CN109521123B - 一种pmp-hplc法在园参与林下参鉴别中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明依据富含半乳糖和阿拉伯糖的伸展蛋白普遍存在于植物细胞壁并随生长年限变化的特点，提供了一种通过PMP‑HPLC法测定园参与林下参中半乳糖和阿拉伯糖的含量，并将二者的测量值与标准模版范围比较进行的鉴别方法。涉及园参与林下参中糖类成分的提取方法以及半乳糖和阿拉伯糖的含量测定，并设置了园参与林下参中2种单糖含量的限定标准模式范围，属于中药材检测技术领域。

Description

一种PMP-HPLC法在园参与林下参鉴别中的应用

技术领域

本发明涉及园参及林下参的鉴别方法，具体涉及利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化-高效液相色谱(PMP-HPLC)法对园参及林下参的鉴别方法，是一种简单、快速、准确的鉴别方法，涉及中药材检测技术领域。

背景技术

人参Panax ginseng C.A.Mey，为五加科多年生植物，干燥根入药。人参药材市场上主要分野生人参、林下参、园参，从植物学上为同一种源。其中，林下参的定义为：播种后，自然生长于深山密林15年以上的人参，由人工将野山参种子播种于林下，没有人为因素，既不移动，又不经任何管理，长期自然生长而成；主要分布在长白山原始森林和大小兴安岭森林中；在野生人参资源日益紧缺甚至濒临灭绝的情况下，这种仿野生栽培的林下参在国内外受到了一致的认可。园参的定义为：经过人工栽植培育而长成的人参，全人工管理下生长发育，培育达5～6年后采收的人参；主要分布在山林坡地，人工制成的参床上。《中国药典》(2015年版一部)中收载了人参(园参)和林下参；《国家卫生部保健食品药食同源原料》中收载的为人参(园参)。

人参因生长年限和环境不同，其各类成分存在差异。从古自今，人们公认，人参生长年限越长，其人参的质量及其有效物质含量越高。一直以来，人们对于人参真伪优劣的鉴别方法上，主要是以人参整体外表形状特征作为依据。近年来，研究者在人参中常见总皂苷含量(一种用近红外光谱技术识别不同生长方式人参及对人参中组分含量测定的方法，专利，CN201410011440)、腺苷含量(林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析，何绍玉等，药物分析杂志，2010，30 (9)1701-1706)、木质素含量(人参木质素量与生长年份关系的研究，李靖等，中草药，2007年，38卷，第一期，105-108)以及挥发油种类(林下参与栽培人参的微量化学鉴别方法，专利，CN200510030084.4)的差异研究等方面做了深入探讨，目的都是要寻找一种园参和林下参的鉴别方法和依据。但在以上的研究中，园参与林下参二者之间的差异并不十分明显，这就需要提出一种有充分依据且效果明显的方法来简单、快速、准确地鉴别园参和林下参。

伸展蛋白是植物细胞壁中的主要蛋白质成分，也称为伸展糖蛋白，它普遍存在于各种植物的细胞壁中。伸展糖蛋白中的糖部分组成主要是半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)，含量为糖蛋白的60％左右。相关文献报道表明，植物在生长旺盛的幼龄期的细胞壁中伸展蛋白含量少，但随着生长速度的迟缓时，伸展蛋白含量明显增加。因此，本发明可通过对人参中Gal和Ara的含量测定值来鉴别园参和林下参。

近年来，在中药材的化学成分研究过程中，越来越重视大分子多糖类成分的信息，并建立与多糖相关的质量控制方法与标准。高效液相色谱法对于PMP衍生化的单糖具有分离效能高，且方法稳定、简便快速，可作为大分子糖类组成的鉴别技术。以PMP-HPLC法建立的单糖组成特征图谱，可有效控制原料药材和制剂质量。本发明利用PMP-HPLC法，通过色谱峰的峰面积来计算Gal和Ara 在人参样品(鉴别样品)中的含量，并限定标准模式范围，从而有效鉴别园参与林下参。

发明内容

本发明提供了一种以PMP-HPLC图谱中Gal和Ara的峰面积计算鉴别样品中2种单糖的含量，与标准模式限定范围比较，鉴别园参或林下参的方法。

本发明所述的人参样品涉及园参、林下参。

本发明所述的定量成分包括人参中的半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)。

本发明技术路线如下：

1.样品的制备：

(1)按常规方法将干燥人参样品切小块，称定后加入纯水，煎煮2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇至80％，离心，取沉淀，干燥即得鉴别样品。

