CN111620917B - 一种异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、其制备方法及应用 - Google Patents
一种异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种异牡荆素‑2"‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷、其制备方法及应用，属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。所述异牡荆素‑2"‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：步骤1：制备水提取溶液；步骤2：制备碳苷黄酮流份；步骤3：制备异牡荆素‑2"‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷单体流份；步骤4：制备异牡荆素‑2"‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷。本发明还公开了一种异牡荆素‑2"‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷及应用。本发明首次以黄精属植物的地上部位为原料，可以快速得到高含量、高纯度的异牡荆素‑2"‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷，为黄精属植物资源的全面开发和深度利用提供新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、其制备方法及应用，属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。
背景技术
碳苷黄酮类化合物是指糖基直接以C-C键连接在黄酮苷元上，结构稳定，不易水解。此类化合物具有较强的抗氧化、抗辐射能力、降血糖和抗菌抗病毒等生物活性。此类化合物天然低毒，具有广泛的药理活性，越来越受到关注。
异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为碳苷黄酮类化合物，此化合物C环上无羟基且A环上6号位的氢被葡萄糖取代形成C-连黄酮苷。此化合物具有较强的OH自由基的清除能力，还能明显抑制DNA氧化产生的丙二醛，在相同的浓度下其抑制率明显高于槲皮素芦丁等其它黄酮类化合物，还具有较强的降糖和降脂作用。多种碳苷黄酮类化合物具有相似的丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶抑制作用，显示这类化合物具有保肝、护肝作用。
黄精是百合科多年生草本植物，我国广大地区均有分布。目前已发现该属植物40余种，我国约有31种，种质资源丰富。中药黄精化学成分多样，药理活性广泛，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗肿瘤和调节免疫等作用，具有很好的开发与应用价值。
黄精地下部位化学成分以多糖、皂苷、黄酮类化合物为主，其中黄酮以高异黄酮、异黄酮类亚型为主，且本申请的发明人发现，黄精地下部位碳苷黄酮类化合物含量较低，这与多数学者的研究成果基本一致。此外，目前并没有从黄精地上部位或者地下部位分离得到异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法。本发明首次以黄精属植物的地上部位为原料，可以快速得到高含量、高纯度的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，为黄精属植物资源的全面开发和深度利用提供新途径。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备水提取溶液
取新鲜的黄精属植物的地上部位为原料，清洗，切碎，进行提取，过滤去掉残渣，减压浓缩至无醇味，得到水提取溶液；
步骤2：制备碳苷黄酮流份
将步骤1得到的水提取溶液以羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20进行柱层析，先用1-4倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用2-6倍柱体积的洗脱剂进行梯度洗脱，然后通过薄层色谱检测，收集合并碳苷黄酮流份；
步骤3：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份
将步骤2得到的碳苷黄酮流份减压浓缩至无醇味，得到混合溶液；
取小孔径分离树脂加压装柱，先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加2-3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉；
将上述混合溶液缓慢滴加上样，上样完毕静置1h-1.5h，先用2倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用3倍柱体积的与步骤2相同的洗脱剂进行梯度洗脱，然后通过薄层色谱检测，收集合并异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份；
步骤4：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
将步骤3得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份减压浓缩至无醇味，得浸膏，再经干燥，即得到异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法的原理是：
本申请的发明人，从黄精属植物的地上部位中发现高含量的黄精多糖和碳苷黄酮类化合物，在碳苷黄酮类成分中异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为主要成分，通过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱和小孔径分离树脂的纯化可以得到该化合物高纯度的单体。
其中，异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的化学结构式如下：
本发明异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法的有益效果是：
1、本发明首次以黄精属植物的地上部位为原料，可以快速得到含量为1.2％、高纯度(纯度94.2％以上)的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，为黄精属植物资源的全面开发和深度利用提供新途径。
2、本发明的制备方法，操作简单快速，对环境污染较小，原料廉价易得，易于大量生产，具有广阔的应用前景。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述黄精属植物地上部位包括黄精、滇黄精和多花黄精中的任意一种的茎和/或叶。
采用上述进一步的有益效果是：黄精、滇黄精和多花黄精为同科同属不同种的植物，均为百合科Liliaceae黄精属，都可以用作黄精入药。黄精(Polygonatum sibiricumRedouté)，别名：鸡头黄精、黄鸡菜、笔管菜、爪子参、老虎姜、鸡爪参；滇黄精，别名：节节高、仙人饭；多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)，别名：山捣臼、山姜、多花黄精、白芨黄精、白及黄精、冰盘七、长叶黄精。本申请发现，黄精的茎和/或叶中，含有大量的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分。目前，黄精的地下部位并没有发现异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分，该成分在其它植物中含量远低于在黄精中的含量。
进一步，步骤1中，所述切碎的粒径为2cm-3cm。
采用上述进一步的有益效果是：切碎的粒径为2cm-2.5cm，更有利于后续黄精地上部位中的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分的提取。
