CN105132172B - 一种从鸢尾根中制备烟草用鸢尾根黄酮类物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从鸢尾根中制备烟草用鸢尾根黄酮类物质的方法，其特征在于：以鸢尾根为原料，经细胞破壁粉碎后，采用95％乙醇中温浸提，对浸提液浓缩后进行超临界CO₂萃取分离，所得萃取液即为鸢尾根黄酮苷元提取液；将萃余物再经过大孔树脂柱吸附分离、乙醇水梯度洗脱，获得鸢尾根黄酮苷提取液；将鸢尾根黄酮苷元提取液和鸢尾根黄酮苷提取液分别浓缩、干燥，获得鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物；将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物按比例混合，获得黄酮苷元纯度10‑50％、黄酮苷纯度20‑90％鸢尾根黄酮类复合物。本发明的提取分离工艺方法简便、绿色环保，产物纯度高。

Description

一种从鸢尾根中制备烟草用鸢尾根黄酮类物质的方法

技术领域

本发明涉及一种天然产物有效成分的提取分离方法，确切地说是一种从鸢尾根中制备烟草用黄酮类物质的提取分离方法。

背景技术

鸢尾根为鸢尾科植物鸢尾(Iris tectorum)的根茎，味苦、辛，性冷，有小毒。生于林缘、水边湿地及向阳坡地。主产于贵州、陕西、安徽、山西、甘肃等省，为中国药典2010年版一部收载品种。具有抗炎、治疗哮喘、咽喉疾病等功效；鸢尾根药用，主要含有黄酮类化合物和挥发油，还含鞣质、皂甙等。鸢尾根的药用成分主要是鸢尾根异黄酮类化合物，其代表性成分有鸢尾苷(Tectoridin)、鸢尾新苷B(Iristectorin B)、鸢尾苷元(Tectorigenin)、野鸢尾苷元(Irigenin)等。

鸢尾根黄酮是一种毒性极低、安全有效的天然药物，鸢尾根含有丰富的异黄酮，具有抗病毒、抗炎、止痛、止咳等功效，近年来发现其具有显著的抗肿瘤活性，在癌症的临床治疗上也显示出较好的成效；同时鸢尾根黄酮具有增香的功效，将其添加到到焦甜香品中可以大大改善产品品质，因此，将鸢尾根黄酮进行提取分离，并应用于烟草中，将为天然焦甜香料开发提供一种新途径。

考虑到鸢尾根黄酮(异黄酮)之苷和苷元具有上述特殊功效，有必要进行分离纯化。而国内对鸢尾根黄酮类化合物提取分离研究较少，主要采用乙醇提取、石油醚/乙酸乙酯等萃取、硅胶柱层析、薄层板分析，实现鸢尾根中黄酮类化合物微量制备、鉴定(例如，李小飞，李冠，杨博.喜盐鸢尾根中化学成分的分离与结构鉴定，《化学研究与应用》，2013，25(4)∶550-553)。

经由国家知识产权局网站检索，截至2015年4月20日，与鸢尾根或黄酮类化合物提取分离方法相关的发明专利主要有：

(1)CN102260593A(申请号CN201110192062，《动态循环式水蒸气真空蒸馏提取鸢尾根油装置》)：该发明公开了一种动态循环式水蒸气真空蒸馏提取鸢尾根油装置，属于生产鸢尾根油的蒸馏装置。包括加热釜、蛇管冷凝器及油水分离器，加热釜外设置再沸器，再沸器的喷口低于釜内液面。对蒸馏装置抽真空，使釜内水沸腾时釜内温度＜90℃。空塔节上的回水口与油水分离器的夹套上缘相水平或略低于夹套上缘。该釜体为立式圆锥体。本发明产品色泽清亮，香气纯正，收率可提高50％。。

