CN116265428B - 粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物、制备方法、应用和药物 - Google Patents
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Abstract
粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物、制备方法、应用和药物，属于化合物领域，能抑制神经细胞氧化应激损伤、促进海马神经元分泌脑源性神经营养因子、降低炎症因子TNF‑α和IFN‑γ表达、调控海马神经干细胞向神经元分化的作用，化合物结构如下所示：
Description
技术领域
本发明属于化合物领域，涉及一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物及其作用和使用所述化合物制备的药物。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的神经退行性疾病，临床表现为记忆力减退和认知功能障碍，现已在世界范围内成为威胁公共健康的重要因素。越来越多的研究表明，神经退行性疾病的发生发展与神经细胞的氧化应激损伤密切相关。过度产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)将在神经细胞中蓄积，并造成细胞的氧化应激损伤，进而引起多种凋亡因子的释放，诱导细胞凋亡。H2O2是实验室诱导细胞氧化应激损伤的常用试剂，并被证实能有效诱导神经细胞的凋亡。利用H2O2建立氧化应激损伤模型，能够评价化合物化学成分及其衍生物的抗氧化能力。若测试化合物能够提升H2O2-N2a细胞的存活率，则表明化合物具有治疗AD的可能性。
此外，利用酶联免疫吸附实验能够评估化合物对高表达APP基因NSCs细胞因子分泌的影响。脑内神经元的受损和缺失在AD发生发展的过程中具有重要作用，因此补充或替代受损神经元，重建神经功能网络是治疗AD或延缓其病程的重要策略。目前，从神经再生角度出发思考治疗AD的思路主要分为两种。即移植外源性NSCs和激活内源性NSCs，相较而言，移植外源性NSCs存在来源不足、免疫排斥、侵入性移植等问题，因此激活内源性NSCs，促进其增殖和向神经元分化是治疗AD的有效策略。
越来越多的证据表明，海马NSCs的增殖、分化及迁移等行为高度依赖其所处的微环境，但随着AD病程的进展，患者脑内的微环境逐渐恶化，从而妨碍了NSCs生物学功能的发挥。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是脑内微环境中最重要的组成部分，能通过酪氨酸激酶B特异性结合促进突出可塑性，发挥神经保护和促进神经发生的作用。研究表明，成年海马神经元能自身分泌BDNF并作用于自身，从而促进树突的发育；且将BDNF与神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子联合使用能提高NSCs体外增殖能力。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)是脑内微环境中常见的两种促炎因子，TNF-α能通过促进小胶质细胞活化和神经元坏死性凋亡诱导小鼠神经功能障碍。有研究表明，桃叶珊瑚苷能通过激活NF-κB信号通路抑制LPS/IFN-γ诱导的BV2小胶质细胞炎症作用并改善AD模型小鼠的学习与记忆能力。因此，测试化合物若能有效促进BDNF的分泌，并降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达，则能表明其具有治疗AD的可能性。
研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在促进海马NSCs向神经元分化的过程中扮演着重要角色。例如，淫羊藿次苷Ⅱ能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进GSK-3β的磷酸化，进而诱导NSCs向神经元分化。在分化培养条件下，若化合物能显著上调Wnt-3a、β-catenin、NeuN蛋白的表达，而抑制剂XAV-939能减弱这种作用。则化合物能提高Neuro D1和Prox1的表达，促进NSCs向神经元分化，则能表明其具有治疗AD的可能性。
发明内容
本发明旨在制备粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，并通过实验验证粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，可同时既有效抑制神经细胞氧化应激损伤，又同时有效促进海马神经元分泌脑源性神经营养因子，还同时有效降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达，并同时有效调控海马神经干细胞向神经元分化。
基于上述目的，本发明提供如下技术方案：在第一方面中，本发明实施例记载一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，其结构如通式A：
在第二方面中，本发明实施例记载一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，其结构如通式B：
在一个方面中，本发明提出一种所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物的制备方法，通式A化合物的制备包括如下步骤：
用95％乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材获得提取液，提取液减压回收得到浸膏，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物；
以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水及30％，60％，95％乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4；
