难以进行的化学反应，常常需要使反应物较长时间保持沸腾。这种情况下，就需要冷凝装置，使蒸汽不断地在冷凝管内冷凝而返回反应器中，以防止反应器中物质逸失。或有时反应物具有挥发性，为了不使反应物挥发太快而损失，通常在反应容器上方安装冷凝管，这样蒸汽将遇冷回流入反应容器内。

术语“酶活”也称为酶活力(enzyme activity)、酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。

术语“灭活”是指具有生物学活性的物质(酶、激素、抗体等)经变性，即失去原有的活性。通常热、光、酸碱、酒精等可使蛋白质变性。

术语“半乳糖醛酸”是果胶酸的组成单位，果胶的主要成分。存在于植物的粘液、树胶和细菌多糖中，多数为甲酯。分子式为C₆H₁₀O₇。

本发明取得的有益效果：

1、本发明含果胶的样品的前处理方法，能较大程度地将烟草和/或烟草制品中的果胶转化为半乳糖醛酸，产生较少的杂质和副产物。

2、本发明测定果胶的方法，通过检测果胶所转化成的半乳糖醛酸的含量，能准确、快速地测定出烟草和/或烟草制品中的果胶含量，检测灵敏度高，操作简便。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为本发明实施例1中溶液A的色谱图。

图2为本发明实施例1中溶液B的色谱图。

图3为本发明实施例1中0.5g/L半乳糖醛酸标准溶液的色谱图。

图4为本发明实施例1中半乳糖醛酸的标准曲线图。

图5为本发明对比例1中溶液E的色谱图。

图6为本发明对比例2中溶液F的色谱图。

图7为本发明对比例3中0.5g/L半乳糖醛酸标准溶液的色谱图。

具体实施方式

实施例1烟叶中果胶的测定

1、前处理

(1)将新鲜烟叶在40℃下烘干至恒重，准确称取烘干的烟叶1.0000g置于250ml圆底烧瓶中，每份样品设四个平行试样。

(2)向烟叶中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液含盐酸的浓度为0.005mol/L，80℃下热回流1小时去除水溶性糖，趁热砂芯漏斗抽滤后，用80℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗烟叶残渣三遍。

(3)向烟叶残渣中加入100ml的0.05mol/L盐酸水溶液，80℃下回流1小时，趁热砂芯漏斗抽滤，收集滤液和烟叶残渣，待下步酶解。

(4)将步骤(3)的滤液用10mol/L的NaOH水溶液调整至pH值为4，加入50ml用pH值为4、浓度为0.2mol/L的乙酸/乙酸钠缓冲溶液配制的果胶酶酶液，所用果胶酶为山东泰安信得利生物工程有限公司销售的食品级果胶酶，每毫升果胶酶酶液中的酶活达1000U，在50℃水浴下酶解3小时，酶解结束后，沸水浴20分钟，以10000r/min转速离心5分钟，得上清液A，定容至250ml，得到溶液A。

(5)向步骤(3)的滤渣中加入100ml用pH值为4、浓度为0.2mol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液配制的果胶酶酶液，所用果胶酶为山东泰安信得利生物工程有限公司销售的食品级果胶酶，每毫升果胶酶酶液中的酶活为4000U，在50℃水浴下酶解3小时，酶解结束后，沸水浴20分钟，以10000r/min转速离心5分钟，得上清液B，定容至100ml，得到溶液B。

2、检测

将溶液A和溶液B过0.22μm的微孔滤膜，然后采用液相色谱进行分析，得到的色谱图如图1-2所示。

液相色谱的条件如下：

色谱仪为waters e2695；检测器为waters 2424蒸发光散射检测器；色谱柱为Aminex HPX-87糖分析柱；流动相为乙腈：水＝60:40(V/V)，流动相的流量为0.8ml/min；柱温为45℃；进样量为20μL。