(2)CN1250258C(申请号CN03135275，《单味鸢尾根高度白酒浸泡液的用途》)：本发明涉及鸢尾在制备外用药时的用途，本发明还涉及它在制备外用药时的制备方法。鸢尾的白酒浸提液一般是以鸢尾根干药与高度白酒(50°以上)以1∶10～50(重量)的比例浸泡，待酒色转为淡黄色即可，其中鸢尾干药与高度白酒的比例最好为1∶10～20。本发明拓宽了鸢尾的用途，也提供了一种新的鸢尾外用药的制备方法，本发明的制备方法是使用白酒浸提鸢尾，由于白酒本身具有活血化瘀、消炎的作用，与单纯捣敷相比，本药物疗效更快、更好，使用起来也更方便。

(3)CN104689599A(申请号CN201510055248，《利用超临界CO₂提取开花期向日葵花盘中总黄酮的提取方法》)：该发明公开了一种利用超临界CO₂提取开花期向日葵花盘中总黄酮的提取方法，采用CO₂流体为萃取剂提取总黄酮。本发明以开花期向日葵花盘为提取原料，利用超临界CO₂萃取方法进行总黄酮的提取分离，其操作简便、方法简单、提取效率高等特点。超临界CO₂提取是用无毒、无残留的CO₂代替水或有机溶剂作提取溶剂，不仅可以在接近室温的条件下萃取，而且可以实现高选择性提取和分离从而获得高质量的产品。

(4)CN104496956A(申请号CN201410681182，《一种基于氨基化石墨烯的黄酮类成分提取分离方法》)：本发明涉及黄酮类成分提取技术领域，提供了一种基于氨基化石墨烯的黄酮类成分提取分离方法，所述黄酮类成分包括黄酮、黄烷醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、黄烷酮、花色素、查耳酮和色原酮，所述提取分离方法为吸附萃取，所述吸附萃取介质为氨基化石墨烯等。本发明的基于氨基化石墨烯的黄酮类成分提取分离方法分离速度快、产品纯度高、成本低廉和操作方便的特点。

(5)CN104256604A(申请号CN201410528462，《一种从提油后枸杞渣粕中提取分离总黄酮的方法》)：本发明提供了从枸杞渣中提取分离总黄酮的方法，它包括如下操作步骤：(1)取提油后的枸杞渣粕，以乙醇为夹带剂进行超临界二氧化碳萃取，提取物备用；(2)将超临界二氧化碳萃取提取物上大孔吸附树脂，优选使用D101型大孔树脂，依次用水、15％(v/v)和70％(v/v)乙醇洗脱，收集70％(v/v)乙醇洗脱部位，浓缩，干燥，即得总黄酮。由于本发明采用的原料为提油后的枸杞渣粕，是对工业废料的再利用，不仅成本低廉，而且大大提高了枸杞的附加值，因此，本发明大大提高了对枸杞资源的综合利用率。

(6)CN104072464A(申请号CN201410266494，《一种橙黄酮的提取分离方法》)：本发明公开了一种橙黄酮的提取分离方法，其特征在于：将香藜的地上部分粉碎，加生物酶酶解8-10小时，酶解原料加60-80％乙醇溶液微波或超声提取2-3次，提取液浓缩至浸膏，加适量水分散后加入大孔树脂柱中吸附，再通过制备型高效液相色谱分离等步骤得到橙黄酮。该方法制备量大，产品含量高，适合工业化生产。

(7)CN103110670A(申请号CN201210407520，《一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法》)：本发明提供了一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其主要的成分是山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，芦丁，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷，山奈酚-3-O-芸香糖苷，异鼠李素-3-O-芸香糖苷，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷以及山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷。其制备方法为将银杏叶药材粉碎后醇水溶液提取，浓缩后滤液经非极性大孔吸附树脂柱层析，再经新型硅胶基质键合材料进行二维分离，用甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥，获得银杏黄酮组分。本发明提高了目标成分含量，黄酮组分含量确定。提取分离工艺过程重复性高、可操作性好，适用于自银杏叶大规模分离制备黄酮组分，并可作为舒血宁注射液原料。

