CN109674917A - 一种响应面法优化乌拉草总黄酮的提取工艺及其抗氧化用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种响应面法优化乌拉草总黄酮的提取工艺及其抗氧化功能。利用乙醇浓度、液料比、提取时间及提取温度为单因素，总黄酮的提取率（%）为响应值，通过响应面设计试验对提取工艺进行优化，得到最佳工艺为乙醇浓度49.40%，液料比30.49 mL/g，提取时间91 min，提取温度71℃，最高提取率为6.248%，乌拉草总黄酮的实际提取率为6.24%±0.04%；运用LC‑MS联用进行定性分析，推测乌拉草中可能含儿茶素、芦丁、荭草苷、木樨草素‑7‑o‑ß‑D‑葡萄糖醛酸和木犀草素等5种化合物；并对总黄酮抗氧化活性进行研究，发现其具有一定的清除羟基、ABTS和DPPH自由基的清除能力，IC50分别为0.232、0.012、0.026mg/mL，说明具有较为显著的抗氧化能力。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，涉及一种响应面法优化提取乌拉草总黄酮的方法及其抗氧化方面的用途。
背景技术
乌拉草（Carex meyeriana Kunth）是多年生草本植物,莎草科薹草属（Carex L.），主要生长在黑龙江、吉林、内蒙古、四川等地，与当地的人参、貂皮并称为“东北三宝”，能够主动吸附湿气，具有良好的吸附能力，自身却不易受到侵蚀，使其一年四季均可使用。据文献记载，乌拉草拥有有奇特的保暖功能以及透气、防寒、抑菌等功能。将乌拉草本身作为鞋内衬垫物的历史可以追述到几百年前，以前，东北地区的居民用经常动物皮毛制鞋，将处理后的乌拉草内絮于鞋内，制作防寒鞋，其是北方贫苦人民十分钟爱的“草履”。每年秋季，他们便到山上采摘乌拉草，晒干后储存，到冬天时塞到鞋里，可用于保暖，避免脚冻伤后生出冻疮。现已经广泛应用于纤维制品的制作，也适于脚癣、脚气等各种脚部疾病的的预防和治疗。但对其化学成分和机理的研究较少。植物中常见的化学成分为黄酮、多糖、生物碱和皂苷等化学成分。
文献报道天然产物中黄酮化合物的提取方法主要有热回流提取、超声波辅助提取、微波辅助提取、酶辅助提取，超临界流体萃取以及双水相体系萃取等提取方法，其中最常见的提取方法有乙醇提取法和超声波、微波辅助提取法。黄酮化合物的提取率和化学成分受很多因素的影响，常采用正交实验法或者响应面分析法来优化提取工艺，确定最佳提取条件。
目前，对乌拉草黄酮化合物的研究较少，余克娇在2005年对乌拉草的黄酮化合物展开研究，并从乌拉草中首次分离得到木犀草素，为乌拉草的开发与研究奠定了基础。至今对乌拉草黄酮化合物的研究较少，未见使用响应面分析法对乌拉草总黄酮的提取工艺进行优化及结构和功能方面进行相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种响应面法优化提取总黄酮制备的方法及其在抗氧化方面的用途。
为了解决上述技术间題，本发明提供了如下的技术方案：
一种响应面法优化提取乌拉草总黄酮的方法，包括如下步骤：
（1）乌拉草干燥、粉碎，得到乌拉草粉末，过40目药典筛。
（2）乌拉草粉末用乙醇提取，提取液浓缩干燥，测定干浸膏的总黄酮含量。
（3）选择乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度四个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度的最优水平，以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，分别编码-1、0、1，根据Bx－Benhnken设计原则进行四因素响应面实验设计，以乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度为自变量，以总黄酮含量为响应值，建立总黄酮含量的多元二次方程：
（4）对步骤（3）建立的多元二次方程进行响应面分析，取总黄酮含量为最大值，得出最优的提取条件。
2．根据权利求1所述的方法，其特征在于：在步骤（3）中，以乙醇浓度A、液料比B、提取时间C、提取温度D四个因素为自变量，以总黄酮含量Y为响应值，建立的多元二次方程为：
Y=6.23-0.23*A+0.19*B+0.096*C+0.12*D-0.45*A*B+0.11*A*C-0.012*A*D-0.031*B*C+0.032*B*D-0.038*C*D-2.08*A2-2.18*B2-1.92*C2-1.78*D2
3．根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）提取时，乙醇浓度30%~70%、时间为30~120min、料液比为1：10~50、温度40~80℃。