蒸发光散射检测器条件：漂移管温度为45℃；喷雾器处于冷却状态；气体压强为35.0psi；增益为1。

3、计算

(1)标准曲线：准确称取1.0000g半乳糖醛酸标准品(购买自上海源叶生物科技有限公司，D-半乳糖醛酸，纯度≥97％)，用水溶解定容于100ml容量瓶中，配制成半乳糖醛酸含量为1g/L的标准母液，稀释成0.2g/L，0.33g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.67g/L，0.8g/L标准溶液，采用2中的方法进行检测，其中，0.5g/L标准溶液的色谱图如图3所示。根据检测结果，以半乳糖醛酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制，得到标准曲线，如图4所示。

标准曲线方程为y＝92009100x-18484800，相关系数R2＝0.99788，表明半乳糖醛酸浓度为0.2～0.8g/L时与峰面积呈良好的线性关系。

(2)根据溶液A和溶液B的检测结果，结合标准曲线，计算出溶液A和溶液B中半乳糖醛酸的含量(分别为C_A和C_B)。根据下式计算出烟叶的果胶含量(以半乳糖醛酸计)，结果见表1。

其中，

W-烟叶中果胶的重量百分数(％)；

C_A-溶液A中半乳糖醛酸的浓度(g/L)；

V_A-溶液A的体积(0.25L)；

C_B-溶液B中半乳糖醛酸的浓度(g/L)；

V_B-溶液B的体积(0.1L)；

M-烟叶样品的质量(1g)。

4、用流动分析法(方法如下)对溶液A和溶液B进行检测，结果亦列于表1中。

移取溶液A和溶液B各1.0mL放入流动分析仪样品盘的试管中，分别加入5.0mL四硼酸钠的硫酸溶液，混匀，加热5分钟，冷却后，分别加入1.5mg/mL的间羟基联苯溶液100μL，混匀。以1mL水同上操作制得空白液调零。在524nm处测定吸光度。

对上面0.2g/L，0.33g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.67g/L，0.8g/L的标准溶液采用同上的方法测定吸光度并绘制标准曲线，计算得到溶液A和溶液B中的半乳糖醛酸含量，进而计算得到烟叶中果胶的含量。

表1

本发明方法比流动分析法更加简便、高效，检测结果稳定性更高。两种方法所测定的烟叶中果胶含量较为接近。

实施例2烟末中果胶的测定

1、前处理

(1)将新鲜烟叶在40℃下烘干至恒重，用粉碎机粉碎后，过40目筛网，得到烟末。准确称取烟末1.0000g置于250ml摇瓶中，每份样品设三个平行试样。

(2)向烟末中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液中含盐酸的浓度为0.005mol/L，70℃下热回流1小时以除去水溶性糖，趁热砂芯漏斗抽滤后，用70℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗烟叶残渣三遍。

(3)向烟叶残渣中加入100ml的0.05mol/L盐酸水溶液，70℃下回流1小时，趁热砂芯漏斗抽滤。

(4)将步骤(3)的滤液用10mol/L的NaOH水溶液调整至pH值为4，加入50ml用pH值为4、浓度为0.2mol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液配制的果胶酶酶液，所用果胶酶为山东泰安信得利生物工程有限公司销售的食品级果胶酶，每毫升果胶酶酶液中的酶活达1000U，在50℃水浴下酶解3小时，酶解结束后，沸水浴20分钟，以10000r/min转速离心5分钟，得上清液C，定容至250ml，得到溶液C。

(5)向步骤(3)的滤渣中加入100ml用pH值为4、浓度为0.2mol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液配制的果胶酶酶液，所用果胶酶为山东泰安信得利生物工程有限公司销售的食品级果胶酶，每毫升果胶酶酶液中的酶活为4000U，在50℃水浴下酶解3小时，酶解结束后，沸水浴20分钟，以10000r/min转速离心5分钟，得上清液D，定容至100ml，得到溶液D。