用中压制备液相色谱对Fr.1部位进行分离获得W1-W86的86个流份，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱；
制备型高效液相色谱对W19进行分离获得通式A所示粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，色谱条件为CH3CN-H2O。
在一个方面中，本发明提出一种所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物的制备方法，通式B化合物的制备包括如下步骤：
用95％乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材获得提取液，提取液减压回收得到浸膏，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物；
以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水及30％，60％，95％乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4；
用中压制备液相色谱对Fr.1部位进行分离获得W1-W86的86个流份，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱；
制备型高效液相色谱对W35进行分离获得通式B所示粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，色谱条件为MeOH-H2O。
在一个方面中，本发明提出一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在抑制神经细胞氧化应激损伤中的作用。
在一个方面中，本发明提出一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在促进海马神经元分泌脑源性神经营养因子中的作用。
在一个方面中，本发明提出一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达中的作用。
在一个方面中，本发明提出一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在调控海马神经干细胞向神经元分化中的作用。
在一个方面中，本发明提出一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
在一个方面中，本发明提出一种治疗阿尔茨海默病的药物，包含治疗有效量的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物。
有益效果：本发明所发现的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，可同时既有效抑制神经细胞氧化应激损伤，又同时有效促进海马神经元分泌脑源性神经营养因子，还同时有效降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达，并同时有效调控海马神经干细胞向神经元分化。
附图说明
图1化合物A的结构和1H–1H COSY(-)和HMBC(→)相关信号，其中
A：结构
B：1H–1H COSY(-)和HMBC(→)相关信号。
图2化合物A的ECD的计算值和实测值对比图。
图3化合物B的结构和1H–1H COSY(-)和HMBC(→)相关信号，其
A：结构
B：1H–1H COSY(→)和HMBC(→)相关信号。
图4化合物A和化合物B改善H2O2-N2a的细胞形态并促进存活的实验图，其中
A：化合物A和化合物B预保护24h后H2O2-N2a细胞形态代表图
B：化合物B量效曲线
C：化合物A量效曲线
D：各浓度化合物A和化合物B预保护24h存活率的比较，其中标尺＝50μm，##P＜0.01vs Con组,＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs Mod组。
图5化合物A和化合物B对H2O2-N2a具有神经保护作用实验图，其中
A：Hoechst33258染色代表图
B：免疫荧光化学法检测Caspase3表达代表图
C：Hoechst33258染色定量统计图
D：免疫荧光化学法检测Caspase3表达定量统计图
E：LDH释放量统计图
F：MDA含量统计图
G：SOD含量统计图，其中标尺＝50μm，##P＜0.01vs Con组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vsMod组，&P＜0.05，&&P＜0.01vs Rg1组。
图6化合物A和化合物B减少APP基因转染N2a细胞的凋亡实验图，其中
A：CCK-8法检测细胞存活率
B：LDH释放量统计图
C：Tunel法检测APP-N2a细胞凋亡统计图
D：MDA含量统计图
E：SOD含量统计图
F：Tunel法检测APP-N2a凋亡，其中标尺＝50μm，##P＜0.01vs Con组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs Mod组，&P＜0.05vs Rg1组。
图7NSCs的培养和鉴定实验图，其中
A：培养的海马神经细胞形成神经球，同时表达Sox-2和Nestin蛋白
B：培养的NSCs分化为星形胶质细胞(GFAP+/DAPI)，神经元(MAP-2+/DAPI)和少突胶质细胞(NG2+/DAPI)
C：荧光显微镜下观察GFP和APP转染NSCs情况D：APP-NSCs过表达APP基因。
图8化合物A和化合物B对APP基因高表达的NSCs具有保护作用实验图，其中
A：CCK-8法检测细胞存活率
B：Tunel法检测APP-NSCs细胞凋亡统计图
C：LDH释放量统计图
D：MDA含量统计图
E：SOD含量统计图
F：Tunel法检测APP-NSCs细胞凋亡，其中标尺＝50μm，##P＜0.01vs GFP组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs APP组，&P＜0.05vs Rg1组。
