CN112438400A - 一种乌拉草总黄酮纯化方法及其用途 - Google Patents
一种乌拉草总黄酮纯化方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种乌拉草总黄酮纯化方法、化学成分分析及抗氧化活性研究。本发明原材料是乌拉草，采用层次分析法结合响应面法确定纯化乌拉草黄酮的最优条件。并对纯化后乌拉草黄酮的化学成分进行鉴定。主要采用高效液相色谱‑质谱联用技术对纯化后的乌拉草黄酮进行化学成分分析。最后采用液相混标法合紫外光谱一致性比较进一步解析乌拉草化学成分。之后对纯化后黄酮进行抗氧化活性研究。确定的最佳纯化条件，工艺有效简便。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，更具体的涉及一种乌拉草总黄酮纯化方法及其用途。
背景技术
乌拉草(Carex meyeriana Kunth)主要生长在黑龙江、吉林、内蒙古等地，与人参、貂皮并称为“东北三宝”，是多年生草本植物，生命力顽强，全年均可使用。乌拉草具有保暖、透气、抑菌等独特功能，且应用历史悠久，药用价值高、具有终身不寄生真菌的特点，因此具有较强的抑菌作用。乌拉草中主要含有黄酮类和脂肪酸类化合物，具有滋养皮肤、改善睡眠、调节血脂等特点。乌拉草资源富足，应用广泛，用途颇多，但目前对乌拉草的主要有效成分黄酮类化学成分的研究较少，而黄酮是乌拉草中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、抑菌等重要的作用，具有较高的生物活性和研究价值。
黄酮化合物是一种天然存在的抗氧化物，在植物界中分布广，种类多，传统的黄酮类化合物为酚酸类，普遍具有抗氧化和抑菌活性，在生物学上具有重要的意义，尤其是在医药学领域研究比较广泛，它的化学成分和生物活性的研究已成为热点。但由于黄酮化合物具有不稳定，易水解、氧化等性质，因此有必要了解其结构特点及构效关系，才能更全面、深入地了解黄酮化合物的生物活性。为进一步将此类化合物得到广泛开发和较好的应用，可以利用多种解析方法进行化学成分分析及鉴定结构，多种方法相互弥补，解析更为准确，利于探讨构效关系。
传统正交试验方法分析离散型数据，预测性不是很好。后来，人们开始使用响应面分析方法，但作为评价指标的响应值较为单一且评价标准不一致，进而，影响纯化效果。因此，需要将层次分析法(AHP) 与响应面法(RSM)相结合，进行纯化条件评估，采用单因素实验确定纯化变量的适宜范围，完成权重系数的分配，得出最佳工艺的综合评分，科学的解决了多指标纯化评价问题。
液质联用技术是一种以液相色谱为主要分离手段，质谱法作为检测手段的色谱检测技术集合了液相色谱仪的高分离能力和质谱仪的高灵敏度、高专属性的特点，简化了复杂混合物的分离纯化过程灵敏度高、专属性强、重现性好，能提供丰富的结构信息，可根据一级、二级甚至多级质谱信息确定化合物的分子量并推断出可能分子结构，为药物杂质的结构鉴定提供快速、准确的方法。是目前结构鉴定分析领域应用最为广泛的一种技术。近二十年来，随着液质联用技术发展的日臻完善，其在药物杂质结构鉴定研究中的应用也越来越广泛，展现出广阔的应用前景。
发明内容
本实验目的是对乌拉草总黄酮提取液进行纯化。本发明成果将为今后对该乌拉草总黄酮纯化工艺及纯化后化学成分分析和抗氧化活性研究提供一定的科学依据。乌拉草黄酮类化学成分研究在乌拉草保健食品开发和有效成分提取具有一定的研究价值。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
纯化后乌拉草黄酮的化学成分分析和抗氧化活性研究该方法包括以下的步骤：
(1)静态吸附/解吸附
通过摇床先进行吸附，抽滤，然后进行解吸附，测量吸附率、解吸附率与回收率。初步筛选X-5、S-8、聚酰胺、AB-8、D101、NKA-∥6 中树脂。
