CN114010675B - 一种神农香菊茎叶提取物的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神农香菊茎叶提取物的制备方法，步骤如下：1)将神农香菊茎叶用乙醇超声提取，过滤后收集提取液，浓缩，干燥，得粗提取物；2)将粗提取物用水溶解，然后上大孔树脂柱进行吸附，先用水洗脱以去除杂质，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。该方法制备的提取物具有高含量的总黄酮和总多酚，能呈浓度依赖性的清除DPPH自由基，该提取物对DPPH自由基的IC50为0.086mg/mL，而BHT的IC50为0.056mg/mL，但当二者浓度均大于0.15mg/mL时，神农香菊茎叶提取物的活性相比BHT更大。

Description

一种神农香菊茎叶提取物的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及神农香菊茎叶提取物的制备方法及其用途，属于天然植物药领域。
背景技术
神农香菊(Chrysanthemum indicum var.aromaticum)属于菊科菊属植物，是野菊的一个新变种。野生分布于神农架海拔2000米以上向阳开阔的空旷地。全株具有特殊浓郁香气，神农香菊具有较高的药用价值，其干燥头状花序可入药,具有清热解毒、散风降压、平肝明目等药理作用，民间以其花、茎、叶作辛凉解表、清热及治疗慢性肝炎。神农香菊作为我国二级保护植物，非常稀有，目前的研究多集中于花部位，从神农香菊花中提取的精油和黄酮类成分具有较强的抑菌和抗氧化效果，可以作为食品中的一种天然抗氧化剂。而茎和叶未开发利用，造成了资源的浪费。神农香菊的茎叶中含有大量的植物活性成分，如总黄酮、多酚、多糖类等。
已有的文献报道中，多是对神农香菊花的挥发性成分研究，对神农香菊茎叶的多糖进行制备纯化，分析其组分，主要是葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖以及摩尔比为1:1.992:1.577:2.379。对茎叶的总黄酮提取制备方法中，显示采用超声辅助提取法提取神农香菊茎叶中的黄酮类化合物，70％甲醇料液比1:25，超声30min提取3次，合并滤液进行旋蒸浓缩，醇沉法除去糖类与蛋白质大分子，真空干燥后得到神农香菊茎叶部位的总黄酮提取物，但其纯度均低于5.0％。且所使用的提取甲醇水溶液，甲醇及其代谢产物甲醛和甲酸可引起以中枢神经系统损害、眼部损害及代谢性酸中毒，不利于后期产业化开发，且所得到的总提取物未进一步明确其成分和功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种神农香菊茎叶提取物的制备方法，该方法制备的提取物具有高含量的总黄酮和总多酚，在清除DPPH自由基和抗氧化方面能发挥更好的用途。
本发明的技术方案是：
一种神农香菊茎叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)将神农香菊茎叶用乙醇超声提取，过滤后收集提取液，浓缩，干燥，得粗提取物；
2)将粗提取物用水溶解，配制成浓度为0.1-0.16g/mL的溶液，然后上大孔树脂柱进行吸附，先用水洗脱以去除杂质，再用50-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
优选地，步骤1)中所述超声提取的次数是1-4次，每次提取的时间是20-100min，提取所使用的乙醇浓度为30-95％。
进一步优选地，步骤1)中所述超声提取的次数是2次，每次提取的时间是40min，提取所使用的乙醇浓度为70％。
优选地，步骤2)中所述的大孔树脂为非极性大孔树脂，进一步优选D101型大孔树脂。
优选地，步骤2)中，将溶液以1.5-3BV/h的流速上大孔树脂柱进行吸附，上样量2-8BV。