图9化合物A和化合物B提高BDNF水平，抑制炎症因子释放实验图，其中
A：BDNF释放量统计图
B：TNF-α释放量统计图
C：IFN-γ释放量统计图##P＜0.01vs GFP组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs APP组
图10化合物A和化合物B提高APP-NSCs的增殖能力实验图，其中
A：神经球光镜图
B：Ki67法检测APP-NSCs细胞增殖
C：神经球数量统计图
D：神经球直径统计图
E：Ki67统计图其中标尺＝50μm,##P＜0.01vs GFP组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs APP组。
图11化合物A和化合物B促进APP-NSCs向神经元分化实验图，其中
A：免疫荧光检测APP-NSCs向星形胶质细胞(GFAP+/DAPI)、神经元(MAP-2+/DAPI)和少突胶质细胞(NG2+/DAPI)的分化
B：分化比率统计图##P＜0.01vs GFP组,＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs APP组。
图12XAV-939削弱化合物A和化合物B促进APP-NSCs增殖的作用实验图，其中
A：神经球光镜图
B：Ki67法检测APP-NSCs细胞增殖
C：神经球数量统计图
D：神经球直径统计图
E：Ki67统计图其中标尺＝50μm,##P＜0.01vs GFP组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs APP组，&P＜0.05vs XAV-939组。
图13化合物A和化合物B对Wnt/β-catenin信号通路关键基因表达的影响实验图，其中
A：Wnt-3a mRNA表达量
B：β-catenin mRNA表达量
C：Ccnd1 mRNA表达量
D：Cdkn2a mRNA表达量##P＜0.01vs GFP组,＊P＜0.05vs APP组。
图14XAV-939削弱化合物A和化合物B促进APP-NSCs向神经元分化的作用实验图，其中
A-C：免疫荧光检测Wnt-3a、β-catenin、NeuN蛋白的表达
D：Wnt-3a荧光强度统计图
E：β-catenin荧光强度统计图
F：NeuN阳性细胞数量统计图
G：NeuroD1 mRNA表达量
H：Prox1 mRNA表达量其中标尺＝50μm,##P＜0.01vs GFP组，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs APP组，&P＜0.05vs XAV-939组。
图15Wnt信号通路示意图。
具体实施方式
实施例1：阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的神经退行性疾病，临床表现为记忆力减退和认知功能障碍，现已在世界范围内成为威胁公共健康的重要因素。
越来越多的研究表明，神经退行性疾病的发生发展与神经细胞的氧化应激损伤密切相关。过度产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)将在神经细胞中蓄积，并造成细胞的氧化应激损伤，进而引起多种凋亡因子的释放，诱导细胞凋亡。
本实施例提供由粗糙凤尾蕨分离粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，旨在所述分离得到的化合物能够抑制神经细胞氧化应激损伤，在本实施例中制备所得有效的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物包括两种。
第一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物(简称化合物A)，其结构如通式A所示：
化合物A为无色粉末。根据HR-ESIMS在m/z 249.1117处显示出准分子离子峰[M+H]+，其计算值为249.1127,结合1H-NMR和13C-NMR数据确定其分子式为C14H16O4，不饱和度Ω＝7。由氢碳谱数据可知，该化合物分子中存在两个酮羰基(δC 203.78；202.74)，一个五取代苯环(δH 7.66,δC123.47,148.37,148.04,139.55,136.30,139.44)，一个连氧季碳(δC75.92)，两个连氧亚甲基(δH 3.71,2H，δC 61.21；δH 3.12,2H,δC 33.78)和三个单峰甲基(δH1.35,2.57,2.77,δC 21.50,21.53,14.75)。综合解析二维核磁谱图，该分子属于蕨类倍半萜类化合物。其中1H-1H COSY图谱中H2-13和H2-14具有相关信号，结合HMBC信号H3-15分别与C-6,C-7和C-8相关；H2-13分别与C-5,C-6和C-7相关；H3-12分别与C-4,C-5和C-6相关；H-4分别与C-9,C-8和C-3相关；和H3-10分别与C-1,C-2和C-3相关，化合物平面结构如通式A所示。C-2属于一个手性碳原子，有2S和2R两种可能。计算结果显示2S的的ECD谱图与实测谱图能够拟合,所以化合物A的绝对构型为2S。本发明将其命名为Pterosinsade A。化合物A结构和1H–1H COSY(-)和HMBC(→)相关信号如图1的A和B所示。化合物A的ECD的计算值和实测值对比图如图2所示。
表1化合物A的氢谱(600MHz)和碳谱(150MHz)数据(methanol-d4)
第二种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物(简称化合物B)，其结构如通式B所示：
化合物B为白色粉末。根据氢碳谱数据可知，该分子属于蕨类倍半萜类化合物。通过解析二维核磁谱图，以及查阅文献，该分子最终被确定为pterosin B。化合物B结构和1H–1H COSY(-)和HMBC(→)相关信号如图3的A和B所示。
表2化合物B的氢谱(600MHz)和碳谱(150MHz)数据(CD3OD)