(2)动态吸附/解吸附
取适量树脂装入层析柱中，上样、水洗、醇洗，测量回收率。进一步筛选最佳的树脂。
(3)单因素实验
以上样浓度、洗脱流速、pH、乙醇浓度为影响黄酮纯化工艺的主要因素，以回收率为考察指标。进行四因素四水平的单因素实验，每次固定其中三个因素，只改变一个因素。筛选出最优的纯化条件。
(4)层次分析计算权重系数
首先建立层次分析模型，分别选取目标指标以及三个二级指标。对二级指标对目标的重要性进行评价。转化为矩阵。计算得出三个二级指标的权重系数。
(5)响应面实验
以上样浓度、洗脱流速、pH、乙醇浓度为自变量，以反映三个二级指标的综合评分为响应值设计响应面实验。得出实验结果并对其进行分析。得出优化后的最优纯化工艺。
(6)液质解析乌拉草化学成分
液相色谱条件：
C18(5μm，4.6×250mm)，进样量5μL，流动相包含乙腈(A)和0.1％甲酸(B)。流动相洗脱梯度如下：0-25min， 85-65％A；25-35min，60-45％A；35-50min，45-20％A；50-55min， 20-0％A；55-60min，0％A；60-60.1min，0-15％A；60.1-66min，15％A。
质谱条件：ESI源喷射电压设置为4000V，源温度为(TEM)300℃，干燥气体体积流量为1L/min，雾化气体积压力30psi，辅助气体压力60psi，接口处持续加热，采用飞行时间-质谱联用(TOF-MS)检测器 (agilent，USA)。
通过二级质谱的裂解的方式，获得黄酮化合物结构相关的碎片离子，根据MassHunter软件在5ppm的质量偏差范围内计算其可能的分子式，再通过文献对推测分子式和化合物进行验证。
(7)超高效液相分析
使用UltiMate3000双梯度液相色谱仪(Thermo Fisher科学，马萨诸塞州)进行UHPLC分析，该仪配备了二极管阵列检测器(DAD)和Symmetry C18柱(250×4.6mm，5μm；岛津，WondasilC18-WR，京都，日本)。柱温为30℃。流动相由0.1％甲酸水(A)和甲醇(B)不同比例组成，流速为0.8ml/min。洗脱程序为：0-10min(21％～33％B)， 14-26min(37％～40％B，28～34min(42％～44％B)，34～60min(44％～74％B)。吸取供试品溶液适量，进样体积为20μL。
(8)紫外光谱检测
取配置好的标准品溶液和供试品溶液适量，在200-500nm波长下进行扫描，以吸收波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线。
(9)抗氧化实验研究
称取纯化后黄酮样品适量，进行DPPH自由基、羟基自由基活性以及还原力的测定。
附图说明
图1为静态吸附AB-8树脂比较其他树脂吸附率柱状图；
图2为静态吸附AB-8树脂比较其他树脂解吸附率柱状图；
图3为静态吸附AB-8树脂比较其他树脂回收率柱状图；
图4动态吸附AB-8与D101回收率柱状图；
图5为上样浓度对乌拉草黄酮回收率的影响；
图6为乙醇浓度对乌拉草黄酮回收率的影响；
图7为pH对乌拉草黄酮回收率的影响；
图8为流速对乌拉草黄酮回收率的影响；
图9为样品浓度和洗脱浓度交互作用的曲面图；
图10为流速和pH交互作用的曲面图；
图11为样品浓度和PH值对交互作用的曲面图；
图12为pH值和洗脱浓度洗脱浓度交互作用的曲面图；
图13为洗脱浓度和流速交互作用的曲面图；
图14为样品浓度和pH值交互作用的曲面图；
图15为乌拉草黄酮超高效液相色谱图；
图16为没食子儿茶素紫外光谱图；
图17为表没食子儿茶素紫外光谱图；
图18为绿原酸紫外光谱图；
图19为表儿茶素紫外光谱图；
图20为柚皮苷紫外光谱图；
图21为杨梅素紫外光谱图；
图22为木犀草素紫外光谱图；
图23为异鼠李素紫外光谱图；(A：乌拉草黄酮样品；B：黄酮对照品.)
