CN110526952B - 一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化合物提取应用领域，公开了一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法。具体步骤为：(1)用有机溶剂对粗糙凤尾蕨茎叶进行提取及萃取；(2)聚酰胺树脂柱色谱分离及中压制备；(3)高效液相色谱检测及制备。本发明制备的黄酮苷纯度较高，经高效液相色谱法检测黄酮苷的含量可达到95％以上。该提取制备方法操作简单、获得的纯度较高，生产成本低、便于产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于化合物提取应用领域，本发明具体涉及一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法。
背景技术
黄酮类化合物是一类多酚类抗氧化剂，是葛根、补骨脂、黄苳、银杏、沙棘、槐米等临床常用中药材的主要活性成分。该类化合物数量众多，结构复杂，具有许多重要的生理活性，如抗肿瘤、抗糖尿病、保肝作用、防治心脑血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎等。现代药理学研究表明，黄酮类化合物作为一类重要天然化合物，在化学性肝损伤、免疫性肝损伤、药物性肝损伤和酒精性肝损伤等方面疗效显著。
凤尾蕨属植物多数具有消肿、解毒、止痢等功效，民间常将该属植物用于治疗腹泻、肠炎、肺咳血、外伤出血、咽喉肿痛、痢疾、肾炎、风湿等疾病。凤尾蕨属植物化学成分多样，主要有黄酮、二萜、倍半萜、挥发油、多糖等类型的化合物。该属部分植物提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。
近年来，许多研究者对天然产物中有效成分的提取、纯化等研究日益关注。但对凤尾蕨属植物研究较少，而且现有的黄酮苷提取方法，或提纯工艺较为繁琐，费时费事，生产成本高，或收率较低，尚无规模化生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法，该提取制备方法操作简单、获得的纯度较高，生产成本低、便于产业化生产。所述粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷具有下述式1结构：
本发明同时请求保护上述粗糙凤尾蕨中提取的黄酮苷的提取制备方法，本发明采用的技术方案为：
一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法；具体步骤为：
(1)用有机溶剂对粗糙凤尾蕨茎叶进行提取及萃取；
干燥粗糙凤尾蕨茎叶25kg，粉碎，将粉碎好的原材料颗粒放置于200L的提取罐中，用95％乙醇以料液比为1:5浸泡6-8小时后，加热回流提取3-5次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩得到粗糙凤尾蕨茎叶粗提物浸膏；浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四个部位；
(2)聚酰胺树脂柱色谱分离及中压制备；
其中乙酸乙酯部位用型号为14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇：30％、60％、95％进行梯度洗脱，减压回收得到水、30％洗脱物、60％洗脱物和95％洗脱物四个部位；将60％洗脱物浸膏进行中压制备液相色谱分离，用体积浓度为10％-80％甲醇梯度洗脱，得到60个组分，色谱柱填料为ODS；
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，确定具体组分中可能含有黄酮苷成分，对较好成分用半制备高效液相色谱进行制备，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相：水+0.1％三氟乙酸，B相：甲醇，洗脱条件：45％甲醇或46％甲醇或47％甲醇等度洗脱，流速为3.0mL/min，紫外检测波长为210nm和254nm。
进一步的，步骤(1)中的料液比单位为kg/L。
制备后单体化合物的结构鉴定：通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)等手段对单体化合物进行结构鉴定。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明提取制备方法制备的黄酮苷纯度较高，经高效液相色谱法检测黄酮苷的纯度可达到95％以上。本发明的原料为粗糙凤尾蕨，广泛分布在华南和西南地区，但目前对凤尾蕨属植物的研究较少，本发明能够充分利用我国的药用植物资源。且从粗糙凤尾蕨中提纯因组分多，不易提到纯度高的活性成分，本申请的制备方法得到的黄酮苷纯度较高。且本发明所用的原材料粗糙凤尾蕨有25kg，这样大规模的提取相比之下，实验数据较为准确，提取及纯化技术具有较大的参考价值。且大量的提取适用于企业产业化推广使用应用。本发明分离的黄酮苷为首次在粗糙凤尾蕨中分离得到，本发明为充分利用黄酮苷的药用价值提供了高纯度的制备方法。
附图说明
图1是实施例1中提取制备的黄酮苷高效液相色谱检测图。
图2是实施例1中提取制备的黄酮苷核磁共振氢谱图。
图3是实施例1中提取制备的黄酮苷核磁共振碳谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法；具体步骤为：
(1)用有机溶剂对粗糙凤尾蕨茎叶进行提取及萃取；
干燥粗糙凤尾蕨茎叶25kg，粉碎，将粉碎好的原材料颗粒放置于200L的提取罐中，用95％乙醇以料液比为1:5(kg/L)浸泡6小时后，加热回流提取3次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩得到粗糙凤尾蕨茎叶粗提物浸膏1.2kg。浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得石油醚(260g)、乙酸乙酯(400g)、正丁醇(300g)和水(350g)四个部位。
(2)聚酰胺树脂柱色谱分离及中压制备；
其中乙酸乙酯部位用型号为14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到水、30％洗脱物、60％洗脱物和95％洗脱物四个部位。将60％洗脱物浸膏进行中压制备液相色谱分离，用体积浓度为10％-80％甲醇梯度洗脱，得到60个组分，色谱柱填料为ODS。
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，确定组分9中可能含有黄酮苷成分，通过对波长、流动相的改变找到分离度较好的制备条件，对较好成分用半制备高效液相色谱进行制备，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相：水+0.1％三氟乙酸，B相：甲醇，洗脱条件：45％甲醇等度洗脱，流速为3.0mL/min，检测波长为210nm和254nm。制备后的样品经分析型高效液相检测谱图如图1所示，根据谱图分析黄酮苷纯度为98.65％。
单体化合物的结构鉴定