进一步，步骤1中，所述提取采用常温浸提、加热提取和超声提取中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，能将黄精地上部位中的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分提取出来。
更进一步，所述常温浸提的具体方法是：在清洗切碎后的原料中，加入原料8-15倍重量的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种，于室温提取，每次3d，共2-4次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，能将黄精地上部位中的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分提取出来。
更进一步，所述加热提取的具体方法是：在清洗切碎后的原料中，加入原料8-15倍重量的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种，于30℃-60℃提取，每次3h-7h，共2-4次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，能将黄精地上部位中的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分提取出来。
更进一步，所述超声提取的具体方法是：在清洗切碎后的原料中，加入原料5-15倍重量的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种，采用功率为100W，频率为40kHz超声提取，每次0.5h，共3次。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，能将黄精地上部位中的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分快速提取出来。
进一步，步骤1中，所述减压浓缩的压力为50KPa-100KPa，温度为50℃。
采用上述进一步的有益效果是：减压浓缩采用上述参数，可以免除后续的脱色工序，避免温度过高使化合物结构发生变化。
进一步，步骤2中，所述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20的规格为10cm×100cm，填料粒径为27μm-163μm。
采用上述进一步的有益效果是：采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20，可以过滤掉提取物中的大量糖，同时对黄酮碳苷组分有效富集。上述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20购自美国GE公司。
进一步，步骤2中，所述洗脱剂为体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：不同的洗脱浓度使不同极性不同类型的化合物有效富集，同时除去少量杂质。
进一步，步骤2中，所述梯度洗脱为每10％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
采用上述进一步的有益效果是：不同的洗脱浓度使不同极性不同类型的化合物有效富集，同时除去少量杂质，该洗脱速度和流份比例可以提高目标化合物分离效率。
进一步，步骤2中，所述薄层色谱检测的条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，显黄色和/或黄绿色的洗脱部位，即为碳苷黄酮流份。
采用上述进一步的有益效果是：通过上述检测参数，可以收集得到碳苷黄酮流份。
上述显色剂的配制方法是：准确称量0.789g的FeCl3固体，溶解于100ml无水乙醇中，充分震荡至完全溶解，即得。
进一步，步骤3中，所述减压浓缩的压力为50KPa-100KPa，温度为50℃。
采用上述进一步的有益效果是：减压浓缩采用上述参数，可以使溶剂快速有效的除去，同时避免温度过高使化合物的结构发生变化。
进一步，步骤3中，所述小孔径分离树脂为Diaion HP20SS，层析柱规格为5cm×100cm，填料粒径为75μm-150μm；或者为Diaion SP20SS，层析柱规格为6cm×100cm，填料粒径为63μm-75μm。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述小孔树脂的可使不同的碳苷黄酮类化合物有效分离。其中，Diaion HP20SS和Diaion SP20SS均购自日本三菱化学。
进一步，步骤3中，所述梯度洗脱为每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
采用上述进一步的有益效果是：不同的洗脱浓度使不同极性不同类型的化合物有效富集，同时除去少量杂质，该洗脱速度和流份比例使目标化合物高效分离。
进一步，步骤3中，所述薄层色谱检测的条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，显黄色单一点的洗脱部位，即为异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份。
采用上述进一步的有益效果是：通过上述检测参数，可以收集得到异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份。
进一步，步骤4中，所述减压浓缩的压力为50KPa-100KPa，温度为50℃。
采用上述进一步的有益效果是：减压浓缩采用上述参数，可以使溶剂快速有效的除去，同时避免温度过高使化合物的结构发生变化。
进一步，步骤4中，所述干燥的温度为45℃，时间为12h。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，干燥的更加彻底。
本发明的目的之二，是提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法。本发明的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，由上述制备方法制备得到，具有较好的抑制胰脂肪酶活性，可以用于制备减肥产品，具有广阔的市场空间。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种如上所述的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法的有益效果是：
本发明的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，由上述制备方法制备得到，具有较好的抑制胰脂肪酶活性，可以用于制备减肥产品，具有广阔的市场空间。
本发明的目的之三，是提供一种异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在减肥产品中的应用。本发明的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可用于制备减肥产品，也有比较好的减肥效果，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备减肥产品中的应用。
本发明的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在减肥产品中的应用的有益效果是：
本发明进行了异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对胰脂肪酶活性抑制作用的研究，结果显示，本发明制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有较好的抑制胰脂肪酶活性，可以用于制备减肥产品，能显著降低减肥产品的副作用，同时也有比较高的减肥效率，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述减肥产品为药物制剂、保健食品或者化妆品。