图24为纯化后黄酮对DPPH的清除率图；
图25为纯化后黄酮对羟基自由基的清除率图；
图26为纯化后黄酮对还原力的清除率图；
具体实施方式
实施方案一 静态吸附/解吸附
取六个锥形瓶，每个瓶中分别加入预处理完毕的六种型号(AB-8 型大孔吸附树脂、D101型大孔树脂、S-8型大孔树脂、X-5型大孔树脂、NKA-Ⅱ型大孔树脂、聚酰胺型大孔树脂)树脂3g。每个锥形瓶中加入40mL乌拉草粉末水溶液，放置于摇床上吸附6h，抽滤，取滤液测量吸光度并计算黄酮的浓度与吸附率。再将抽滤后的树脂放回锥形瓶中，加入体积比70％乙醇40mL放置于摇床上解吸附6h，抽滤，取滤液测量吸光度并计算黄酮浓度、解吸附率和回收率。根据吸附率 (Ae，％)、解吸附率(De，％)与回收率(Pr，％)确定乌拉草黄酮最佳纯化树脂。
Ae＝(Co－Ce)/Co×100％
De＝Cd×Vd/(CO－Ce)Vo×100％
Pr＝Ae×De
C0－溶液中乌拉草粗黄酮的初始浓度(mg/mL)；
Ce－溶液中乌拉草粗黄酮的平衡浓度(mg/mL)
Cd－解吸溶液中乌拉草黄酮的浓度(mg/mL)；
V0－乌拉草粗黄酮溶液体积(mL)；
Vd－乌拉草粗黄酮解吸溶液体积(mL)。
以乌拉草总黄酮的吸附率、解析率和回收率为考察指标，进行树脂筛选，结果如图1、2、3。实验结果所示，AB-8、S-8、聚酰胺、 D101、X-5和NKA-Ⅱ树脂的吸附率分别为65.69±2.36％、65.82± 2.49％、52.58±2.66％、66.95±3.45％、、55.91±2.67％、和45.73±3.38％。 AB-8和S-8、D101树脂的吸附率无显著性差(P>0.05)。但明显高于其他树脂(P<0.0001)。AB-8、S-8、聚酰胺、D101、X-5和NKA-Ⅱ树脂的解吸附率分别为84.11±2.16％、73.60±2.35％、65.75±3.02％、 73.51±2.85％、74.66±3.25％和82.66±2.31％。AB-8与NKA-Ⅱ树脂的解吸附率无显著性差异，但与其他树脂相比有较大差异(P<0.05)。 AB-8、S-8、聚酰胺、D101、X-5和NKA-Ⅱ树脂的回收率分别为 54.42±1.34％、47.00±3.34％、35.08±1.30％、49.63±1.03％、41.43±2.59％和45.88±1.09％。显然，AB-8树脂的回收率最优，与其他树脂相比均具有显著性差异(P<0.05)。
One-way方差分析表明NKA-II树脂具有较好的解吸附率，但吸附率与回收率都低于AB-8树脂，且价格昂贵。综合考虑，并跟据吸附率、解吸附率和回收率指标认为AB-8树脂是纯化乌拉草粗黄酮的最佳树脂。但AB-8与D101树脂的回收率相对接近，所以进一步对AB-8与D101树脂进行动态吸附实验，确定纯化的最优树脂。
实施方案二 动态吸附/解吸附
取树脂15g，湿法装入层析柱中，使树脂表面平齐，先慢慢加入蒸馏水，调至所需流速，当蒸馏水流至离树脂表面1cm左右时，慢慢加入上样液。然后水洗45mL至流出液不带有颜色后换70％醇洗 50mL，收集洗脱液，并在510nm处测量吸光度，计算浓度与回收率(Pr，％)。公式如下：
Pr＝Cd×Vd/(Co×V0)×100％
C0－溶液中乌拉草粗黄酮的初始浓度(mg/mL)；
Cd－醇洗溶液中乌拉草黄酮的浓度(mg/mL)；
V0－乌拉草粗黄酮溶液体积(mL)；
Vd－乌拉草粗黄酮醇洗溶液的体积(mL)。