(2)按常规方法将干燥人参样品切成小块，称定后加80％乙醇回流2次，每次2小时，取药渣，加纯水，煎煮2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇至 80％，离心，取沉淀干燥即得鉴别样品。

2.PMP衍生物的制备

对照品PMP衍生物溶液的制备：取各单糖对照品配置混合溶液(0.4mg/mL) 5mL，加0.5mol/LPMP甲醇溶液6mL，加0.3mol/L氢氧化钠溶液5mL，50℃水浴反应0.5h，加0.3mol/L盐酸溶液5mL中和，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层放置过夜，制得对照品PMP衍生物混合溶液。

鉴别样品PMP衍生物溶液的制备：精密称取鉴别样品20mg，加入2mol/L 三氟乙酸(TFA)于100℃水解8h，干燥后加纯水10mL溶解，即得多糖水解液，衍生化方法同上，制得样品PMP衍生物溶液。

3.测定方法

(1)分别取对照品和鉴别样品PMP衍生物溶液，采用高效液相色谱法进行单糖组成分析。

(2)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱(C18， 4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为磷酸盐缓冲液(PH6.8)-乙腈(85:15，v/v)；流动相B为磷酸盐缓冲液(PH6.8)-乙腈(60:40，v/v)；流速为0.9mL/min；检测波长为250nm，进样量为10μL；梯度洗脱条件见表1：

表1、色谱洗脱条件

(3)按2015版《中国药典》通则0512高效液相色谱(HPLC)法测定，记录色谱图，测量对照品(附图1)和鉴别样品(附图2～19)中单糖成分的峰面积，按下式计算鉴别样品中单糖的含量W。

式中：W_X为鉴定样品中单糖的含量(mg/g)；

A_X为鉴定样品中单糖的峰面积(μV·min)；

A_R为对照品的峰面积(μV·min)；

C_R为对照品的浓度(mg/mL)；

V_样为鉴定样品溶液的定容体积(mL)；

m_样为鉴定样品的质量(mg)。

4.样品的鉴别

通过步骤3获得对照品和已知样品的PMP-HPLC图谱，确定其中半乳糖 (Gal)、阿拉伯糖(Ara)的主峰，分别计算2种单糖的含量，分别设定园参与林下参的标准模式限定范围。

(1)园参(为整体人参，包括(或)芦头、主根、侧根、须根)

PMP-HPLC图谱按公式(1)计算样品中Gal和Ara的单糖含量，以Gal和 Ara含量确定园参标准模式限定范围：

Gal含量范围：10.00～28.00mg/g；

Ara含量范围：10.00～45.00mg/g。

(2)林下参(为整体人参，包括(或)芦头、主根、侧根、须根)

PMP-HPLC图谱按公式(1)计算样品中Gal和Ara的单糖含量，以Gal和 Ara含量确定林下参标准模式限定范围：

Gal含量范围：28.00～100.00mg/g；

Ara含量范围：45.00～120.00mg/g。

采用相同方法处理未知鉴别样品并计算含量，然后将计算值与标准模式限定范围进行比较，即可鉴别该样品为园参或林下参。

本发明对药材商品中园参和林下参中Gal和Ara单糖的含量进行分析，不同于现行国家药典的常规检查方法，具有较大的实用价值。

本发明采用常规方法将人参中的多糖类成分提取，得到鉴别样品，经过PMP 衍生化后，对供试品进行HPLC分析，以所获得的图谱计算其中Gal和Ara的含量，再与所规定的标准模式限定范围比较，即可达到鉴别园参与林下参的目的。

本发明对水提醇沉或醇回流后水提醇沉方法制备的人参样品均可鉴别，对整体人参或人参各部位(芦头、主根、侧根、须根)均可鉴别。

本发明鉴别园参和林下参的方法简单、快速、准确，将为中药行业带来较大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1建立标准模式限定范围用混合对照品的液相色谱图