进一步优选地，步骤2)中，将粗提取物配制成浓度为0.12g/mL的溶液，然后以3BV/h的流速上大孔树脂柱进行吸附，上样量3BV。
优选地，步骤2)中，所述洗脱的乙醇体积为3-5BV。
进一步优选地，步骤2)中，所述乙醇为80％乙醇，所述洗脱的乙醇体积为4BV。
该方法制备的提取物具有高含量的总黄酮和总多酚，富含3-羟基黄酮、7,8-二羟基黄酮、去甲汉黄芩素、水杨酸、对香豆醛、肉桂酸等生物活性物质，能呈浓度依赖性的清除DPPH自由基，该提取物对DPPH自由基的半数抑制浓度(IC50)为0.086mg/mL，而BHT的半数抑制浓度(IC50)为0.056mg/mL，但当浓度大于0.15mg/mL时，在相同浓度下，神农香菊茎叶提取物的DPPH自由基清除率相比BHT更大。
本发明中所涉及到的乙醇浓度均为体积浓度，如80％乙醇，指的是每100ml乙醇水溶液中含有乙醇80ml。
本发明的有益效果是：
1)本发明制备的提取物具有高含量的总黄酮和总多酚，富含3-羟基黄酮、7,8-二羟基黄酮、去甲汉黄芩素、水杨酸、对香豆醛、肉桂酸等多种生物活性物质。
2)本发明提供的制备方法具有产物收率高、生产周期短等优点，所使用的溶剂安全无毒环保。
3)本发明制备的提取物具有较强的抗氧化能力，尤其是在高浓度下，提取物的DPPH自由基清除率相比BHT更大。
3)本发明还具有工艺简单，易于后期产业化开发等优点。
附图说明
图1：纯化前正离子图。
图2：纯化前负离子图。
图3：纯化后正离子图。
图4：纯化后负离子图。
图5：纯化前后抗氧化活性对比。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1：大孔树脂纯化工艺
1)总黄酮与总酚的含量测定
1.1总黄酮的标准曲线
总黄酮含量(TFC)测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法。由于总黄酮是一类化合物的简称，其含量不能直接确定。芦丁的单体结构完全符合黄酮类化合物的基本特征(由A环与B环组成的共轭体系)，而且紫外吸收明显。因此，选择芦丁作为测定总黄酮含量的代表。具体而言，精密称取芦丁对照品12.5mg于50mL容量瓶中，加60％乙醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得0.25mg/mL芦丁对照品溶液。分别量取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL容量瓶中，加入1mL亚硝酸钠溶液(10％)混匀，放置6min；然后加入1mL硝酸铝溶液(5％)混匀，放置6min；最后加入5mL氢氧化钠溶液(4％)，用60％乙醇溶液定容至刻度混匀，放置15min。使用紫外-可见分光光度计检测样品在510nm处的吸光度，以60％乙醇溶液为空白对照，总黄酮含量表示为1mL粗提物中芦丁的含量(mg/mL)。每份试验重复测定三次。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程y＝11.7x+0.0054(R2＝0.9990)。
1.2总酚的标准曲线
总酚含量(TPC)采用Folin-Ciocalteu法进行测定，略有修改。具体而言，精密称取儿茶酚对照品10.0mg于10mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得1.0mg/mL对照品溶液。分别量取适量儿茶酚对照品溶液，配制成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL的系列标准溶液。然后，将0.1mL测量溶液与0.5mL福林-酚试剂涡旋混匀，在25℃下放置20min；再加入0.5mL碳酸钠溶液(6％)和0.9mL双蒸水，涡旋混匀，在25℃下放置10min。使用紫外-可见分光0光度计检测样品在760nm处的吸光度，总酚含量表示为1mL粗提物中儿茶酚的含量(mg/mL)。每份试验重复测定三次。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程y＝0.0093x+0.0005(R2＝0.9997)。