表1动态吸附回收率表
表1为动态吸附回收率表，由动态吸附结果可得最终AB-8的回收率优于D101，具有显著性差异(P<0.0001)，确定AB-8为纯化乌拉草黄酮的最优树脂。如图4所示，AB-8为弱极性树脂，既有亲水性，可吸附极性物质；又有疏水性，可吸附非极性物质。黄酮类化合物具有酚羟基结构，当溶液为弱酸性时有利于大孔树脂的吸附。
实施方案三 单因素实验
采用动态吸附/解吸附实验，以上样浓度、洗脱流速、pH值和乙醇浓度为影响乌拉草黄酮纯化的主要因素，以回收率为考察标准，筛选乌拉草黄酮纯化的最优条件。
不同上样浓度对乌拉草黄酮纯化的影响：固定洗脱流速、pH值、乙醇浓度，改变上样浓度进行单因素实验，选取四组上样浓度分别为 1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL。固定上样体积20mL。流速为2.84BV/h、pH为3、乙醇浓度为70％。收集洗脱下来的洗脱液并在510nm条件下进行吸光度测量，计算回收率。依次将上样浓度、流速、pH值、洗脱浓度作为改变因素。上样浓度分别为1mg/mL、 3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL；洗脱流速分别为2.27BV/h、2.84BV/h、 3.4BV/h、4.5BV/h；pH值分别为2、3、4、5；乙醇浓度分别为50％、 60％、70％、80％。由图5可以看出回收率随上样浓度的增加而增加，当上样浓度3mg/mL以后回收率反而下降；由图6可知，随着乙醇浓度的增加回收率随之增加，当乙醇浓度达70％时，其回收率最高；由图7可以看出，当pH值超过3时，黄酮回收率有所下降；由图8 可以看出，当洗脱流速为2.84BV/h时，回收率最高。但当流速继续增加时，回收率下降了。说明洗脱流速加快时，黄酮被乙醇洗脱下来的时间缩短，黄酮未能被乙醇溶液从树脂上溶解洗脱下来，树脂上还残留很多黄酮，导致回收率降低。
最佳纯化条件为上样液浓度：3mg/mL；乙醇浓度：70％乙醇； pH值：3；洗脱流速：2.84BV/h。
实施方案四 层次分析计算权重系数
AHP模型由两个层次组成，顶层是模型的目标(要优化的参数)，二级指标w1、w2和w3分别为回收率、纯度和脱色率的权重系数。根据测试结果的范围和方差分析，并结合乌拉草黄酮的实际纯化条件，采用适合的方法对标准对目标水平的重要性进行了评价,将结果转化为正对比较矩阵。
Nij(wi/wj)表示因子i和j的优先权重。
层次分析计算回收率、纯度与脱色率的权重系数分别为0.655、 0.290和0.055。
实施方案五 响应面实验
按照Box-Behnken中心组合试验设计原理与单因素试验结果分析，以上样浓度(X1，mg/mL)、洗脱流速(X2，BV/h)、pH值(X3)、乙醇浓度(X4，％)四个因素为自变量，以能反映乌拉草黄酮的回收率、纯度和脱色率的加权得分，即综合纯化效果评分为响应值，用Design-Expert Software Version 8.0.6.1软件建立四因素三水平29组响应面分析试验，进行二次多项回归方程的拟合与优化分析。