在一种实施例中，化合物A的制备方法如下：用95％乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材获得提取液，提取液减压回收得到浸膏，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物。以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水，30％，60％，95％乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4。可以理解的是四个部位可以提取几十个化合物，本实施例用中压制备液相色谱(MPLC)对Fr.1部位进行分离获得86个流份(W1-W86)，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱。制备型高效液相色谱(HPLC)对W19进行分离获得化合物A，色谱条件为CH3CN-H2O。由此，在Fr.1部位中可以有效提取化合物A和化合物B。
作为优选实施例：化合物A的制备中，用95％乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材10kg获得提取液，提取液减压回收得到浸膏800g，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物。以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水，30％，60％，95％乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4。用中压制备液相色谱(MPLC)对Fr.1部位进行分离获得86个流份(W1-W86)，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱(5:95,20:80,30:70,40:60,50:50,60:40,70:30,95:5,v/v,30.0mL/min，其中，MeOH-H2O的比例为5％:95％，即5:95)。制备型高效液相色谱(HPLC)对W19进行分离获得化合物A共5.10mg，色谱条件为CH3CN-H2O(30:70,v/v,5.0mL/min，其中，CH3CN-H2O的比例为30％:70％，即30:70)。
在另一种实施例中，化合物B的制备方法如下：用95％乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材获得提取液，提取液减压回收得到浸膏，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物。以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水，30％，60％，95％乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4。用中压制备液相色谱(MPLC)对Fr.1部位进行分离获得86个流份(W1-W86)，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱。制备型高效液相色谱(HPLC)对W35进行分离获得化合物B，色谱条件为MeOH-H2O。
作为优选实施例：化合物B的制备中，用95％乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材10kg获得提取液，提取液减压回收得到浸膏800g，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物。以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水，30％，60％，95％乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4。用中压制备液相色谱(MPLC)对Fr.1部位进行分离获得86个流份(W1-W86)，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱(5:95,20:80,30:70,40:60,50:50,60:40,70:30,95:5,v/v,30.0mL/min，其中，MeOH-H2O的比例为5％:95％，即5:95)。制备型高效液相色谱(HPLC)对W35进行分离获得化合物B共25.66mg，色谱条件为MeOH-H2O(45:55,v/v,5.0mL/min，其中，MeOH-H2O的比例为45％:55％，即45:55)。
实验例1：本实验例对粗糙凤尾蕨提取物具有对AD的神经保护作用证明。
实验1—对粗糙凤尾蕨提取的化合物进行诱导细胞氧化应激损伤实验：H2O2是实验室诱导细胞氧化应激损伤的常用试剂，并被证实能有效诱导神经细胞的凋亡。本发明实施例实验利用H2O2建立氧化应激损伤模型，评价粗糙凤尾蕨化学成分及其衍生物的抗氧化能力。结果显示，粗糙凤尾蕨厥素倍半萜及其衍生物均能不同程度的提升H2O2-N2a细胞的存活率，在考虑多种因素后，选择结构式如通式A所示的化合物A与结构式如通式B所示的化合物B进行后续实验。
实验2—化合物A和化合物B最佳浓度筛选实验：结果如图4的A所示，Con组细胞胞体饱满，生长状态良好，Mod组细胞胞体明显皱缩，存在凋亡情况；而经过Rg1、化合物A和化合物B预保护24h后，细胞形态均明显改善，凋亡细胞数减少。图4的B和C分别是化合物A和化合物B预保护24h后H2O2-N2a的存活率统计图，与Mod组相比，各浓度的化合物A和化合物B均可使细胞活力提高，在0.25-1μM范围内随剂量的增加保护作用不断增强，且呈现出明显的量效关系，两药均在1μM时作用最强；超过1μM后保护作用开始减弱。此外，实验还发现，相较于Rg1组，化合物A和化合物B组细胞状态更好，细胞存活率更高，而且化合物A保护效果优于化合物B。以上结果证明，化合物A和化合物B预保护能有效改善H2O2-N2a的细胞形态并促进存活，根据实验结果，本发明实施例选择1μM的化合物化合物A和化合物B用于后续实验。
实验3—化合物A和化合物B对H2O2-N2a具有保护作用的实验：LDH释放量的结果如图5的E所示，Mod组细胞在给予H2O2损伤后，与Con组相比，LDH的释放量明显升高(P<0.01)，而经化合物A和化合物B预保护24h后，与Con组相比，给药组LDH的释放量下降(P<0.01)。