2、检测

将溶液C和溶液D过0.45μm微孔滤膜，然后采用液相色谱进行分析。

液相色谱的条件如下：

色谱仪为waters e2695；检测器为waters 2424蒸发光散射检测器；色谱柱为Aminex HPX-87糖分析柱；流动相为乙腈：水＝60:40(V/V)，流动相流速0.6ml/min；柱温为45℃；进样量为20μL。

蒸发光散射检测器条件：漂移管温度为45℃；喷雾器处于冷却状态；氮气压强为35.0psi；增益为1。

3、计算

(1)标准曲线：以半乳糖醛酸做外标，称取半乳糖醛酸标准品(购买自上海源叶生物科技有限公司，D-半乳糖醛酸，纯度≥97％)0.1g，用水溶解定容于100ml容量瓶中，配制成半乳糖醛酸含量为1g/L的标准母液，稀释成0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.6g/L，0.8g/L标准溶液，采用实施例2的2中的检测方法进行检测，根据检测结果，以半乳糖醛酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制，得到标准曲线。

(2)根据溶液C和溶液D的检测结果，结合标准曲线，计算得到溶液C和溶液D中半乳糖醛酸含量(分别为C_C和C_D)。根据下式计算出烟末的果胶含量(以半乳糖醛酸计)，结果见表2。

其中，

W-烟末中果胶的重量百分数(％)；

C_C-溶液C中半乳糖醛酸的浓度(g/L)；

V_C-溶液C的体积(0.25L)；

C_D-溶液D中半乳糖醛酸的浓度(g/L)；

V_D-溶液D的体积(0.1L)；

M-烟末样品的质量(1g)。

4、用硫酸咔唑法(方法如下)对对溶液C和溶液D进行检测，结果亦列于表2。

移取溶液C和溶液D各1.0mL放入试管中，分别加入6.0mL浓硫酸，边加边用水冷却，冷至室温后加入0.15％咔唑的无水乙醇溶液0.50mL，摇匀，在室温下暗处放置30分钟后，以空白试剂为参比，在530nm处测定其吸光度。

对上面0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.6g/L，0.8g/L的标准溶液采用同上的方法测定吸光度并绘制标准曲线，计算溶液C和溶液D中的半乳糖醛酸含量，进而计算得到烟末中果胶的含量。

表2

本发明方法比硫酸咔唑法更简便、高效，检测结果稳定性更高。两种方法测定的果胶含量有显著性差异，硫酸咔唑法的测量结果偏大，可能与分析过程中的中性还原糖干扰有关。

实施例3加标回收率测定

准确称取两份实施例1烘干后的烟叶1.0g分别置于两个250ml圆底烧瓶中，其中一份中加入0.1g果胶(biosharp分装，含量70％)，其余参照实施例1进行，测得烟叶中的果胶含量和加标烟叶中的果胶含量，计算出加样回收率，进行三次平行试验，结果见表3。

表3

烟叶中果胶含量(％)	果胶加样回收率(％)
		12.2	102.5
12.6	98.4
		12.3	101.3

由表3可知，本发明方法的回收率较高，准确度较高。

对比例1

1、前处理

(1)准确称取实施例1中烘干后的烟叶1.0000g置于250ml圆底烧瓶中，每份样品设四个平行试样。

(2)向烟叶中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液含盐酸的浓度为0.005mol/L，80℃下热回流1小时去除水溶性糖，趁热砂芯漏斗抽滤后，用80℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗烟叶残渣数遍。收集烟叶，待酸解。

(3)向烟叶残渣中加入100ml的0.05mol/L盐酸水溶液，80℃下回流1小时，趁热砂芯漏斗抽滤，收集滤液。

(4)将步骤(3)的滤液用10mol/L的NaOH水溶液调整至pH值为4，定容至250ml，得到溶液E。

2、检测

将溶液E过0.22μm微孔滤膜后，采用液相色谱分析，液相色谱的条件和蒸发光散射检测器的条件同实施例1所示，得到的色谱图如图5所示。

对比图1和图5的检测结果可知，与仅对烟叶进行酸水解得到的溶液相比，本发明对烟叶酸水解得到滤液，滤液进一步用果胶酶水解后，所得溶液中半乳糖醛酸出峰峰型更佳，与前后杂峰能够完全地分离开。