采用上述进一步的有益效果是：可以将本发明上述制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷用于制备减肥产品，这些减肥产品可以是药物制剂、保健食品或者化妆品。为实现上述减肥产品，需在制备这些产品时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、胶粘剂、保湿剂、赋形剂、软化剂等，填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等，崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等，润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等，助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等，粘合剂包括：水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液、聚乙烯比咯烷酮等，甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等，矫味剂包括：甜味剂及各种香精，胶粘剂包括明胶、淀粉、琼脂、甘露聚糖、海藻酸、聚丙烯酸、聚丙烯酸盐类、糊精、甲基纤维素、PVP、甲基乙烯基醚、顺丁烯二酸酐的共聚物、阿拉伯胶、西黄芪胶、梧桐胶、槐树豆胶等，保湿剂包括乙二醇、二甘醇、聚乙二醇、甘油、山梨醇、丙二醇等，赋形剂包括高岭土、粘土、滑石粉、碳酸钙、氧化锌等，软化剂包括蓖麻油及其它油脂等。
进一步，所述减肥产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：减肥产品可以制成多种剂型，以满足消费者不同的需求，更加灵活方便。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的1H－NMR谱；
图2为本发明实施例1制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的13C－NMR谱；
图3为本发明实施例1制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的LCMS-IT-TOF谱；
图4为本发明实施例1步骤2制备得到的碳苷黄酮流份的HPLC谱；
图5为本发明实施例1步骤3制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的HPLC谱。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备水提取溶液
取1.5kg新鲜的黄精的地上部位的茎为原料，清洗，切碎至2cm-3cm。
加入原料8倍重量的体积浓度为80％的乙醇水溶液，于50℃提取4h，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料8倍重量的体积浓度为80％的乙醇水溶液，于50℃提取4h，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料8倍重量的体积浓度为80％的乙醇水溶液，于50℃提取4h，第三次过滤，得第三次滤液。
合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于50KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，过滤去掉残渣，得到水提取溶液。
步骤2：制备碳苷黄酮流份
将步骤1得到的水提取溶液以羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20进行柱层析，所述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20的规格为10cm×100cm，填料粒径为27μm-163μm。
先用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用4倍柱体积的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
薄层色谱检测，条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，收集合并显黄色和/或黄绿色的洗脱部位，即为碳苷黄酮流份，HPLC谱图如图4所示。
步骤3：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份
将步骤2得到的碳苷黄酮流份于50KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，得到混合溶液。
取小孔径分离树脂Diaion HP20SS加压装柱，其层析柱规格为5cm×100cm，填料粒径为75μm-150μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将上述混合溶液缓慢滴加上样，上样完毕静置1h，先用2倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用3倍柱体积的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
薄层色谱检测，条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，收集合并显黄色单一点的洗脱部位，即为异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份。
步骤4：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
将步骤3得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份于50KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，得浸膏，再于45℃，干燥12h，即得到10.6g异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，占总提取物含量的1.2％。
结构鉴定：
1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δ:7.73(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.89(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),6.56(1H,s,H-8),6.53(1H,s,H-3),4.92(1H,d,J＝9.8Hz,H-1″),4.47(1H,d,J＝7.9Hz,H-1″′),4.51–3.13(10H,m,糖上质子)。1H－NMR谱如图1所示。
13C NMR(125MHz,Acetone-d6)δ:182.6(C-4),164.5(C-2),163.2(C-7),160.9(C-5),157.2(C-9),157.1(C-4′),128.4(C-2′,6′),121.6(C-1′),116.1(C-3′,5′),107.7(C-6),104.4(C-1″′),104.0(C-10),102.7(C-3),94.6(C-8),80.8(C-5″),80.1(C-2″),78.3(C-3″),76.1(C-3″′),75.9(C-5″′),74.4(C-2″′),72.0(C-4″′),69.9(C-1″),69.7(C-4″),61.3(C-6″),61.2(C-6″′)。13C－NMR谱如图2所示。
LCIT-TOF-MS：m/z 593.1559(M-H)(计算值C27H30O15,594.1585)。LCMS-IT-TOF谱如图3所示。
通过1H-NMR、13C-NMR和LCMS-IT-TOF波谱数据鉴定化合物结构，数据结果与文献报道一致，故鉴定该化合物为异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
纯度检测：采用HPLC分析法检测纯度。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：CH3CN-H2O，0min-40min,5-70％的CH3CN；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm。HPLC谱如图5所示。高效液相面积归一法测得本实施得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷纯度为94.2％。