此外，本发明实验例还使用Hoechst33258染色以及免疫荧光化学染色进一步验证两个化合物的抗凋亡作用。Hoechst33258染色结果如图5的A与图5的C所示，细胞损伤后，与Con组相比，Mod组凋亡发生率明显上升(P<0.01)；而经药物预保护后，给药组细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。Caspase3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase3表达的升高意味着细胞逐渐趋于凋亡。由图5的B与图5的D可知，与Con组相比，Mod组Caspase3+阳性细胞率明显上升(P<0.01)，药物预保护后，给药组细胞内Caspase3+阳性细胞率较Mod组相比明显下降(P<0.01)。
MDA是脂质氧化的终产物，反映机体脂质过氧化的程度。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质。因此测定MDA和SOD可有效的反应细胞的氧化应激状态，进而探究化合物A和化合物B是否可以通过抑制氧化应激水平，改善细胞凋亡情况，发挥神经保护作用。结果如图5的F-G所示，Mod组细胞经H2O2损伤后，与Con组相比，MDA含量明显升高(P<0.01)；SOD含量下降(P<0.01)；而经化合物A和化合物B预保护后，给药组较Mod组相比，细胞内MDA的含量下降(P<0.01)，SOD的活性有所上升(P<0.05)。
综上所述，化合物A和化合物B能有效减少H2O2-N2a凋亡，抑制H2O2-N2a的氧化应激损伤，进而发挥神经保护作用，本发明实验例还发现，化合物A和化合物B的保护作用优于Rg1。
实验4—化合物A和化合物B对APP-N2a具有神经保护作用的实验：如图6的A所示，CCK-8结果：Mod组与Con组相比，细胞存活率明显降低(P<0.01)，给药组则明显提高细胞存活率，与Mod相比差异显著(P<0.01)。说明化合物A和化合物B能提高APP转基因细胞N2a的存活率。
如图6的F所示，采用Tunel法检测细胞凋亡情况，凋亡率为红色凋亡细胞/DAPI阳性细胞。结果显示，如图6的C所示，Mod组与Con组相比，凋亡率明显上升(P<0.01)，给药组细胞凋亡率下降，与Mod相比差异显著(P<0.01)。
LDH结果显示，如图6的B所示，Mod组的LDH的释放量几近Con组的4倍，差异具有统计学意义(P<0.01)；与Mod组相比，经过化合物A和化合物B孵育后能显著降低LDH的释放量(P<0.01)，说明化合物A和化合物B可有效减少高表达APP基因的N2a细胞LDH释放量。
以上说明化合物A和化合物B能促进细胞APP-N2a存活，抑制其凋亡。
MDA和SOD的结果显示，如图6的D-E所示：与Con组相比，Mod组细胞的MDA含量显著上升，SOD含量降低，均具有显著性差异(P＜0.01)；而经过化合物A或15预保护后，与Mod组相比，给药组细胞内MDA含量显著下降(P＜0.05或P＜0.01)；SOD水平升高(P＜0.01)；此外，本发明实验例还观察到化合物A和化合物B抗氧化应激能力优于阳性药Rg1。
综上实验1—实验4，化合物A和化合物B能有效促进APP-N2a细胞存活，抑制其凋亡及氧化应激损伤，进而发挥神经保护作用。
由于AD的病因高度复杂，导致其发病机制尚未被阐述的十分清楚，目前以Aβ级联假说最被研究者们所认可。APP基因经转录翻译后生成淀粉样前体蛋白，后者被α和β分泌酶选择性剪切成不同氨基酸长度的蛋白。随后sAPP-β蛋白被γ-分泌酶剪切成具有神经毒性的Aβ42，并聚集在神经细胞外周形成老年斑，从而产生级联反应，造成神经元损伤。所以本发明实施例研究采用慢病毒包装法运用APP595/596质粒转染神经细胞，建立AD细胞模型。相较于使用Aβ孵育造模而言，本发明实施例所建立的APP-N2a、APP-NSCs模型的稳定性与重复性更好。造模后的神经细胞能稳定高表达APP基因，并持续形成内源性Aβ，从而高度模拟AD患者脑内环境，是体外研究AD的理想细胞模型。先前的研究表明，蛇床子素能通过上调miR-107和MicroRNA-9的表达降低APP-SH-SY5Ys和APP-Neurons内Aβ的表达，发挥神经保护作用。上述研究共同证明了基因编辑技术在构建AD体外细胞模型中应用的合理性与可行性。本发明实施例实验结果显示，化合物A与化合物B对APP-N2a和APP-NSCs均具有良好的保护作用，能显著改善细胞的凋亡情况，降低氧化应激水平。
本发明实施例研究主要通过建立H2O2-N2a、APP-N2a、APP-NSCs三种体外细胞模型，评估粗糙凤尾蕨厥素类倍半萜化合物A与化合物B对AD神经细胞的保护作用。结果显示，粗糙凤尾蕨厥素类倍半萜化合物A与化合物B能有效降低AD神经细胞的氧化应激水平并改善细胞的凋亡情况。结合上述报道和本发明实施例实验结果，可以表明凤尾蕨属植物及其活性成分具有良好的神经保护作用。
实验5—化合物A和化合物B对APP-NSCs细胞具有保护作用的实验：
5.1在体外成功培养神经干细胞并构建APP-NSCs模型
如图7的A所示，原代培养的细胞呈悬浮球状且折光性强，通过免疫荧光法鉴定，神经球标记物Nestin和Sox2染色均为阳性。将神经球打散后，在分化条件下培养7-10d，通过免疫荧光法，如图7的B所示，鉴定NSCs能够分化为星形胶质细胞，神经元和少突胶质细胞，可鉴定培养的细胞为NSCs。
免疫荧光细胞化学法检测经转染3d后的神经干细胞，图7的C结果显示，转染了APP-GFP共表达基因的神经细胞和转染了GFP基因的神经元都表达较强的绿色荧光(GFP)，但APP(红色)只在转染APP的神经细胞中显著表达,而在GFP组中几乎不表达。经过RT-PCR检测后，条带如图7的D所示，与β-actin相比，GFP组APP mRNA几乎无APP表达，但APP组的APPmRNA表达很高，说明成功建立高表达APP基因的NSCs模型。
5.2检测化合物A和化合物B对APP-NSCs细胞是否具有神经保护作用，为了检测化合物A和化合物B对APP-NSCs细胞是否具有神经保护作用，本发明实验例利用CCK-8法检测了细胞活力，Tunel检测细胞凋亡率，LDH、SOD、MDA试剂盒法检测了细胞损伤情况。