4．根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）乙醇浓度50%、时间为90min、料液比为1：30、温度70℃。
5.通过解析质谱离子碎片，初步判断含有儿茶素、芦丁、荭草苷、木樨草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸和木犀草素5钟黄酮类化合物。
6.本发明的用途是提供所述的提取工艺制得的乌拉草黄酮具有抗氧化活性及其产品中的应用。
附图说明：
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为乙醇浓度对总黄含量的影响曲线
图2为提取时间对总黄含量的影响曲线
图3为料液比对总黄制含量的影响曲线
图4为提取温度对总黄酮含量的影响曲线
图5为乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度对总含量的响应面三维图。
图6总黄酮和VC清除羟基自由基的能力图
图7总黄酮和VC对ABTS自由基清除率图
图8总黄酮和VC对DPPH自由基清除率图
具体实施方式
实施例1
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所述的优选实例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
（1）乌拉草干燥、粉碎，得到乌拉草粉末，过40目药典筛。
（2）乌拉草粉末用乙醇提取，提取液浓缩干燥，测定干浸膏的总黄酮含量。
（3）选择乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度四个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度的最优水平，以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，分别编码-1、0、1，根据Bx－Benhnken设计原则进行四因素响应面实验设计，以乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度为自变量，以总黄酮含量为响应值，建立总黄酮含量的多元二次方程：
（4）对步骤（3）建立的多元二次方程进行响应面分析，取总黄酮含量为最大值，得出最优的提取条件。
总黄酮含量测定方法：
将乌拉草的醇提取液过滤后，转移至量筒中，准确测定其体积，作为乌拉草总黄酮含量测定备用的原液。用移液管移取原液1 mL加入到试管中，加入5%的NaNO2的水溶液0.30 mL，充分摇晃，静置反应6 min之后，再分别加入将0.30 mL的10%的Al(NO3)3的水溶液，摇晃，使其充分反应后，静置反应6 min，最后再加入4.00 mL的4%的NaOH的水溶液，再使用体积分数为80%乙醇溶液定容至10.00 mL，充分摇晃，静置15 min后，以体积分数为80%乙醇溶液做空白参比空白调零，在510 nm的波长处，使用紫外分光光度计测待测组分的吸光度。
以芦为标准品，根据吸光度（Y）和浓度（X）的回归方程：y＝14．548x－0．0113，
R2＝0．9997计算浓度，总黄酮含量=总黄酮质量/乌拉草粉末质量。
单因素实验结果
乙醇浓度对乌拉草总黄酮提取率的影响
准确称取5 g的乌拉草，以提取温度50 ℃，料液比为20 mL/g，提取时间60 min，乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%进行回流提取。考察乙醇浓度对黄酮含量的影响。结果见图1，乙醇浓度达到50%的时候达到最大。
提取时间对乌拉草总黄酮提取率的影响
准确称取5 g的乌拉草，以乙醇浓度为50%，液料比使用20 mL/g，提取的温度保持50℃，改变提取时间进行单因素实验，选取5组提取时间，分别为30、60、90、120、150 min进行回流提取，考察提取时间对黄酮含量的影响。结果见图2，提取时间达到90 min的时候达到最大。
液料比对乌拉草总黄酮提取率的影响
准确称取5 g的乌拉草，以乙醇浓度为50%，提取时间90 min，提取温度50 ℃不变，改变液料比提取温度进行单因素实验，选取5组液料比，分别为10、20、30、40、50 mL/g进行回流提取，考察料液比对黄酮含量的影响。结果见图3，液料比达到30 g/mL的时候达到最大。
提取温度对黄酮含量的影响
准确称取5 g的乌拉草，以乙醇浓度为50%，提取时间用90 min，液料比50 mL/g不变，改变提取温度进行单因素实验，选取5组提取温度作为实验变量，分别为40、50、60、70、80 ℃进行回流提取，考察提取温度对黄酮含量的影响。结果见图4，当温度达到60 ℃时，提取率达到最大。
响应面法优化设计