(8)CN102526177A(申请号CN201210058671，《一种甘草总黄酮生产工艺》)：本发明涉及一种甘草总黄酮生产工艺，属于天然产物的提取分离纯化领域，包括水提取、过滤、大孔树脂的分离、醇提。材料粉碎不易太细小，保证放料顺畅；水提取过滤直接用树脂吸附，无需回收溶剂；树脂再生容易。

(9)CN102558260A(申请号CN201210009900，《美汉草中一种黄酮苷的提取分离工艺》)：本发明涉及美汉草中一种黄酮苷的提取分离工艺。称取美汉草干燥粗粉加入50％乙醇浸泡过夜，然后超声提取，合并提取液并减压浓缩，将浓缩液分别用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇等溶剂各萃取，由此得到正丁醇提取物；选用硅胶柱层析，采用不同梯度氯仿-甲醇对正丁醇提取物进行洗脱，分离得到白色沉淀，再经甲醇反复结晶得到单体化合物；结合光谱分析鉴定其结构为5，3′-二羟基-4′-甲氧基-黄酮-7-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡哺葡萄糖苷。

(10)CN102250170A(申请号CN201110129709，《黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途》)：本发明涉及黄秋葵果实中两个活性黄酮苷的制备方法及其用途。以黄秋葵果实为原料，采用渗漉提取、闪蒸浓缩、萃取脱色、醇沉转移出多糖及果胶，继续真空浓缩、通过大孔吸附树脂柱分离富集、再结合凝胶树脂柱色谱技术从中分离得到5,7,3′,4′-四羟基-4″-O-甲基-3-O-β-D-葡萄糖黄酮苷和5,7,3′,4′-四羟基-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷两个单体化合物，提取率分别为3.62％～8.66％和8.01％～12.98％，纯度均达到95％以上。本发明工艺简单、生产成本低，制得的两个黄酮苷具有很好抗氧化及抑菌活性。

发明内容

本发明内容旨在为开发天然焦甜香类香料提供高质量的原料－鸢尾根黄酮类物质，所要解决的技术问题是鸢尾根黄酮的提取与分离。

本发明解决技术问题，采用如下技术方案：以鸢尾根为原料，经细胞破壁粉碎后，采用95％乙醇(体积浓度)中温浸提，对浸提液浓缩后进行超临界CO₂萃取分离，所得萃取液即为鸢尾根黄酮苷元提取液；将萃余物再经过大孔树脂柱吸附分离、乙醇水梯度洗脱，获得鸢尾根黄酮苷提取液；将鸢尾根黄酮苷元提取液和鸢尾根黄酮苷提取液分别浓缩、干燥，获得鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物；将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物按比例混合，获得鸢尾根黄酮类复合物，其中黄酮苷元纯度10-50％、黄酮苷纯度20-90％。混合比例根据所需要的鸢尾根黄酮类复合物中黄酮苷元和黄酮苷的含量来定。

本发明具体的技术方案是：

将鸢尾根干燥后破碎，粒度达到250-300目即可达到破壁效果；将破碎后鸢尾根按照液固比6:1(V:W)加入到95％乙醇中，控制浸提温度为45～50℃，动态搅拌浸提30～45min，提取2次，离心获得浸提液。将浸提液真空浓缩至原体积的1/6；以浸提残留溶剂为增溶剂，对浓缩液进行超临界CO₂萃取分离，设置萃取压力15-18MPa，萃取温度50-55℃，分离压力5-6MPa，分离温度25-28℃，萃取时间35-45min，获得鸢尾根黄酮苷元提取液；将萃余物再经过大孔树脂柱吸附分离，填料为HPD-600D型大孔树脂，先以去离子水进行洗脱，然后以10％乙醇水(即体积浓度为10％的乙醇水溶液)进行洗脱，最后以75％乙醇水(即体积浓度为75％的乙醇水溶液)进行洗脱，收集75％乙醇水洗脱液流份，即为鸢尾根黄酮苷提取液；将鸢尾根黄酮苷元提取液和鸢尾根黄酮苷提取液分别浓缩、干燥，获得鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物；将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物按比例混合，获得鸢尾根黄酮类复合物。