对比例2

1、前处理

(2)向烟叶中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液含盐酸的浓度为0.005mol/L，80℃下热回流1小时去除水溶性糖，趁热砂芯漏斗抽滤后，用80℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗烟叶残渣数遍。收集烟叶，待酶解。

(3)向步骤(2)的烟叶残渣中加入100ml用pH值为4、浓度为0.2mol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液配制的果胶酶酶液，所用果胶酶为山东泰安信得利生物工程有限公司销售的食品级果胶酶，每毫升果胶酶酶液中的酶活为4000U，在50℃水浴下酶解3小时，酶解结束后，沸水浴20分钟，以10000r/min转速离心5分钟，得上清液，定容至100ml，得溶液F。

2、检测

将溶液F用0.22μm微孔滤膜过滤后，采用液相色谱分析，液相色谱的条件和蒸发光散射检测器的条件同实施例1所示，得到的色谱图如图6所示。

对比图2和图6的检测结果可知，与仅对烟叶进行果胶酶水解得到的溶液相比，本发明对烟叶酸水解得到滤渣，滤渣进一步用果胶酶水解后，所得溶液中半乳糖醛酸的出峰峰型更佳，与前后杂峰能够完全分离开。

对比例3

对实施例1中配制的0.5g/L的半乳糖醛酸标准溶液进行液相色谱检测，得到的色谱图如图7所示。

液相色谱条件为：

色谱仪为waters e2695；检测器为waters 2424蒸发光散射检测器；色谱柱为Aminex HPX-87糖分析柱；流动相为乙腈：水＝70:30(V/V)，流动相的流量为0.5ml/min；柱温为40℃；进样量为20μL。

蒸发光散射检测器条件：漂移管温度为40℃；喷雾器处于冷却状态；气体压强为35.0psi；增益为5。

对比图3和图7可知，与对比例3检测条件相比，采用本发明检测条件，所得到半乳糖醛酸色谱峰的峰形有很大的改善。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种测定样品中果胶含量的方法，包括如下步骤：

(1)用酸性醇溶液浸渍样品，分离出残渣；其中，酸性醇溶液的pH值为2～2.52，所述醇溶液选自乙醇溶液、异丙醇溶液和甲醇溶液中的一种或多种，所述醇溶液中醇的重量百分含量为60％～90％，所述样品为烟草和/或烟草制品，浸渍的料液比为1:200～1:10g/mL，浸渍在回流条件下进行，回流温度为60℃～100℃，回流时间为0.5～6小时；

(2)向步骤(1)得到的残渣中加入酸溶液进行水解，分离得到液体和残渣；其中，酸溶液的pH值为1～1.52，所述酸溶液选自盐酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的一种或多种，相当于每克样品的酸溶液用量为80～120mL，水解在回流条件下进行，回流温度为60℃～100℃，回流时间为0.5～6小时；

(3)将步骤(2)得到的液体的pH值调整为3～5，加入第一果胶酶溶液进行酶解，分离得到第一上清液；

(4)向步骤(2)得到的残渣中加入第二果胶酶溶液进行酶解，分离得到第二上清液；其中，第一果胶酶溶液和/或第二果胶酶溶液为含果胶酶的乙酸/乙酸钠缓冲溶液，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的pH值为3～5，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.05～0.3mol/L，每毫升第一果胶酶溶液或每毫升第二果胶酶溶液中的酶活为800～5000U，步骤(3)和/或步骤(4)酶解体系中的酶活为40000～500000U，步骤(4)酶解体系中的酶活为步骤(3)酶解体系中酶活的6～10倍，步骤(3)和/或步骤(4)中，酶解温度为35℃～70℃，酶解时间为0.5～10小时；