图2白山抚松县4年人参鉴别样品的液相色谱图

图3白山抚松县5年人参鉴别样品的液相色谱图

图4延边额穆镇4年人参鉴别样品的液相色谱图

图5延边额穆镇5年人参鉴别样品的液相色谱图

图6白山东岗镇4年人参鉴别样品的液相色谱图

图7白山东岗镇5年人参鉴别样品的液相色谱图

图8通化集安市4年人参鉴别样品的液相色谱图

图9通化集安市5年人参鉴别样品的液相色谱图

图10延边敦化市4年人参鉴别样品的液相色谱图

图11延边敦化市5年人参鉴别样品的液相色谱图

图12白山临江市4年人参鉴别样品的液相色谱图

图13白山临江市5年人参鉴别样品的液相色谱图

图14吉林蛟河市4年人参鉴别样品的液相色谱图

图15吉林蛟河市5年人参鉴别样品的液相色谱图

图16吉林桦甸市4年人参鉴别样品的液相色谱图

图17吉林桦甸市5年人参鉴别样品的液相色谱图

图18通化辉南县4年人参鉴别样品的液相色谱图

图19通化辉南县5年人参鉴别样品的液相色谱图

图20延边珲春市4年人参鉴别样品的液相色谱图

图21延边珲春市5年人参鉴别样品的液相色谱图

图22白山靖宇县4年人参鉴别样品的液相色谱图

图23白山靖宇县5年人参鉴别样品的液相色谱图

图24白山抚松县15年人参鉴别样品的液相色谱图

图25通化辉南县15年人参鉴别样品的液相色谱图

图26通化辉南县18年人参鉴别样品的液相色谱图

图27通化集安市18年人参鉴别样品的液相色谱图

图28白山抚松县20年人参鉴别样品的液相色谱图

图29通化集安市20年人参鉴别样品的液相色谱图

图30人参鉴别样品中Gal和Ara含量关系图

图31鉴别样品用混合对照品的液相色谱图

图32水提鉴别样品1的液相色谱图

图33水提鉴别样品2的液相色谱图

图34园参芦头水提样品的液相色谱图

图35园参须水提样品的液相色谱图

图36醇提鉴别样品1的液相色谱图

图37醇提鉴别样品2的液相色谱图

具体实施方式

实施例1：设定园参与林下参鉴别的标准模式限定范围

1.仪器与试剂

仪器：烘箱(博讯GZX-9076MBE)、离心机(湘仪TD5A-ws)、高效液相色谱仪(安捷伦1260Infinity II)。

试剂：无水乙醇，PMP，氢氧化钠，盐酸，三氯甲烷，三氟乙酸。

2.样品来源

所用的人参及林下参样品均采购自吉林省各地，见表2。

3.样品的制备

(1)取干燥人参样品适量(一般为一颗人参)，切成小块后加入纯水，煎煮 2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇至溶液为80％，离心，取沉淀，干燥即得。

(2)精密称取鉴别样品20mg，同行对照品(0.4mg/mL)，加入2mol/LTFA 于100℃水解8h，干燥后加纯水10mL溶解，即得多糖水解液，加0.5mol/LPMP 甲醇溶液6mL，加0.3mol/L氢氧化钠溶液5mL，50℃水浴反应0.5h，加0.3mol/L 盐酸溶液5mL中和，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层放置过夜，即得。

4.实验条件

(1)色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱(C18，4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为磷酸盐缓冲液(PH6.8)-乙腈(85:15，v/v)；流动相B为磷酸盐缓冲液(PH6.8)-乙腈(60:40，v/v)；流速为0.9mL/min；检测波长为250nm；进样量为10μL。

梯度洗脱条件为

5.实验结果

(1)色谱图

由上述实验条件下得到的对照品HPLC色谱图，见图1。

由上述实验条件下得到的园参HPLC色谱图，见图2～13。

结果表明，与对照品图谱对比，园参图谱中主峰有半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)构成。

由上述实验条件下得到的林下参HPLC色谱图，见图14～19。

结果表明，与对照品图谱对比，林下参图谱中主峰有半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)构成。

(2)含量计算

以上实验所得22批园参(44个样品，样品编号1～44)和6批林下参(30 个样品，样品编号45～74)的HPLC图谱，以色谱图中4个共有主峰中Gal和 Ara的标准品(表3)，按照公式(1)计算其含量，如表4所示。将本次测量计算得到的已知鉴别样品的含量作为设置限定标准模式范围的依据。

表3、设置限定标准模式范围用混合对照品进样浓度及峰面积

HPLC图谱中，峰1为半乳糖醛酸；峰2为葡萄糖；峰3为半乳糖；峰4为阿拉伯糖。

表4、人参样品中Gal和Ara的含量

6.标准模式限定范围

以人参样品中的Gal含量为横坐标，Ara含量为纵坐标作图，见图30。

图中园参样品(○)集中在左下部分，林下参样品(△)分布在右上部分，并且2种单糖的含量成正相关。

根据上述实验结果设置园参与林下参鉴别的标准模式限定范围。

(1)园参(为整体人参，包括(或)芦头、主根、侧根、须根)