2)树脂种类的选择
将预处理好的不同极性大孔树脂各4g放入100mL具塞锥形瓶中，加入30mL样品溶液，置恒温振荡器中振摇24小时使总黄酮和总酚充分吸附(25℃，100rpm)。离心过滤并测定滤液中总黄酮和总酚含量。然后，用去离子水洗涤树脂两次，再将洗涤后的树脂置于40mL的60％乙醇溶液中振摇24小时使总黄酮和总酚充分解吸附(25℃，100rpm)。离心过滤并测定滤液中总黄酮和总酚含量，见表1。
表1不同极性树脂总黄酮及多酚的吸附与解吸对比
大孔树脂类型 型号 总黄酮吸附率％ 总酚吸附率％ 总黄酮解吸率％ 总酚解吸率％
非极性 H-30 70.57 60.54 44.52 57.68
中极性 ADS-17 67.54 54.65 40.35 38.49
极性 S-8 51.11 40.58 41.63 40.97
3)树脂型号筛选
将预处理好的非极性不同型号大孔树脂各4g放入100mL具塞锥形瓶中，加入30mL样品溶液，置恒温振荡器中振摇24小时使总黄酮和总酚充分吸附(25℃，100rpm)。离心过滤并测定滤液中总黄酮和总酚含量。然后，用去离子水洗涤树脂两次，再将洗涤后的树脂置于40mL的60％乙醇溶液中振摇24小时使总黄酮和总酚充分解吸附(25℃，100rpm)。离心过滤并测定滤液中总黄酮和总酚含量，见表2。
表2不同型号非极性树脂总黄酮及多酚的吸附与解吸对比
型号 总黄酮吸附率％ 总酚吸附率％ 总黄酮解吸率％ 总酚解吸率％
AB-8 72.73 63.6 42.08 48.04
D101 76.3 66.28 57.75 82.38
HP-20 75.23 67.58 55.42 47.79
4)上样体积的影响
制备浓度为0.12g/mL的神农香菊茎叶提取液(其中，总黄酮含量为3241.90±3.61μg/mL、总酚含量为892.78±0.20μg/mL)，以3.0BV/h的流速加入到D101树脂层析柱中，每1BV收集1份流出液，测定吸光度并计算不同体积下总黄酮和总酚的含量。当流出液中总黄酮或总酚的含量达到初始样品溶液的十分之一时，认为树脂处于吸附平衡状态，即达到泄露点，结果见表3。
表3不同上样体积考察
Figure BDA0003363643760000061
5)上样流速的影响
将120mL浓度为0.12g/mL的神农香菊茎叶提取液，以不同流速(1.5、3.0、4.5、6.0和7.5BV/h)加入到D101树脂层析柱中进行动态吸附。收集流出液，测定吸光度并计算不同流速下总黄酮和总酚的吸附率，以评估树脂吸附能力与流速之间的关系，结果见表4。
表4上样流速的考察
上样流速(BV/h) 1.5 3 4.5 6 7.5
总黄酮吸附率(％) 95.13 94.87 83.45 75.88 62.43
总酚吸附率(％) 92.23 91.89 81.43 72.88 64.37
6)洗脱浓度的影响
动态解吸附过程采用填充D101树脂(干重为9.82g)的玻璃层析柱(2.6cm×30cm)进行，本试验的柱体积为40mL。首先，按照上述优化后的吸附条件进行吸附过程，待上样完毕后静置30min，使用120mL去离子水洗涤树脂两次以去除杂质。然后，以120mL不同浓度(10％、30％、50％、70％、80％和90％)的乙醇溶液进行洗脱，流速为3BV/h。收集洗脱液，测定吸光度并计算不同乙醇浓度洗脱下总黄酮和总酚的解吸率，以研究树脂解吸能力与乙醇浓度之间的关系，结果见表5。
表5洗脱浓度的考察
乙醇浓度(％) 10 30 50 70 80 90
总黄酮解吸率(％) 44.46 74.39 74.93 89.05 92.07 87.89
总酚解吸率(％) 34.69 76.68 78.99 80.01 89.84 88.57