本实施例还提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本实施例还提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备减肥产品中的应用。
所述减肥产品为药物制剂、保健食品或者化妆品。
所述减肥产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。
实施例2
本实施例的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备水提取溶液
取1.5kg新鲜的滇黄精的地上部位的茎和叶为原料，清洗，切碎至2cm-3cm。
加入原料10倍重量的体积浓度为60％的甲醇水溶液，于室温提取3d，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料10倍重量的体积浓度为60％的甲醇水溶液，于室温提取3d，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料10倍重量的体积浓度为60％的甲醇水溶液，于室温提取3d，第三次过滤，得第三次滤液。
合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于80KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，过滤去掉残渣，得到水提取溶液。
步骤2：制备碳苷黄酮流份
将步骤1得到的水提取溶液以羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20进行柱层析，所述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20的规格为10cm×100cm，填料粒径为27μm-163μm。
先用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用4倍柱体积的体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
薄层色谱检测，条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，收集合并显黄色和/或黄绿色的洗脱部位，即为碳苷黄酮流份。
步骤3：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份
将步骤2得到的碳苷黄酮流份于80KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，得到混合溶液。
取小孔径分离树脂Diaion SP20SS加压装柱，其层析柱规格为6cm×100cm，填料粒径为63μm-75μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将上述混合溶液缓慢滴加上样，上样完毕静置1-2h，先用2倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用3倍柱体积的体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
薄层色谱检测，条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，收集合并显黄色单一点的洗脱部位，即为异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份。
步骤4：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
将步骤3得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份于80KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，得浸膏，再于45℃，干燥12h，即得到11.5g异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，占总提取物含量1.3％。
结构鉴定同实施例1。
纯度检测同实施例1，纯度为95.1％。
本实施例还提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本实施例还提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备减肥产品中的应用。
所述减肥产品为药物制剂、保健食品或者化妆品。
所述减肥产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。
实施例3
本实施例的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备水提取溶液
取1.5Kg新鲜的多花黄精的地上部位的叶为原料，清洗，切碎至2cm-3cm。
加入原料15倍重量的体积浓度为10％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz超声提取0.5h，第一次过滤，得第一次滤液和第一次滤渣；在第一次滤渣里加入原料15倍重量的体积浓度为10％的丙酮水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz超声提取0.5h，第二次过滤，得第二次滤液和第二次滤渣；在第二次滤渣里加入原料15倍重量的体积浓度为10％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz超声提取0.5h，第三次过滤，得第三次滤液。
合并第一次滤液、第二次滤液和第三次滤液，于100KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，过滤去掉残渣，得到水提取溶液。
步骤2：制备碳苷黄酮流份
将步骤1得到的水提取溶液以羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20进行柱层析，所述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20的规格为10cm×100cm，填料粒径为27μm-163μm。
先用3倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用4倍柱体积的体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
薄层色谱检测，条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，收集合并显黄色和/或黄绿色的洗脱部位，即为碳苷黄酮流份。
步骤3：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份
将步骤2得到的碳苷黄酮流份于100KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，得到混合溶液。
取小孔径分离树脂Diaion SP20SS加压装柱，其层析柱规格为6cm×100cm，填料粒径为63μm-75μm。先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉。
将上述混合溶液缓慢滴加上样，上样完毕静置1.5h，先用2倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用3倍柱体积的体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
薄层色谱检测，条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，收集合并显黄色单一点的洗脱部位，即为异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份。
步骤4：制备异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