如图8的A所示，CCK-8结果表明，与GFP组相比，APP组的神经元存活率明显降低(P＜0.01)，而给予化合物A和化合物B的神经细胞存活率明显升高(P＜0.05)，说明化合物A和化合物B可以提高APP-NSCs存活率。
Tunel法染色结果显示(图8的B、F所示)，Tunel阳性细胞即凋亡细胞，在GFP组总体细胞中占据的比例明显低于APP组(P＜0.01)；给予化合物A或15孵育24h可降低APP-NSCs凋亡率，与APP组相比具有显著性差异(P＜0.05)，说明化合物A和化合物B可以抑制转染APP所导致的神经干细胞的凋亡。同时，LDH结果(图8的C所示)也表明，与APP组相比，经过化合物A和化合物B孵育能显著降低LDH的释放量(P＜0.01)。
MDA结果如图8的D所示，与GFP组相比，APP组MDA含量明显升高(P＜0.01)；与APP组相比，给药组MDA含量明显下降(P＜0.01)。SOD结果如图8的D所示，与GFP组相比，APP组SOD活力明显下降(P＜0.01)，与APP组相比，给药组SOD活力升高，化合物A5组与APP组具有显著性差异(P＜0.05)。
以上结果证明化合物A和化合物B可提高APP-NSCs细胞存活率，抑制其凋亡，具有抗氧化应激的能力，对APP-NSCs细胞具有神经保护作用。
实验例2：本实验例对粗糙凤尾蕨提取物通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进海马神经再生的作用证明。
本发明实施例首先利用酶联免疫吸附实验评估粗糙凤尾蕨厥素类倍半萜化合物A和化合物B对高表达APP基因NSCs细胞因子分泌的影响。随后分别研究了化合物化合物A和化合物B促进海马神经发生的作用，并利用抑制剂XAV-939进一步探讨化合物化合物A和化合物B促进海马神经发生的作用是否与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。
脑内神经元的受损和缺失在AD发生发展的过程中具有重要作用，因此补充或替代受损神经元，重建神经功能网络是治疗AD或延缓其病程的重要策略。目前，从神经再生角度出发思考治疗AD的思路主要分为两种。即移植外源性NSCs和激活内源性NSCs，相较而言，移植外源性NSCs存在来源不足、免疫排斥、侵入性移植等问题，因此激活内源性NSCs，促进其增殖和向神经元分化是治疗AD的有效策略。
越来越多的证据表明，海马NSCs的增殖、分化及迁移等行为高度依赖其所处的微环境，但随着AD病程的进展，患者脑内的微环境逐渐恶化，从而妨碍了NSCs生物学功能的发挥。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是脑内微环境中最重要的组成部分，能通过酪氨酸激酶B特异性结合促进突出可塑性，发挥神经保护和促进神经发生的作用。研究表明，成年海马神经元能自身分泌BDNF并作用于自身，从而促进树突的发育；且将BDNF与神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子联合使用能提高NSCs体外增殖能力。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)是脑内微环境中常见的两种促炎因子，TNF-α能通过促进小胶质细胞活化和神经元坏死性凋亡诱导小鼠神经功能障碍。有研究表明，桃叶珊瑚苷能通过激活NF-κB信号通路抑制LPS/IFN-γ诱导的BV2小胶质细胞炎症作用并改善AD模型小鼠的学习与记忆能力。相似的是，结果表明，化合物化合物A和化合物B能有效促进BDNF的分泌，并降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达。
Wnt-3a是Wnt家族蛋白之一，而NSCs被证实能通过分泌Wnt-3a引起下游蛋白β-catenin的改变，进而影响下游基因的表达。结果显示，在增殖培养条件下，化合物化合物A和化合物B能提升APP-NSCs的直径与数量，以及Ki67阳性细胞数。此外，还观察到APP-NSCs内Wnt-3a基因表达下调，化合物化合物A和化合物B能挽救这种变化；相似的是，β-catenin基因也呈现出一致的趋势，但值得关注的是，抑制剂XAV-939能抑制化合物化合物A和化合物B上调β-catenin基因表达的作用，提示本发明实验例化合物化合物A和化合物B促进APP-NSCs增殖的作用与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。此外，本发明实验例还进一步检测了受β-catenin调控的靶基因，结果显示，化合物化合物A和化合物B能促进Cyclin D1基因的表达，同样的，抑制剂XAV-939也减弱了这种作用。
最近的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在促进海马NSCs向神经元分化的过程中扮演着重要角色。例如，淫羊藿次苷Ⅱ能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进GSK-3β的磷酸化，进而诱导NSCs向神经元分化。本发明实验例的结果显示，在分化培养条件下，化合物化合物A和化合物B能显著上调Wnt-3a、β-catenin、NeuN蛋白的表达，而抑制剂XAV-939能减弱这种作用。此外，本发明实验还进一步检测了受β-catenin调控的Neuro D1和Prox1基因的表达情况，结果显示，化合物化合物A和化合物B能提高Neuro D1和Prox1的表达，促进NSCs向神经元分化，相似的是，抑制剂XAV-939也能减弱这种作用。上述研究和本发明实验例的结果共同证明了Wnt/β-catenin信号通路在调控海马NSCs向神经元分化方面具有重要作用。
接续实验例1中实验1-5的序号，本实验例提供实验6-11对实验例2中上述实验结论证明。