根据单因素实验结果的确定的乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度最优水平，并以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，分别编码-1、0、1，具体因素水平设置见表1。
表1 响应面试验因素水平设计
利用 Design-Expert．软件根据X-Behnken设计原则进行四因素三水平实验设计，实验方案设计与响应值结果见表2回期方程方差分析见表3
表2响应曲面设计方案以及响成值
以乙醇浓度A、液料比B、提取时间C、提取温度D为自变量，以总黄酮含量为响应值Y，建立多元二次方程：Y=6.23-0.23*A+0.19*B+0.096*C+0.12*D-0.45*A*B+0.11*A*C-0.012*A*D-0.031*B*C+0.032*B*D-0.038*C*D-2.08*A2-2.18*B2-1.92*C2-1.78*D2；
表3 黄酮含量回归方程的方差分析
** 极其显著 *显著
利用Design-Expert软件对多元二次回归方程进行响应面分析，得到回归方程的响应面及其等高线图，见图5
总黄酮含量：由表3展示的方差结果进行进一步分析，实验过程中的各个因素与响应目标值之间存在的复杂的交互影响关系。本文从整体模型可以看出A2、B2、C2及D2极其显著，一次项因子中A显著，交互项中AB交互影响显著，而其它项不显著。通过p值比较发现单因素对模型的影响顺序为乙醇浓度>液料比>提取时间>提取温度。根据模型的确定系数R2=0.9768可知，模型的可靠性较好，可以用来解释97.68%的数据。由该使用模型的失拟项p=0.1779>0.05可已看出，该模型的失拟检验是极其不显著的，实验结果说明了与之相对应的多项式进行拟合推测出来的理论数值之间有可以表现出极强的相关性。该模型预测在参数允许的范围内是可靠和可重复的。方差分析的结果表明，模型的精密度19.340>4，意味着该模型公式在乙醇浓度、液料比、提取温度及提取时间的任何组合之后都能够进行预测。从实验室数据来看，该模型适用于乌拉草总黄酮的提取结果的分析和预测。
最优条件验证试验
通过对拟合的线性方程进行更深层次的分析，最终通过软件分析给出最佳提取参数（编码制下提取参数：-0.060、0.049、0.022、0.035），即乙醇浓度49.40%，液料30.49 mL/g，提取时间90.67 min，提取温度70.35 ℃，在最佳提取条件下，理论应得到乌拉草总黄酮的提取率为6.248%。
为了验证模型预测的准确性，修正最佳提取参数：乙醇浓度是49.40 %，液料比是30.49mL/g、提取时间是90 min、提取温度是70℃，用优化后的最好的提取条件，进行重复试验，重复次数三次，分别得到乌拉草粗黄酮的提取率为6.17%、6.04%、6.53%。三次实验所得黄酮提取率的最终值值为6.24%±0.04%。可见，实验的结果与软件提供的预测的值基本上是相同的，说明了实验所用的模型对乌拉草总黄酮的提取是适用的，为将来乌拉草的发展奠定了一定的理论基础。
实施例2
乌拉草黄酮化合物LC-MS联用分析
供试品溶液的制备
精密称定乌拉草黄酮适量，用少量的乙腈溶解配置成一定浓度的待测样液后备用，进样前储备液用0.45um的微孔滤膜滤过，利用液质联用技术对黄酮类物质进行分析、鉴别。
色谱及质谱条件
液相色谱条件：Symmetry® C18 (5μm，4.6×250mm)，进样量5μL，流动相洗脱程序见表4。
质谱条件：ESI源喷射电压设置为4000 V，源温度（TEM）300 ℃，干燥气体体积流量为1L/min，雾化气的压力30 psi，辅助气的压力 60 psi，接口处持续加热，采用飞行时间质谱检测器。
表4 流动相洗脱系统程序表
表5乌拉草黄酮LC-MS分析结果
实施例3
最佳提取参数下乌拉草总黄酮抗氧化研究
取最佳条件下提取的乌拉草总黄酮提取液，测其黄酮含量为0.069 mg/mL的原液，配置为0.05 mg/mL的储备液，然后把储备液每隔0.1 mg/mL（清除羟基自由基和清除ABTS自由基）和0.01 mg/mL（清除DPPH自由基）为一个梯度，依次稀释成5个浓度后备用。取VC供试品，配成0.1 mg/mL的VC储备溶液，然后把储备液每隔0.2 mg/mL和0.02 mg/mL为一个梯度，依次稀释成5个浓度后备用。实验重复三次。
清除羟基自由基能力测定
取0.75 mmol/L邻二氮菲1 ml置于试管中，加PBS（pH 7.40）2 ml，蒸馏水1 ml，充分混匀，加0.75 mmol/L硫酸亚铁1 ml，混匀，加质量吸光度在536 nm处测定，并且在536 nm处测量吸光度。用蒸馏水代替H2O2测定吸光度。0.05、0.15 、0.25 、0.5 、0.75mg/ml不同浓度的乌拉草黄酮溶液代替蒸馏水1 ml，测定其吸光度As值。计算各样品中羟基自由基的清除率：清除能力（％）= [（A2-A1）/（A0-A1）] * 100％，其中A0为不含H2O2或样品的反应混合物的吸光度，A1为反应的吸光度H2O2与样品的混合物，A2与H2O2和样品的反应混合物的吸光度。