本发明的具体操作步骤是：

(1)将干燥后鸢尾根通过机械粉碎机进行破壁，过250-300目筛子；

(2)将破碎后鸢尾根溶于6倍体积的95％食用乙醇中，控制浸提温度为45-50℃、动态搅拌(转速60r/min)浸提30-45min，提取2次；

(3)通过离心机获得浸提液，真空浓缩，在旋转蒸发器中进行，控制真空度0.06-0.07MPa，水浴温度55℃，浓缩至原体积的1/6即可；

(4)将浓缩液进行超临界CO₂萃取分离，萃取压力15-18MPa，萃取温度50-55℃，分离压力5-6MPa，分离温度25-28℃，萃取时间35-45min，得鸢尾根黄酮苷元提取液；

(5)将超临界CO₂萃取分离的萃余物再用2倍体积去离子水超声溶解2min，准备上大孔树脂柱，进行吸附分离；

(6)大孔树脂柱吸附分离，分离填料为HPD-600D型大孔树脂，采用去离子水洗脱后，再用10％乙醇水、75％乙醇水(V/V)分别洗脱，接收75％乙醇水洗脱液流份，即为鸢尾根黄酮苷提取液；

(7)将步骤(4)获得的鸢尾根黄酮苷元提取液进行浓缩、干燥后，获得鸢尾根黄酮苷元提取物，测定其中黄酮苷元的纯度高达60％；

将步骤(6)获得的鸢尾根黄酮苷提取液进行浓缩、干燥后，获得鸢尾根黄酮苷提取物，测定其中黄酮苷的纯度高达95％；

根据黄酮苷元和黄酮苷的纯度，按照需要将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物混合，制得黄酮苷元纯度10-50％、黄酮苷纯度20-90％的鸢尾根黄酮类复合物。

备注：

(1)超临界CO₂萃取的增溶剂是指通过添加较高极性物质，以提高CO₂的溶解性的溶剂，如乙醇、水、丙酮等。

(2)HPLC检测黄酮苷元和黄酮苷纯度的条件为：

鸢尾苷标准品(20mg)、鸢尾苷元标准品(20mg)，购于中国食品药品检定研究院；高效液相色谱仪(HPLC)Agilent1260，DAD检测器；色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse PlusC18(5μm4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V:V)，进样量10μL，流速1mL/min，柱温为30℃，检测波长为265nm。

本发明为相关企业，特别是烟草公司提供一种集成细胞破壁－绿色溶剂浸提－超临界流体萃取、大孔树脂吸附分离纯化的方法，制备黄酮苷元纯度20-90％、黄酮苷10-50％的高纯鸢尾根黄酮类复合物。细胞破壁可实现鸢尾根中苷元、黄酮苷的同步高效提取；残留乙醇水为增溶剂协助超临界CO₂萃取、大孔树脂吸附分离选择乙醇水为流动相，绿色、安全、环保。

具体实施方式

实施例1：

(1)首先称取1kg鸢尾根，将鸢尾根通过机械粉碎机进行破壁粉碎，过250目筛子即可；

(2)将破碎后鸢尾根溶于6L的95％食用乙醇中，浸提温度45℃、动态搅拌(转速60r/min)浸提45min，提取2次；

(3)通过离心机获得浸提液，真空浓缩，在旋转蒸发器中进行，控制真空度0.06MPa，水浴温度55℃，浓缩至原体积的1/6即可；

(4)将浓缩液进行超临界CO₂萃取分离，萃取压力15MPa，萃取温度55℃，分离压力5MPa，分离温度25℃，萃取时间45min，得鸢尾根黄酮苷元提取液；

(5)将超临界CO₂萃取余物再用2倍体积去离子水超声溶解2min，准备上大孔树脂柱，进行吸附分离；

(6)大孔树脂柱吸附分离，分离填料为HPD-600D型大孔树脂，采用去离子水洗脱后，再用10％、75％乙醇水(V/V)分别洗脱，分段接收75％乙醇水洗脱流份，即为鸢尾根黄酮苷提取液；