(5)可选地，将第一上清液和第二上清液进行混合，得到混合提取液；

(6)采用液相色谱—蒸发光散射检测器对第一上清液、第二上清液或混合提取液中的半乳糖醛酸含量进行测定，或者对由第一上清液、第二上清液或混合提取液定容后得到的液体中的半乳糖醛酸含量进行测定；其中，液相色谱的色谱柱为Aminex HPX-87糖分析柱，流动相由乙腈和水组成，其中乙腈和水的体积比为60～80:20～40，流动相的流速为0.2～1mL/min，柱温为40～55℃；

(7)根据步骤(6)中所述半乳糖醛酸含量的测定结果，计算样品中以半乳糖醛酸计的果胶含量；

其中，步骤(6)中，蒸发光散射检测器的操作条件包括如下i)至iv)中的任意一项或者多项：

i)漂移管温度为35～55℃；

ii)喷雾器为冷却状态；

iii)气体压强为26～42psi；

iv)增益为1～7。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，第i)项中，漂移管温度为45℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，第iii)项中，气体压强为35psi。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，第iv)项中，增益为1或7。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(4)和(6)之间或者步骤(5)和(6)之间，还包括将第一上清液、第二上清液、混合提取液或者由第一上清液、第二上清液或混合提取液定容后得到的液体进行过滤的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，过滤所用滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于如下1)至9)中的任意一项或者多项：

1)步骤(1)中，所述酸性醇溶液的pH值为2～2.3；

2)步骤(1)中，分离的方式为过滤；

3)步骤(1)还包括，在浸渍之前，将样品进行粉碎的步骤；

4)步骤(2)中，所述酸溶液的pH值为1～1.3；

5)步骤(2)还包括，在水解之前，用乙醇溶液洗涤步骤(1)得到的残渣；

6)步骤(3)中，将步骤(2)得到的液体的pH值调整为4；

7)步骤(3)中，通过向步骤(2)得到的液体中加入固体碱或碱溶液调整pH值；

8)步骤(3)和/或步骤(4)中，通过离心进行分离；

9)步骤(3)和/或步骤(4)还包括，在分离之前，将酶解体系中的酶进行灭活的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，第1)项中，步骤(1)中，所述酸性醇溶液的pH值为2.3。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，浸渍的料液比为1:150～1:50g/mL。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，浸渍的料液比为1:100g/mL。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述醇溶液为乙醇溶液。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述醇溶液为醇水溶液。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述醇溶液中醇的重量百分含量为70％～85％。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述醇溶液中醇的重量百分含量为70％、75％、78％、80％或85％。

15.根据权利要求7所述的方法，其中，第2)项中，步骤(1)中，分离的方式为砂芯漏斗过滤。

16.根据权利要求7所述的方法，其中，第3)项中，步骤(1)中，将样品粉碎至粒径为40目。

17.根据权利要求7所述的方法，其中，第4)项中，步骤(2)中，所述酸溶液的pH值为1.3。

18.根据权利要求7所述的方法，其中，第4)项中，步骤(2)中，所述酸溶液为酸水溶液。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，相当于每克样品的酸溶液用量为90～110mL。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，相当于每克样品的酸溶液用量为100mL。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述酸溶液为盐酸溶液。

22.根据权利要求7所述的方法，其中，第5)项中，步骤(2)中，乙醇溶液中乙醇的重量百分含量为60％～90％。

23.根据权利要求7所述的方法，其中，第5)项中，步骤(2)中，乙醇溶液中乙醇的重量百分含量为70％～85％。

24.根据权利要求7所述的方法，其中，第5)项中，步骤(2)中，乙醇溶液中乙醇的重量百分含量为70％、75％、78％、80％或85％。

25.根据权利要求7所述的方法，其中，第5)项中，步骤(2)中，乙醇溶液的温度为70℃～80℃。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)和/或步骤(2)中，回流温度为70℃～90℃，回流时间为1～5小时。