以上样浓度、洗脱流速、pH、乙醇浓度为自变量，以反映回收率、纯度、脱色率的综合评分为响应值设计响应面实验。得出实验结果并对其进行分析。结果得出优化后的纯化条件为上样液浓度： 3.04mg/mL；乙醇浓度：70.33％乙醇；pH值：2.93；洗脱流速：2.95BV/h。且上样浓度与乙醇浓度相互作用对乌拉草黄酮的纯化影响最大。表2 为响应面综合数据评分详情。表3乌拉草黄酮纯化综合评分响应面二次模型方差分析。根据方差分析，得到调整后的R2＝0.9870。这一结果证明了在实验变量范围内此模型预测的可行性，变异系数(C.V.＝ 2.02％)可知实验数据可靠性和精确度较好。
表2响应面综合数据评分表
表3乌拉草黄酮纯化综合评分响应面二次模型方差分析
**极其显著*显著
由图9表示在上样浓度和洗脱浓度交互作用的曲面图，pH值固定3，流速固定2.84BV/h。响应曲面的图形当中，可以明确且清晰地看出，当洗脱浓度65％～71％之间，曲面逐渐上升，而浓度高于 71％，曲面逐渐下降，说明洗脱浓度对纯化的影响很大。同理，样品浓度对纯化影响也很大。
图10为上样浓度和pH交互作用的曲面。洗脱浓度固定70％、流速固定2.84BV/h。当pH值在2.5～3.1区间时，上样浓度在2.5～3.1 区间，曲面平缓，说明这两个因素交互影响对乌拉草纯化效果影响不大。
依次对11、12、13、14图进行分析。结果发现，上样浓度和洗脱浓度的相互作用影响乌拉草黄酮纯化效果的主要因素。
实施案例六 液质解析乌拉草黄酮化学成分
液相色谱条件为：对称C18(5μm，4.6×250mm)；注射量为5μL；流动相含有0.1％甲酸(A)和乙腈(B)。流动相的洗脱梯度如下： 0-25分钟，85-65％A；25-35分钟，60-45％A；35-50分钟，45-20％ A；50-55分钟，20-0％A；55-60分钟，0％A；60-60.1分钟，0-15％ A；60.1-66分钟，15％A。
质谱条件为：ESI源的注入电压为4000V，干气流量为1L/min，雾化气体压力为30psi，辅助气体压力为60psi，界面连续加热，和一个TOF-MS探测器(安捷伦，美国)。质谱离子源的工作温度为300℃，扫描质量范围为100至1500米。
通过二级质谱的裂解的方式，获得黄酮化合物结构相关的碎片离子，根据MassHunter软件在5ppm的质量偏差范围内计算其可能的分子式，再通过文献对推测分子式进行验证。表4为推测乌拉草黄酮中可能含有的化合物表。纯化后的乌拉草黄酮用液相-质谱法进行定性分析。在负离子模式下，推测乌拉草黄酮中可能含有以上9种化合物。
表4推测乌拉草黄酮中可能含有的化合物表
实施案例七 超高效液保留时间对标准品解析
使用UltiMate3000双梯度液相色谱仪(Thermo Fisher科学，马萨诸塞州)进行UHPLC分析，该仪配备了二极管阵列检测器(DAD)和 Symmetry C18柱(250×4.6mm，5μm；岛津，WondasilC18-WR，京都，日本)。柱温为30℃。流动相由0.1％甲酸水(A)和甲醇(B)不同比例组成，流速为0.8ml/min。洗脱程序为：0-10min(21％～33％B)， 14-26min(37％～40％B，28～34min(42％～44％B)，34～60min(44％～74％B)。吸取供试品溶液适量，进样体积为20μL。表5为乌拉草黄酮样品和混合标准品的保留时间
表5乌拉草提取液黄酮和混合标准品液相色谱洗脱化学成分