如图6所示，随着浓度的增加，清除羟基自由基的能力增强，乌拉草粗黄酮和VC中粗黄酮的IC50值分别为0.232 mg/ml和0.208 mg/ml。结果表明，乌拉草粗黄酮具有显著的抗氧化活性。
清除ABTS自由基能力的测定
取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88μl 140 mmol/L过硫酸钾溶液，混合后，在室温黑暗条件下放置过夜，在12~16 h之间即可，从而形成了ABTS的自由基储备液，在用1:70比例的蒸馏水稀释，成为ABTS自由基工作液，使之在室温条件下，于734 nm波长处测得的吸光度值为0.7±0.02。精密移取0.005、0.01、0.016 、0.032 、0.07mg/ml不同质量浓度的自提样液2.0mL于试管中，分别加入ABTS和测定液2.0 mL。准确震荡10 s，静置6 min后，于734 nm处测得吸光度Ai。同时移取无水乙醇和ABTS 2.0 mL于试管中，按同样方法处理，测得A0。并用同浓度梯度的VC代替乌拉草黄酮溶液作阳性对照计算清除率。
图7显示了乌拉草粗黄酮和VC粗黄酮的ABTS自由基清除活性。结果表明，二者均随浓度的增加而增加，乌拉草粗黄酮和VC粗黄酮的IC50值分别为0.012mg/ml和0.003 mg/ml。
清除DPPH自由基能力的测定
样品溶液取2.0 mL（0.005、0.01、0.015、0.035、0.07mg/mL），加入2.0 mL浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液（用无水乙醇配制）混合，在室温条件下黑暗中反应30 min（用保鲜膜封口）。于517 nm下测定吸光度值，记为Ai，并以2.0 mL无水乙醇和2.0 mL蒸馏水作为空白组调零，以2.0 mL样品溶液加上2.0 mL无水乙醇作为空白对照组，其在517 nm处的测得的吸光度值为Aj，空白对照组的作用是为了去除黄酮样品本身存在的吸光度，2.0 mL DPPH溶液加上2.0 mL无水乙醇作为模型对照组，在517 nm处测得的吸光度值记为A0。
图8显示了乌拉草和VC粗黄酮的DPPH自由基清除活性。结果表明，乌拉草粗黄酮和VC粗黄酮的DPPH自由基清除活性均随浓度的增加而增加。相比之下，乌拉草粗黄酮的增加相对缓慢，乌拉草粗黄酮和VC粗黄酮的IC50值分别为0.026 mg/ml和0.004 mg/ml。
通过以乌拉草为原料，使用乙醇回流提取其总黄酮，并利用响应面法优化其提取工艺路线，初步运用LC-MS/MS联用技术进行初步定性分析，推测乌拉草中可能含5种黄酮化合物。并发现乌拉草总黄酮具有一定的清除羟基、ABTS和DPPH自由基能力，为乌拉草黄酮的进一步开发提供一定的技术支持。对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所述的优选实例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
Claims (8)
1.一种响应面法优化提取乌拉草总黄酮的方法及其抗氧化用途
包括如下步骤：
（1）乌拉草干燥、粉碎，得到乌拉草粉末，过40目药典筛。
2.乌拉草粉末用乙醇提取，提取液浓缩干燥，测定干浸膏的总黄酮含量。
3.选择乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度四个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度的最优水平，以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个水平值作为响应面的水平，分别编码-1、0、1，根据Bx－Benhnken设计原则进行四因素响应面实验设计，以乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度为自变量，以总黄酮含量为响应值，建立总黄酮含量的多元二次方程：
（4）对步骤（3）建立的多元二次方程进行响应面分析，取总黄酮含量为最大值，得出最优的提取条件。
4.根据权利求1所述的方法，其特征在于：在步骤（3）中，以乙醇浓度A、液料比B、提取时间C、提取温度D四个因素为自变量，以总黄酮含量Y为响应值，建立的多元二次方程为：