实验6—化合物A和化合物B提高BDNF水平，抑制炎症因子释放的实验：BDNF是神经营养因子家族的重要成员，维持着神经系统的发育；BDNF表达的增加，可有效减轻神经元损伤。本发明实验例采用ELISA的方法检测BDNF的表达，结果如图9的A所示，与GFP组相比，APP组BDNF的水平无明显变化，而给予化合物A和化合物B孵育24h的给药组BDNF水平，较APP组相比明显提高(P＜0.05)，此结果表明化合物A和化合物B可以促进APP-NSCs释放BDNF，进而提升神经元的生物活性。此外本发明实验例还检测炎症因子IFN-γ和TNF-α的含量。结果如图9的B、C所示，与GFP组相比，APP组TNF-α、IFN-γ含量明显升高(P＜0.01)，给予化合物A和化合物B孵育后，较APP组相比，给药组TNF-α、IFN-γ水平明显下降(P＜0.01)。以上结果显示，化合物A和化合物B抑制了炎症因子的表达，说明化合物A和化合物B具有抑制炎症反应的作用。综上所述，化合物A和化合物B可以促进脑源性神经营养因子的释放，抑制炎症因子的释放，发挥神经保护作用。
实验7—化合物A和化合物B促进APP-NSCs的增殖的实验：为了确定化合物A和化合物B对高表达APP基因的神经干细胞增殖能力的影响，本实验在含有丝分裂诱导剂bFGF的增殖培养条件下，采用神经球形成实验，从神经球的大小、数目两个方面考察化合物A和化合物B对神经干细胞的影响，结果如图10所示。与GFP组相比，APP组神经球数目和直径均明显减少(P＜0.01)，而给予化合物A和化合物B后，与APP-组比较，APP-NSCs+化合物A/15的给药组神经球的数量和直径显著增加(P＜0.01，P＜0.05)，以上结果提示，化合物A和化合物B能够促进NSCs增殖形成更多、更大的神经球。
同时本发明实验例利用免疫荧光技术检测了Ki67阳性细胞率(图10的D所示)，APP组较GFP组相比，Ki67细胞阳性率显著降低(P＜0.01)，化合物A和化合物B作用后Ki67细胞阳性率较APP组相比有所提高，且具有显著性差异(P＜0.05)。
综合以上结果发现化合物A和化合物B可以促进神经干细胞增殖。
实验8—化合物A和化合物B促进APP-NSCs向神经元分化实验：为了探究化合物A和化合物B对APP-NSCs分化能力的影响，本发明实验例检测了在分化培养基中(去除bFGF)，APP-NSCs向星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的比率。如图3的A和B所示，化合物A和化合物B可以抑制APP-NSCs向星形胶质细胞分化，并促进其向神经元分化，但是对少突胶质细胞无明显影响。
实验9—XAV-939削弱化合物A和化合物B促进APP-NSCs增殖的作用的实验：在采用XAV-939阻断Wnt/β-catenin信号通路后，本发明实验例通过观察神经球的直径、数目以及Ki67+阳性细胞率，来探究化合物A和化合物B是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与调控APP-NSC增殖的过程。神经球形成实验结果显示，给予化合物A和化合物B后，与APP组比较，给药组神经球的数量和直径显著增加(P＜0.05)，但XAV-939作用后，APP-NSCs+XAV-939+化合物A5组与APP-NSCs+XAV-939组相比，神经球的直径和数目明显增加(P＜0.05)，化合物A也可以使直径数目增加，但无差异显著性。免疫荧光结果显示，与APP组相比，经化合物A和化合物B治疗后APP-NSCs的Ki67阳性率有所提高，而抑制剂XAV-939却逆转了这种作用(如图12所示)。上述结果说明给予XAV-939后，化合物A和化合物B原本促进APP-NSCs增殖的作用被削弱。提示本发明实验例，化合物A和化合物B促进APP-NSCs增殖的作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。
实验10—化合物A和化合物B上调Wnt/β-catenin信号通路中增殖相关基因的表达的实验：为了进一步明确化合物A和化合物B对Wnt/β-catenin信号通路中增殖相关基因表达的影响，q-PCR法被本发明实验例用来检测Wnt3a、β-catenin、Ccnd1、Cdkn2a基因的变化情况。结果如图13所示，在增殖培养条件下，与GFP组比较，APP组细胞中Wnt-3a，β-catenin的基因水平明显降低，而化合物A和化合物B显著逆转了这种改变。此外，XAV-939削弱了化合物A和化合物B提高β-catenin基因表达的作用，但对Wnt-3a的表达无影响。
Ccnd1是细胞周期调控的重要成分,它可与CDK4/6形成特异性的复合物，促进细胞周期由G1期进入S期，进而发挥促增殖的作用。Cdkn2a则是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，能特异性抑制CDK4/6复合物的组装和激活，从而诱导细胞G1期阻滞和凋亡。q-PCR实验结果显示，在增殖培养条件下，与GFP组相比，APP组Ccnd1表达明显降低，Cdkn2a表达则升高，表明APP过表达抑制了NSCs细胞的增殖；给予化合物A和化合物B孵育后，细胞内Ccnd1基因水平有所提高，但对Cdkn2a水平没有影响，提示化合物A和化合物B促进高表达APP基因的NSCs增殖与上调Ccnd1基因的表达有关。值得关注的是，使用XAV-939孵育后，化合物A和化合物B上调Wnt-3a、β-catenin、Ccnd1基因表达的能力被抑制。
综上所述，化合物A和化合物B发挥促进APP-NSCs增殖的作用与上调Wnt-3a、β-catenin、Ccnd1基因表达有关。
实验11—XAV-939削弱化合物A和化合物B促进APP-NSCs向神经元分化的作用的实验：结果如图14所示，在分化培养条件下，与APP组比较，添加化合物A和化合物B培养后，分化的神经细胞中Wnt-3a和β-catenin蛋白的表达水平明显升高；NeuN阳性细胞数量即成熟神经元数量显著增加。而给予XAV-939处理后，化合物A和化合物B提高β-catenin表达和NeuN阳性细胞数量的作用被抑制，但对Wnt-3a的表达没有影响。研究显示，体外培养的成年NSCs中过表达Neuro D1可增加其神经元分化，并降低其分化成少突胶质细胞和星形胶质细胞的比率。Prox 1则可以促进海马神经发生，抑制NSCs向星形胶质细胞分化。因此，本发明实验例采用q-PCR法检测了给药前后Neuro D1、Prox1基因水平的变化。结果表明，与GFP组相比，APP组细胞Neuro D1、Prox1基因表达水平明显降低，而经化合物A和化合物B处理后，分化的神经细胞中Neuro D1、Prox 1基因的表达具有不同程度的提升。另外，值得关注的是，抑制剂XAV-939削弱了化合物A和化合物B提升分化的神经细胞中Neuro D1、Prox 1基因表达的能力。以上结果说明，化合物A和化合物B在分化培养条件下促进APP-NSCs向神经元分化，此作用与增加Wnt-3a和β-catenin蛋白表达，上调Neuro D1和Prox 1基因水平有关。