PMP-HPLC图谱按公式(1)计算样品中Gal和Ara的单糖含量，以Gal和 Ara含量确定园参标准模式限定范围：

Gal含量范围：10.00～28.00mg/g；

Ara含量范围：10.00～45.00mg/g。

(2)林下参(为整体人参，包括(或)芦头、主根、侧根、须根)

PMP-HPLC图谱按公式(1)计算样品中Gal和Ara的单糖含量，以Gal和 Ara含量确定林下参标准模式限定范围：

Gal含量范围：28.00～100.00mg/g；

Ara含量范围：45.00～120.00mg/g。

由图谱计算样品中Gal和Ara的含量与标准模式范围比较，可有效鉴别林下参和园参。

实施例2：园参与林下参水提样品的鉴别

1.仪器与试剂

同实施例1。

2.样品来源

随机从自购园参样品和林下参样品中各取一颗。

3.样品制备

(1)取干燥人参样品适量(一颗人参)，切成小块后加入纯水，煎煮2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇至溶液为80％，离心，取沉淀，干燥即得鉴别样品。

(2)采取上述方法分别制备园参样品和林下参样品，随机命名为水提鉴别样品1和水提鉴别样品2.

4.实验条件

同实施例1。

5.实验结果

(1)色谱图

由上述实验条件下得到的对照品HPLC色谱图，见图31。

由上述实验条件下得到的水提鉴别样品1和水提鉴别样品2的HPLC色谱图，见图32和图33。

结果表明，与对照品图谱对比，水提鉴别样品的图谱中主峰均由GalA、Glc、 Gal、Ara构成。

(2)含量计算

以上实验所得水提鉴别样品1和水提鉴别样品2的HPLC图谱，以色谱图中 4个共有主峰中Gal和Ara的标准品，见表5。按照公式(1)计算其含量，见表 6。

表5、鉴别用混合对照品进样浓度及峰面积

表6、鉴别样品中Gal和Ara的含量

6样品鉴别

经过计算水提鉴别样品1中Gal的平均含量为17.78mg/g，Ara的平均含量为26.24mg/g，二者均在园参的标准模式限定范围内；水提鉴别样品2中Gal的平均含量为51.58mg/g，Ara的平均含量为61.10mg/g，二者均在林下参的标准模式限定范围内。

综上所述，水提鉴别样品1鉴定为园参，水提鉴别样品2鉴定为林下参。

实施例3：园参芦头和园参须水提样品的鉴别

1.仪器与试剂

同实施例1。

2.样品来源

自购园参样品若干。

3.样品制备

(1)取干燥园参芦头样品适量(约一颗人参的量)，切成小块后加入纯水，煎煮2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇至溶液为80％，离心，取沉淀，干燥即得园参芦头鉴别样品。

(2)取干燥园参须样品适量(约一颗人参的量)，切成小块后加入纯水，煎煮2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇至溶液为80％，离心，取沉淀，干燥即得园参须鉴别样品。

4.实验条件

同实施例1。

5.实验结果

(1)色谱图

由上述实验条件下得到的对照品HPLC色谱图，见图31。

由上述实验条件下得到的园参芦头鉴别样品和园参须鉴别样品的HPLC色谱图，见图34和图35。

结果表明，与对照品图谱对比，园参芦头与园参须鉴别样品的图谱中主峰均由GalA、Glc、Gal、Ara构成。

(2)含量计算

以上实验所得园参芦头鉴别样品和园参须鉴别样品的HPLC图谱，以色谱图中4个共有主峰中Gal和Ara的标准品，见表5。按照公式(1)计算其含量，见表6。

6.样品鉴别

经过计算园参芦头鉴别样品中Gal的平均含量为18.90mg/g，Ara的平均含量为28.82mg/g，二者均在园参的标准模式限定范围内；园参须鉴别样品中Gal 的平均含量为20.85mg/g，Ara的平均含量为29.39mg/g，二者均在园参的标准模式限定范围内。

综上所述，园参芦头鉴别样品和园参须鉴别样品均鉴定为园参。

实施例4：园参与林下参醇提样品的鉴别

1.仪器与试剂

同实施例1。

2.样品来源

同实施例1。

3.样品制备

(1)取干燥人参样品适量(一颗园参)，切成小块后加入80％乙醇回流2 次，每次2小时，醇提后的人参渣加纯水，煎煮提取2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇沉淀，取沉淀，干燥即得鉴别样品。

(2)采取上述方法分别制备园参样品和林下参样品，随机命名为醇提鉴别样品1和醇提鉴别样品2.