7)洗脱体积的影响
按照上述优化后的吸附条件进行吸附过程，待上样完毕后静置30min，使用120mL去离子水洗涤树脂两次以去除杂质。将120mL乙醇溶液(80％)以3BV/h的流速进行洗脱。每1BV收集1份洗脱液，测定吸光度并计算不同洗脱体积下总黄酮和总酚的解吸率，以研究洗脱体积对树脂解吸能力的影响，结果表6。
表6不同洗脱体积考察
乙醇洗脱体积(BV) 1 2 3 4 5 6
总黄酮解吸附率(％) 84.15 15.04 0.72 0.06 0.005 0.003
总酚解吸附率(％) 56.7 36.3 4.01 2.26 0.43 0.09
根据以上试验，筛选到神农香菊茎叶提取物较佳纯化条件为：树脂尽量选用非极性大孔树脂，优选D101型大孔吸附树脂。上样浓度0.1-0.15g/mL，上样体积为3倍柱体积(BV)，上样流速1.5-3BV/h，洗脱剂选用80％乙醇，洗脱体积为4BV。
实施例2：
1)取神农香菊茎及叶100g，加入500g的40％乙醇溶液超声(频率为50Hz)提取20min，提取3次，CA(醋酸纤维素)微滤膜过滤收集3次提取液合并；
2)40℃下减压旋转蒸发浓缩成浸膏，40℃减压干燥完全成干膏粉；
3)将干膏粉加水溶解配置成0.10g/mL的水溶液，选用D101大孔树脂，以2BV/h上样速率，上样2BV，进行大孔树脂柱吸附；
4)依次用纯水、50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱液(5BV)；
5)将收集到的洗脱液50℃减压浓缩成浸膏，冷冻干燥(冷阱温度-20℃，样品温度-10℃，真空度20Pa，冻干时间24h)即得；
制备的神农香菊茎叶提取物总量为5.45g，其中总黄酮含量为52.26％、总多酚含量为24.49％，生产周期为48小时。
实施例3：
1)取神农香菊茎及叶100g，加入500g的70％乙醇溶液超声(频率为50Hz)提取40min，提取2次，CA(醋酸纤维素)过滤收集2次提取液合并；
2)50℃下减压旋转蒸发浓缩成浸膏，50℃下减压干燥完全成干膏粉；
3)将干膏粉加水溶解配置成0.12g/mL的水溶液，选用D101大孔树脂，以3BV/h上样速率，上样3BV，进行大孔树脂柱吸附；
4)依次用纯水、80％乙醇溶液洗脱，收集80％乙醇洗脱液(4BV)；
5)将收集到的洗脱液50℃减压浓缩成浸膏，冷冻干燥(冷阱温度-30℃，样品温度-15℃，真空度25Pa，冻干时间28h)即得；
制备的神农香菊茎叶提取物总量为6.86g，其中总黄酮含量为52.78％、总多酚含量为24.74％，生产周期为44小时。
实施例4：
1)取神农香菊茎及叶100g，加入500g的95％乙醇溶液超声(频率为50Hz)提取80min，提取1次，PP(聚丙烯)微滤膜过滤收集提取液；
2)60℃下减压旋转蒸发浓缩成浸膏，60℃下减压干燥完全成干膏粉；
3)将干膏粉加水溶解配置成0.15g/mL的水溶液，选用D101大孔树脂，以5BV/h上样速率，上样8BV，进行大孔树脂柱吸附；
4)依次用纯水、95％乙醇溶液洗脱，收集95％乙醇洗脱液(3BV)；
5)将收集到的洗脱液60℃减压浓缩成浸膏，冷冻干燥(冷阱温度-18℃，样品温度-10℃，真空度18Pa，冻干时间30h)即得；
制备的神农香菊茎叶提取物总量为4.36g，其中总黄酮含量为51.51％、总多酚含量为23.48％，生产周期为50小时。
实施例5：纯化前后液质分析
液相条件：Agilent SB-C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相A为超纯水(加入0.1％的甲酸)，B相为乙腈(加入0.1％的甲酸)，梯度洗脱：0.00minB香比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00-11.10min，B相比例降为5％并维持至14min。流速为0.35mL/min，柱温为40℃，进样量为4μL。