通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)等手段对单体化合物进行结构鉴定。1H-NMR和13C-NMR检测图谱见附图2和图3。
实施例2
一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法；具体步骤为：
(1)用有机溶剂对粗糙凤尾蕨茎叶进行提取及萃取；
干燥粗糙凤尾蕨茎叶25kg，粉碎，将粉碎好的原材料颗粒放置于200L的提取罐中，用95％乙醇以料液比为1:5(kg/L)浸泡8小时后，加热回流提取3次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩得到粗糙凤尾蕨茎叶粗提物浸膏；1.2kg。浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得石油醚(260g)、乙酸乙酯(400g)、正丁醇(300g)和水(350g)四个部位。
(2)聚酰胺树脂柱色谱分离及中压制备；
其中乙酸乙酯部位用型号为14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到水、30％洗脱物、60％洗脱物和95％洗脱物四个部位。将60％洗脱物浸膏进行中压制备液相色谱分离，用体积浓度为10％-80％甲醇梯度洗脱，得到60个组分，色谱柱填料为ODS。
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，确定组分9中可能含有黄酮苷成分，通过对波长、流动相的改变找到分离度较好的制备条件，对较好成分用半制备高效液相色谱进行制备，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相：水+0.1％三氟乙酸，B相：甲醇，洗脱条件：44％甲醇等度洗脱，流速为3.0mL/min，检测波长为210nm和254nm。制备后的样品经分析型高效液相检测黄酮苷纯度为95.35％。
实施例3
一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法；具体步骤为：
(1)用有机溶剂对粗糙凤尾蕨茎叶进行提取及萃取；
干燥粗糙凤尾蕨茎叶25kg，粉碎，将粉碎好的原材料颗粒放置于200L的提取罐中，用95％乙醇以料液比为1:5(kg/L)浸泡8小时后，加热回流提取4次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩得到粗糙凤尾蕨茎叶粗提物浸膏；1.2kg。浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得石油醚(260g)、乙酸乙酯(400g)、正丁醇(300g)和水(350g)四个部位。
(2)聚酰胺树脂柱色谱分离及中压制备；
其中乙酸乙酯部位用型号为14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到水、30％洗脱物、60％洗脱物和95％洗脱物四个部位。将60％洗脱物浸膏进行中压制备液相色谱分离，用体积浓度为10％-80％甲醇梯度洗脱，得到60个组分，色谱柱填料为ODS。
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，确定组分9中可能含有黄酮苷成分，通过对波长、流动相的改变找到分离度较好的制备条件，对较好成分用半制备高效液相色谱进行制备，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相：水+0.1％三氟乙酸，B相：甲醇，洗脱条件：47％甲醇等度洗脱，流速为3.0mL/min，检测波长为210nm和254nm。制备后的样品经分析型高效液相检测黄酮苷纯度为95.15％。
对比例1
一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法；具体步骤为：
步骤(1)、步骤(2)同实施例1；
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分9中含有黄酮苷成分；将组分9的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，洗脱条件：50％甲醇等度洗脱，流速为3mL/min，紫外检测波长为210nm和254nm。化合物之间没有实现基线分离，纯度较低。经高效液相检测可得黄酮苷纯度为81.57％。
对比例2
一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法；具体步骤为：
步骤(1)、步骤(2)同实施例1；
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分9中含有黄酮苷成分；将组分9的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，洗脱条件：40％甲醇等度洗脱，流速为3mL/min，紫外检测波长为210nm和254nm。化合物的保留时间过长，分离度不好，纯度较低。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (1)
1.一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法，其特征是，粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷具有下述式1结构：
制备方法具体步骤为：
(1)用有机溶剂对粗糙凤尾蕨茎叶进行提取及萃取；
干燥粗糙凤尾蕨茎叶25kg，粉碎，将粉碎好的原材料颗粒放置于200L的提取罐中，用95％乙醇以料液比为1:5浸泡6小时后，加热回流提取3次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩得到粗糙凤尾蕨茎叶粗提物浸膏1.2kg；浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得石油醚260g、乙酸乙酯400g、正丁醇300g和水350g四个部位；
(2)聚酰胺树脂柱色谱分离及中压制备；
其中乙酸乙酯部位用型号为14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇：30％、60％、95％进行梯度洗脱，减压回收得到水、30％洗脱物、60％洗脱物和95％洗脱物四个部位；将60％洗脱物浸膏进行中压制备液相色谱分离，用体积浓度为10％-80％甲醇梯度洗脱，得到60个组分，色谱柱填料为ODS；
(3)高效液相色谱检测及制备；
经过中压制备的60个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，确定具体组分9中可能含有黄酮苷成分，对较好成分用半制备高效液相色谱进行制备，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相：水+0.1％三氟乙酸，B相：甲醇，洗脱条件：45％甲醇等度洗脱，流速为3.0mL/min，紫外检测波长为210nm和254nm。
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