将步骤3得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份于100KPa，温度为50℃减压浓缩至无醇味，得浸膏，再于45℃，干燥12h，即得到11.2g异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
结构鉴定同实施例1。
纯度检测同实施例1，纯度为94.8％。
本实施例还提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本实施例还提供上述异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备减肥产品中的应用。
所述减肥产品为药物制剂、保健食品或者化妆品。
所述减肥产品的剂型为口服制剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、涂剂和喷雾剂中的任意一种。
实验例：异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷胰脂肪酶活性抑制作用研究
以4-MUO作为底物评估胰腺脂肪酶抑制活性。待测样品为实施例1得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，阳性对照品为临床药物奥利司他。准确称取5.942mg待测样品和4.957mg阳性对照品药物溶解于1ml DMSO中，然后用PBS(pH值为7.4)稀释至不同浓度，备用。在96孔微量滴定板(Corning Costar，Cambridge，MA)中，将25μl样品溶液、25μl溶于PBS的胰脂肪酶溶液(10mg/ml)和50μl溶于PBS的4-MUO溶液(0.1mM)进行混合，以开始酶反应。将该96孔微量滴定板在25℃下保持20分钟，然后加入100μL 0.1M柠檬酸钠(pH值为4.2)以终止反应。每个浓度的测试样品一式三份进行。在Genios酶标仪(Tecan Group，Mblnnedorf，瑞士)上，测量该96孔微量滴定板中在320nm的激发波长和450nm的激发波长下的吸光度(A)值。根据下式计算脂肪酶抑制率。
脂肪酶抑制率＝[1-(A样品-A样品对照)/(A空白-A空白对照)]×100％，式中，A样品为加入样品和活性酶反应后的吸光值；A样品为加入样品和失活酶反应后的吸光值；A空白为加入活性酶和PBS反应后的吸光值；A空白对照为加入失活酶和PBS反应后的吸光值，所有反应组中均有4-MUO。
根据不同的抑制率经IC50计算软件计算可得，异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的胰脂肪酶活性抑制结果IC50为85.6μM，阳性药奥利司他的IC50为47.5μM。由实验结果可知，本发明实施例1制备得到的异牡荆素-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有较好的抑制胰脂肪酶活性，在减肥产品的开发上具有开发和应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备水提取溶液
取新鲜的黄精属植物的地上部位为原料，清洗，切碎，进行提取，过滤去掉残渣，减压浓缩至无醇味，得到水提取溶液；
步骤2：制备碳苷黄酮流份
将步骤1得到的水提取溶液以羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20进行柱层析，先用1-4倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用2-6倍柱体积的洗脱剂进行梯度洗脱，然后通过薄层色谱检测，收集合并碳苷黄酮流份；其中，所述洗脱剂为体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种；所述梯度洗脱为每10％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度为2ml/min；
步骤3：制备异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份
将步骤2得到的碳苷黄酮流份减压浓缩至无醇味，得到混合溶液；
取小孔径分离树脂加压装柱，先用3倍柱体积的甲醇活化平衡柱子，再加2-3倍柱体积的去离子水将甲醇置换掉；
将上述混合溶液缓慢滴加上样，上样完毕静置1h-1.5h，先用2倍柱体积的去离子水进行洗脱，再用3倍柱体积的与步骤2相同的洗脱剂进行梯度洗脱，然后通过薄层色谱检测，收集合并异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份；所述梯度洗脱为每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度为2ml/min；
步骤4：制备异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
将步骤3得到的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份减压浓缩至无醇味，得浸膏，再经干燥，即得到异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述黄精属植物地上部位包括黄精、滇黄精和多花黄精中的任意一种的茎和/或叶；所述切碎的粒径为2cm-3cm；所述减压浓缩的压力为50KPa-100KPa，温度为50℃。
3.根据权利要求1所述的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述提取采用常温浸提、加热提取和超声提取中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述常温浸提的具体方法是：在清洗切碎后的原料中，加入原料8-15倍重量的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种，于室温提取，每次3d，共2-4次；
所述加热提取的具体方法是：在清洗切碎后的原料中，加入原料8-15倍重量的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种，于30℃-60℃提取，每次3h-7h，共2-4次；
所述超声提取的具体方法是：在清洗切碎后的原料中，加入原料5-15倍重量的体积浓度为10％-80％的甲醇水溶液和体积浓度为10％-80％的乙醇水溶液中的任意一种，采用功率为100W，频率为40kHz超声提取，每次0.5h，共3次。
5.根据权利要求1所述的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20为10cm×100cm，填料粒径为27μm-163μm；所述薄层色谱检测的条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl 3-乙醇溶液，显黄色和/或黄绿色的洗脱部位，即为碳苷黄酮流份。
6.根据权利要求1所述的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述减压浓缩的压力为50KPa-100KPa，温度为50℃；所述小孔径分离树脂为Diaion HP20SS，层析柱规格为5cm×100cm，填料粒径为75μm-150μm；或者为DiaionSP20SS，层析柱规格为6cm×100cm，填料粒径为63μm-75μm；所述薄层色谱检测的条件为：硅胶GF254板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯：甲酸体积比1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl3-乙醇溶液，显黄色单一点的洗脱部位，即为异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷单体流份。
7.根据权利要求1所述的异牡荆素-2"-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述减压浓缩的压力为50KPa-100KPa，温度为50℃；所述干燥的温度为45℃，时间为12h。
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