质谱条件：电喷雾离子化源(electron spray ionization，ESI)，ESI Turbo离子喷雾接口，源温度为550℃，离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)，离子源气体Ⅰ(GSⅠ)、气体Ⅱ(GSⅡ)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置最高。
使用UPLC-MS/MS方法鉴定了纯化前后的神农香菊茎叶提取物的组成。研究发现，神农香菊茎叶提取物中存在多种类型的代谢物，包括生物碱、酚酸、香豆素、萜类和黄酮类化合物等。其中，大部分为黄酮类化合物。已有文献报道了黄酮类化合物的存在，如芹菜素、异木犀草素。在纯化后，提取物中的黄酮和酚酸类化合物含量有所增加。表5列出了在提取物中发现的部分黄酮和多酚类成分的峰面积积分。可以看出，3-羟基黄酮、7,8-二羟基黄酮、去甲汉黄芩素等黄酮的含量分别增加了1.95、2.41、2.25倍；水杨酸、对香豆醛、肉桂酸等酚酸的含量分别增加了1.97、3.69、1.66倍。这些生物活性成分含量的增加将有助于神农香菊茎叶提取物更好的发挥作用。此外，这也表明了D101大孔树脂能够用于富集神农香菊茎叶中的黄酮和多酚类化合物，结果见图1及表7。
表7纯化前后代表性黄酮及酚的相对含量变化
Figure BDA0003363643760000091
Figure BDA0003363643760000101
实施例6：抗氧化活性
1)材料实施例2、3、4及未进行纯化的神农香菊茎、叶提取物，无水乙醇、DPPH、BHT。
2)方法与结果
选择DPPH自由基清除方法评价了神农香菊茎叶提取物中总黄酮和总酚的抗氧化能力。以BHT作为阳性对照，因为它具有较强的抗氧化作用，是许多食品和制剂中的一种常用抗氧化剂，在0.02～0.2mg/mL浓度范围内，随着提取物浓度的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加，呈现出浓度依赖性增长。当样品浓度为0.2mg/mL时，DPPH自由基清除率已达到88.26％。这些结果表明，神农香菊茎叶提取物对DPPH自由基具有较好的清除活性，这与其成分密切相关。通过UPLC-MS/MS分析已经证实，神农香菊茎叶提取物中含有木犀草素、芹菜素等成分，它们可以快速清除游离的DPPH自由基形成还原的DPPH分子，具有较强的抗氧化能力。经计算，神农香菊茎叶提取物的半数抑制浓度(IC50)为0.086mg/mL，而BHT的半数抑制浓度(IC50)为0.056mg/mL，略优于神农香菊茎叶提取物。但当浓度大于0.15mg/mL时，在相同浓度下，神农香菊茎叶提取物的DPPH自由基清除率相比BHT更大。总的来说，神农香菊茎叶提取物作为一种抗氧化剂具有良好的发展前景，其呈浓度依赖性的自由基清除能力可能是治疗某些人类疾病的潜在目标。

Claims (1)

1.一种神农香菊茎叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取神农香菊茎及叶100g，加入500g的70%乙醇溶液超声，超声频率为50 Hz，提取40min，提取2次，CA过滤收集2次提取液合并；
2）50℃下减压旋转蒸发浓缩成浸膏，50℃下减压干燥完全成干膏粉；
3）将干膏粉加水溶解配置成0.12g/mL的水溶液，选用D101大孔树脂，以3BV/h上样速率，上样3BV，进行大孔树脂柱吸附；
4）依次用纯水、80%乙醇溶液洗脱，收集4 BV 80%乙醇洗脱液；
5）将收集到的洗脱液50℃减压浓缩成浸膏，冷冻干燥，干燥的冷阱温度-30℃，样品温度-15℃，真空度25Pa，冻干时间28h，即得。
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