(7)将步骤(4)获得的鸢尾根黄酮苷元提取液进行浓缩、干燥后，获得鸢尾根黄酮苷元提取物，测定其中黄酮苷元的纯度为50.2％；

将步骤(6)获得的鸢尾根黄酮苷提取液进行浓缩、干燥后，获得鸢尾根黄酮苷提取物，测定其中黄酮苷的纯度为94.8％；

将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物按质量比1:2混合，制得黄酮苷元纯度为17.6％、黄酮苷纯度为63.3％的鸢尾根黄酮类复合物。

实施例2：

(1)首先称取1kg鸢尾根，将鸢尾根通过机械粉碎机进行破壁粉碎，过300目筛子即可；

(2)将破碎后鸢尾根溶于6L的95％食用乙醇中，浸提温度50℃、动态搅拌(转速60r/min)浸提35min，提取2次；

(3)通过离心机获得浸提液，真空浓缩，在旋转蒸发器中进行，控制真空度0.07MPa，水浴温度55℃，浓缩至原体积的1/6即可；

(4)将浓缩液进行超临界CO₂萃取分离，萃取压力18MPa，萃取温度50℃，分离压力5.5MPa，分离温度28℃，萃取时间40min，得鸢尾根黄酮苷元提取液；

(5)将超临界CO₂萃取余物再用2倍体积去离子水超声溶解2min，准备上大孔树脂柱，进行吸附分离；

(6)大孔树脂柱吸附分离，分离填料为HPD-600D型大孔树脂，采用去离子水洗脱后，再用10％、75％乙醇水(V/V)分别洗脱，分段接收75％乙醇水洗脱流份，即为鸢尾根黄酮苷提取液；

(7)将步骤(4)获得的鸢尾根黄酮苷元提取液进行浓缩、干燥后，获得鸢尾根黄酮苷元提取物，测定其中黄酮苷元的纯度为47.9％.

将步骤(6)获得的鸢尾根黄酮苷提取液进行浓缩、干燥后，获得鸢尾根黄酮苷提取物，测定其中黄酮苷的纯度为93.7％.

将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物按质量比2:1混合，制得黄酮苷元纯度为32.8％、黄酮苷纯度为32.1％的鸢尾根黄酮类复合物。

Claims (1)

1.一种从鸢尾根中制备烟草用鸢尾根黄酮类物质的方法，其特征在于：以鸢尾根为原料，经细胞破壁粉碎后，采用95％乙醇中温浸提，对浸提液浓缩后进行超临界CO₂萃取分离，所得萃取液即为鸢尾根黄酮苷元提取液；将萃余物再经过大孔树脂柱吸附分离、乙醇水梯度洗脱，获得鸢尾根黄酮苷提取液；将鸢尾根黄酮苷元提取液和鸢尾根黄酮苷提取液分别浓缩、干燥，获得鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物；将鸢尾根黄酮苷元提取物和鸢尾根黄酮苷提取物按比例混合，获得鸢尾根黄酮类复合物；

所述细胞破壁粉碎是将鸢尾根破碎至250-300目；

所述95％乙醇中温浸提是将粉碎后鸢尾根按照液固比6:1加入到95％乙醇中，控制浸提温度为45～50℃，动态搅拌浸提30～45min，提取2次；

所述对浸提液浓缩是将浸提液浓缩至原体积的1/6；

所述超临界CO₂萃取分离是以浸提残留溶剂为增溶剂，设置萃取压力15-18MPa，萃取温度50-55℃，分离压力5-6MPa，分离温度25-28℃，萃取时间35-45min；

所述大孔树脂柱吸附分离填料为HPD-600D型大孔树脂；所述乙醇水梯度洗脱是先以去离子水进行洗脱，然后以10％乙醇水进行洗脱，最后以75％乙醇水进行洗脱，收集75％乙醇水洗脱液流份，即为所述鸢尾根黄酮苷提取液。