27.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)和/或步骤(2)中，回流温度为70℃或80℃，回流时间为1小时。

28.根据权利要求7所述的方法，其中，第7)项中，步骤(3)中，通过向步骤(2)得到的液体中加入碱溶液调整pH值。

29.根据权利要求7所述的方法，其中，第7)项中，所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

30.根据权利要求7所述的方法，其中，第7)项中，所述碱溶液的浓度为1～10mol/L。

31.根据权利要求7所述的方法，其中，第7)项中，所述碱溶液的浓度为10mol/L。

32.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)或步骤(4)中，每毫升第一果胶酶溶液或每毫升第二果胶酶溶液中的酶活为1000～4000U。

33.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)或步骤(4)中，每毫升第一果胶酶溶液或每毫升第二果胶酶溶液中的酶活为1000U或4000U。

34.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)和/或步骤(4)酶解体系中的酶活为50000～400000U。

35.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)和/或步骤(4)酶解体系中的酶活为50000U或400000U。

36.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)酶解体系中的酶活为步骤(3)酶解体系中酶活的8倍。

37.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)和/或步骤(4)中，酶解温度为45℃～65℃，酶解时间为1～8小时。

38.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)和/或步骤(4)中，酶解温度为45℃、50℃或55℃，酶解时间为1小时、2小时或3小时。

39.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)和/或步骤(4)中，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的pH值为4。

40.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)和/或步骤(4)中，乙酸/乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mol/L。

41.根据权利要求7所述的方法，其中，第8)项中，步骤(3)和/或步骤(4)中，离心转速为8000～12000r/min，离心时间为5～20分钟。

42.根据权利要求7所述的方法，其中，第8)项中，步骤(3)和/或步骤(4)中，离心转速为10000r/min，离心时间为5分钟。

43.根据权利要求7所述的方法，其中，第9)项中，采用沸水浴进行灭活。

44.根据权利要求7所述的方法，其中，第9)项中，灭活时间为10～30分钟。

45.根据权利要求7所述的方法，其中，第9)项中，灭活时间为20分钟。

46.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品选自烟叶、烟丝、烟叶组合物和卷烟中的一种或多种。

47.一种测定半乳糖醛酸的方法，包括采用液相色谱—蒸发光散射检测器测定液态样品中的半乳糖醛酸的步骤；

其中，液相色谱的色谱柱为Aminex HPX-87糖分析柱，流动相由乙腈和水组成，其中乙腈和水的体积比为60～80:20～40，流动相的流速为0.2～1mL/min，柱温为40～55℃；

蒸发光散射检测器的操作条件包括如下i)至iv)中的任意一项或者多项：

i)漂移管温度为35～55℃；

ii)喷雾器为冷却状态；

iii)气体压强为26～42psi；

iv)增益为1～7。

48.根据权利要求47所述的方法，其中，第i)项中，漂移管温度为45℃。

49.根据权利要求47所述的方法，其中，第iii)项中，气体压强为35psi。

50.根据权利要求47所述的方法，其中，第iv)项中，增益为1或7。

51.根据权利要求1或47所述的方法，其中，采用外标法进行测定。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，外标物为半乳糖醛酸。

53.根据权利要求1或47所述的方法，其中，液相色谱的操作条件包括如下的a和/或b项：

a.液相色谱仪为waters e2695；

b.进样量为5～22μL。

54.根据权利要求1或47所述的方法，其中，流动相中，乙腈和水的体积比为60:40。

55.根据权利要求1或47所述的方法，其中，流动相的流速为0.8mL/min。

56.根据权利要求1或47所述的方法，其中，柱温为45℃。

57.根据权利要求53所述的方法，其中，第b项中，进样量为20μL。