4.实验条件

同实施例1。

5.实验结果

(1)色谱图

由上述实验条件下得到的对照品HPLC色谱图，见图31。

由上述实验条件下得到的醇提鉴别样品1和醇提鉴别样品2的HPLC色谱图，见图36和图37。

结果表明，与对照品图谱对比，醇提鉴别样品的图谱中主峰均由GalA、Glc、 Gal、Ara构成。

(2)含量计算

以上实验所得醇提鉴别样品1和醇提鉴别样品2的HPLC图谱，以色谱图中 4个共有主峰中Gal和Ara的标准品，见表5。按照公式(1)计算其含量，见表 6。

6.样品鉴别

经过计算醇提鉴别样品1中Gal的平均含量为26.12mg/g，Ara的平均含量为35.93mg/g，二者均在园参的标准模式限定范围内；醇提鉴别样品2中Gal的平均含量为61.41mg/g，Ara的平均含量为73.43mg/g，二者均在林下参的标准模式限定范围内。

综上所述，醇提鉴别样品1鉴定为园参，醇提鉴别样品2鉴定为林下参。

Claims (6)

1.一种鉴别园参与林下参的方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化-高效液相色谱PMP-HPLC，包括样品制备、样品分析和样品鉴定，其特征在于：通过水提醇沉的方法制备人参样品；再采用PMP对人参样品进行衍生化，得到供试品；通过HPLC测定供试品中半乳糖Gal和阿拉伯糖Ara的含量；建立标准模式限定范围，用来鉴别未知样品；

所述制备人参样品的方法为下列(1)或(2)之一的制备方法：

(1)按照常规方法将干燥人参切成小块的试样称定后，加入纯水，煎煮提取2次，每次2小时，过滤，浓缩，加入乙醇沉淀，离心，取沉淀干燥，即得鉴别样品；

(2)按照常规方法将干燥人参切成小块的试样称定后，加入80％乙醇回流2次，每次2小时，人参药渣加纯水，煎煮提取2次，每次2小时，过滤，浓缩，加乙醇沉淀，取沉淀干燥，即得鉴别样品。

2.如权利要求1所述鉴别园参与林下参的方法，其特征在于样品PMP衍生化供试品的制备方法为：精密称取鉴别样品20mg，加2mol/L三氟乙酸TFA于100℃水解8h，吹干后加入纯水10mL溶解，即得水解液；加0.5mol/LPMP甲醇溶液6mL，加0.3mol/L氢氧化钠溶液5mL，50℃水浴反应0.5h，加0.3mol/L盐酸溶液5mL中和，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层放置过夜，即得鉴别样品PMP衍生化供试品。

3.如权利要求1所述鉴别园参与林下参的方法，其特征在于HPLC法对PMP衍生化供试品进行分析的方法为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相A是PH6.8为磷酸盐缓冲液：乙腈＝85:15，v/v；流动相B是PH为6.8的磷酸盐缓冲液：乙腈＝60:40，v/v；流速为0.9mL/min；检测波长为250nm；进样量为10μL；梯度洗脱步骤如下：

4.如权利要求1所述鉴别园参与林下参的方法，其特征在于所述的建立标准模式限定范围，其特征是：按2015版《中国药典》通则0512高效液相色谱HPLC法测定，记录色谱图，测量对照品和供试品中Gal、Ara成分的峰面积，按下式计算鉴别样品中单糖的含量Wx；

式中：W_X为鉴定样品中单糖的含量mg/g；

A_X为鉴定样品中单糖的峰面积μV·min；

AR为对照品的峰面积μV·min；

CR为对照品的浓度mg/mL；

V样为鉴定样品溶液的定容体积mL；

m样为鉴定样品的质量mg。

5.如权利要求1所述鉴别园参与林下参的方法，其特征在于所建立的标准模式限定范围，其特征是：Gal、Ara标准模式限定范围为：

园参为整体人参，包括芦头、主根、侧根、须根：

Gal含量范围：10.00～28.00mg/g；

Ara含量范围：10.00～45.00mg/g；

林下参为整体人参，包括芦头、主根、侧根、须根：

Gal含量范围：28.00～100.00mg/g；

Ara含量范围：45.00～120.00mg/g。

6.如权利要求5所述的鉴别园参与林下参的方法，其特征在于在样品鉴别时，所选择PMP-HPLC图谱中的Gal、Ara色谱峰，为园参与林下参样品所共有；图谱中Gal、Ara的含量均应符合园参和林下参所规定的标准模式范围。

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