取配置好的标准品溶液和供试品溶液适量，在200-500nm波长下进行扫描，以吸收波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制紫外吸收曲线。乌拉草黄酮化合物HPLC全谱如图15A所示，UHPLC将相应的保留时间与对照品黄酮化合物的保留时间进行比较，确定共有8种乌拉草黄酮化合物与对照品保留时间一致图15B。利用超高效液相色谱 (UPLC)通过与对照黄酮类化合物保留时间及混标的峰形进行对比，鉴定出五种黄酮类化合物和一种苯丙素类化合物。
实施案例八 乌拉草黄酮化合物紫外分光光度法成份解析
根据UHPLC保留时间和峰形的一致性，在紫外光谱中从200nm 到400nm扫描了上述八种参比物质，最佳波长设定为245nm。将上述8种对照品黄酮化合物的紫外光谱与纯化后黄酮中的各组分进行了比较。8个化合物的紫外光谱并没有完全匹配。
图17和19中表没食子儿茶素和表儿茶素，与图中纯化后乌拉草黄酮组分的紫外光谱峰形和最大吸收波长不一致。而图16，18，20-23 表明，其他六种化合物与纯化后黄酮的紫外光谱吻合较好可能，推测不含表没食子儿茶素和没食子儿茶素。
实施案例九 乌拉草黄酮纯化前后比较
1.DPPH自由基清除活性
将含有DPPH(0.1mmol/L)的2.0mL无水乙醇溶液与含有不同浓度的2.0mL提取后黄酮和纯化后黄酮无水乙醇溶液混合。将溶液摇匀，避光条件下静置反应30min，测得Ai，以等体积无水乙醇代替DPPH 溶液；测得Aj，以等体积无水乙醇与等体积DPPH溶液混合；测得 A0，以抗坏血酸(VC)代替样品溶液，做抗氧化活性测试的阳性对照。上述均在517nm处测其吸光度，以无水乙醇做空白调零。DPPH自由基清除活性计算公式如下:
清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％ 式(1)
式中：Ai－样品组
Aj－空白对照组
Ao－模型对照组
如图24所示，在0.05～0.30mg/mL范围内时，纯化后黄酮对DPPH 的清除率为6.44±2.55～90.66±2.78％，在0.3～1.2mg/mL时清除率与 VC接近。可以看出，样品对DPPH自由基的清除活性表现出明显的浓度依赖性。通过SPSS软件计算出纯化后(IC50＝0.034mg/mL)， VC(IC50＝0.021mg/mL)和纯化前(IC50＝0.071mg/mL)的半数抑制值，发现纯化后黄酮对DPPH的清除活性显著高于纯化前黄酮 (P<0.0021)，且纯化后黄酮与VC无显著性差异(P>0.05)。
2.羟基自由基清除活性
将1mL黄酮溶液(0.2-2.0mg/mL)与1.0mL0.75mmol/L邻二氮菲、1.0mL0.75mmolFeSO4、2.0mLPBS(pH＝7.4)和1.0mL0.012％H2O2混合。混合溶液在37℃恒温水浴下保存50min。反应溶液的吸光度测定在 511nm。根据式(2)得到羟基自由基清除率:
清除率(％)＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％ 式(2)
式中：As－样品组
Ap－空白对照组
Ab－模型对照组
黄酮供试品制备：将乌拉草纯化后样品干燥至恒重，精准称取 2.5mg粉末溶于0.1％甲酸和甲醇中，临用前经微孔滤膜过滤(0.45 um)。
黄酮对照品配制：分别称取标准品2.5mg，移取到容量瓶中(25 ml)，加入适量0.1％甲酸和甲醇，溶解后定容至刻度，摇匀，得浓度为0.1mg/ml标准品溶液。分别移取上述溶液10ml，甲醇(25ml) 溶解，配制成浓度为0.4mg/ml的标准品混合溶液，置于4℃冰箱保存。