Y=6.23-0.23*A+0.19*B+0.096*C+0.12*D-0.45*A*B+0.11*A*C-0.012*A*D-0.031*B*C+0.032*B*D-0.038*C*D-2.08*A2-2.18*B2-1.92*C2-1.78*D2 。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）提取时，乙醇浓度30%~70%、时间为30~120min、料液比为1：10~50、温度40~80℃。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）乙醇浓度50%、时间为90min、料液比为1：30、温度70℃。
7.通过解析质谱离子碎片，初步判断含有儿茶素、芦丁、荭草苷、木樨草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸和木犀草素5钟黄酮类化合物。
8.本发明的用途是提供所述的提取工艺制得的乌拉草黄酮具有抗氧化活性及其产品中的应用。
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| CN (1) | CN109674917B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112326567A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-02-05 | 天津科技大学 | 一种西葫芦抗氧化活性成分的优化提取方法及抗氧化活性的验证方法 |
| CN112438400A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-03-05 | 吉林化工学院 | 一种乌拉草总黄酮纯化方法及其用途 |
| CN112516232A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-19 | 长春中医药大学 | 抗菌、抗炎、抗氧化的乌拉草提取物及制备方法和应用 |
| CN114404508A (zh) * | 2022-02-23 | 2022-04-29 | 吉林农业科技学院 | 一种乌拉草提取物的制备方法 |
| CN115155101A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-10-11 | 甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所(甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所) | 一种甜高粱总黄酮最佳提取方法及抗氧化性评价方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106236867A (zh) * | 2016-08-30 | 2016-12-21 | 新疆医科大学 | 一种响应面法优化提取卡西卡甫枣总黄酮的方法 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106236867A (zh) * | 2016-08-30 | 2016-12-21 | 新疆医科大学 | 一种响应面法优化提取卡西卡甫枣总黄酮的方法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112326567A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-02-05 | 天津科技大学 | 一种西葫芦抗氧化活性成分的优化提取方法及抗氧化活性的验证方法 |
| CN112438400A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-03-05 | 吉林化工学院 | 一种乌拉草总黄酮纯化方法及其用途 |
| CN112516232A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-19 | 长春中医药大学 | 抗菌、抗炎、抗氧化的乌拉草提取物及制备方法和应用 |
| CN114404508A (zh) * | 2022-02-23 | 2022-04-29 | 吉林农业科技学院 | 一种乌拉草提取物的制备方法 |
| CN115155101A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-10-11 | 甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所(甘肃省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所) | 一种甜高粱总黄酮最佳提取方法及抗氧化性评价方法 |
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