如图25所示，在0.2～2.0mg/mL范围内时，纯化后黄酮对羟基自由基的清除率为16.40±4.32～98.32±2.45％。可以看出，样品对羟基自由基的清除活性表现出明显的浓度依赖性。通过SPSS软件计算出纯化后(IC50＝0.542mg/mL)，VC(IC50＝0.643mg/mL)和纯化前 (IC50＝1.906mg/mL)的半数抑制值，发现纯化后黄酮对羟基自由基清除率显著高于纯化前黄酮(P<0.0001)，而纯化后黄酮与VC的差异不显著(P<0.0021)。
3.还原力的测定
将不同浓度的提取后黄酮与纯化后黄酮样品分别加入pH＝6.6的 2.5mlPBS、2.5ml的1％铁氰化钾溶液。进行50℃恒温水浴20min，取出后进行极速冷却；加入2.5ml三氯乙酸，摇匀。3000r/min离心 10min；取2.5ml上清液，加入0.5ml的0.1％三氯化铁溶液和2.5ml 蒸馏水，摇匀，避光反应6min。用VC作阳性对照，反应溶液的吸光度测定在700nm。每个浓度三个平行，取平均值。
还原力(％)＝(Ai-Ao)/Ai×100％ 式(3)
式中：Ai－样品组
Ao－空白对照组
如图26所示，在0.02～0.1mg/mL范围内时，纯化后黄酮对还原力的清除率为44.00±3.78～88.40±2.62％，在0.1～0.7mg/mL下清除率接近VC。可以看出，样品对铁离子还原力的活性表现出明显的浓度依赖性。通过SPSS软件计算出纯化后(IC50＝0.025mg/mL)，VC(IC50＝0.01mg/mL)和纯化前(IC50＝0.195mg/mL)的半数抑制值，发现纯化后黄酮对还原力的清除活性低于VC，明显高于纯化前黄酮。发现纯化后黄酮还原能力显著高于纯化前黄酮(P<0.0001)，且纯化后黄酮与VC无显著性差异(P>0.05)。
采用优化后的纯化条件对乌拉草黄酮进行纯化，由11.72±0.1％提升至56.00±0.68％，发现纯化后纯度明显高于纯化前纯度。综合以上所述，在抗氧化协同作用下，纯化后乌拉草中的黄酮化合物具有较好的抗氧化活性。因此，纯化后乌拉草黄酮中可作为抗氧化剂应用于医药、功能性食品和天然化妆品中。
Claims (6)
1.一种乌拉草总黄酮的纯化工艺及纯化后化学成分分析和抗氧化活性研究，其特征在于，包括以下步骤：乌拉草总黄酮提取液的制备、大孔吸附树脂吸附和洗脱、纯化后样品化学成分分析、纯化后样品抗氧化活性研究。
2.如权利要求1所述，其特征在于，称取乌拉草一定量，按照乙醇浓度49%、液料比30mL/g、提取时间91min、提取温度70℃，制备乌拉草黄酮提取液。
3.如权利要求1所述，其特征在于，所提样品纯化工艺，上样液浓度、乙醇浓度、pH值、洗脱流速分别为：3.04mg/mL、70.33%、2.93、2.95BV/h。
4.如权利要求1所述，其特征在于，黄酮纯度由11.72±0.1%提升至56.00±0.68%。
5.如权利要求1所述，其特征在于，纯化后的乌拉草黄酮中解析出八种黄酮类化合物和一种苯丙素类化合物。
6.如权利要求1所述，其特征在于，纯化后的乌拉草黄酮对DPPH清除率在0.3~1.2 mg/mL范围内接近VC，对羟基自由基、还原力的清除率均略高于VC，并表现出明显的浓度依赖性。
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