海马神经再生是指海马神经干细胞(neural stem cells，NSCs)在哺乳动物大脑中产生功能性神经元的过程。传统观点认为，哺乳动物中枢神经系统中的神经发生仅存在于胚胎期和围产期。但随着神经科学的不断发展，研究者们在成年哺乳动物的侧脑室室管膜下区(Subventricular zone,SVZ)和海马齿状回颗粒下层(Subgranular zone,SGZ)等区域发现NSCs的踪迹，这为AD等神经退行性疾病的治疗提供了一个新的策略。相关研究表明，AD患者脑内的海马神经再生能力会随着疾病进程的发展和患者年龄的增加而下降。尽管有研究显示，在AD发病的早期，患者脑内海马神经再生能力会应激性的增强，但这种代偿性能力的上升也无法逆转疾病的发展。脑内神经元的受损和缺失在AD发生发展的过程中具有重要作用，因此补充或替代受损神经元，重建神经功能网络是治疗AD或延缓其病程的重要策略。目前，从神经再生角度出发思考治疗AD的思路主要分为两种。即移植外源性NSCs和激活内源性NSCs，相较而言，移植外源性NSCs存在来源不足、免疫排斥、侵入性移植等问题，因此激活内源性NSCs，促进其增殖和向神经元分化是治疗AD的有效策略。因此，亟需一种能促进海马NSCs增殖和向神经元分化的方法以产生足够的神经元，来补充或替代AD脑内受损的神经元，实现神经网络的重建。Wnt/β-catenin信号通路在促进海马NSCs向神经元分化的过程中扮演着重要角色。一些中药和天然药物活性成分可以激活Wnt/β-catenin发挥促进神经再生作用。例如，淫羊藿次苷Ⅱ能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进GSK-3β的磷酸化，进而诱导NSCs向神经元分化。
经典的Wnt/β-catenin信号通路是参与海马神经发生关键的调节因子之一，当Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt配体蛋白即可与细胞表面特异性跨膜受体Frizzled、LPR5/6结合，使Dvl磷酸化并传递活化信号，促使激酶复合物降解，进而抑制β-catenin磷酸化并使其在胞浆内富集，随后发生核易位，启动靶基因的转录，从而发挥促进NSCs增殖和分化的作用，如图15所示。
XAV-939是一种Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，可以通过靶向抑制端锚聚合酶活性来稳定激酶复合体，促进β-catenin的磷酸化与降解。Cyclin D1是受β-catenin启动的靶基因之一，研究表明，Cyclin D1基因敲除会导致NSCs阻滞于G0/G1期，使其停止增殖并趋于凋亡。Cdkn2A能特异性抑制CDK4/6复合物的组装和激活，从而诱导细胞G1期阻滞和凋亡；β-catenin则可以抑制Cdkn2A的启动，而经XAV-939处理后，NSCs内β-catenin降解增多，促使Cdkn2A表达增加，进而抑制NSCs的增殖。研究显示，过表达Neuro D1可增加成年海马NSCs的神经元分化，当受到Wnt信号刺激后，Neuro D1基因被β-catenin转录激活，导致NSCs中Neuro D1蛋白表达上升并促进其神经元分化。Prox1在中枢神经系统中发挥着重要作用，能通过抑制NSCs向星形胶质细胞分化参与对海马神经发生的调控，当β-catenin被抑制时，Prox1基因下调，促进NSCs向星形胶质细胞分化。
在上述的研究中，本发明实验例发现粗糙凤尾蕨蕨素倍半萜化合物A和化合物B具有良好的神经保护作用。此外，分子对接结果显示，化合物A和化合物B与Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白GSK-3β结合紧密，能形成较为稳定的空间构象。而相关研究表明，Wnt能刺激成年海马神经发生，促进突触的建立，并增强神经元的可塑性和信号传递；β-catenin能调控神经前体细胞的生长并维持NSCs增殖分化的稳定。因此，本发明实验例推测粗糙凤尾蕨蕨素类倍半萜化合物A和化合物B可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进海马神经再生。
Wnt-3a是Wnt家族蛋白之一，而NSCs被证实能通过分泌Wnt-3a引起下游蛋白β-catenin的改变，进而影响下游基因的表达。本发明实验例还观察到APP-NSCs内Wnt-3a基因表达下调，化合物A和化合物B能挽救这种变化；相似的是，β-catenin基因也呈现出一致的趋势，抑制剂XAV-939能抑制化合物A和化合物B上调β-catenin基因表达的作用，提示化合物A和化合物B促进APP-NSCs增殖的作用与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。此外，本发明实验例还进一步检测了受β-catenin调控的Neuro D1和Prox1基因的表达情况，结果显示，化合物A和化合物B能提高Neuro D1和Prox1的表达，促进NSCs向神经元分化，同样的，抑制剂XAV-939也减弱了这种作用。化合物A和化合物B也可以显著上调Wnt-3a、β-catenin、NeuN蛋白的表达，而抑制剂XAV-939能减弱这种作用。上述研究和本发明实验例的结果共同证明了化合物A和化合物B通过Wnt/β-catenin信号通路调控海马NSCs向神经元分化。
海马NSCs的增殖、分化及迁移等行为高度依赖其所处的微环境，但随着AD病程的进展，患者脑内的微环境逐渐恶化，从而妨碍了NSCs生物学功能的发挥。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是脑内微环境中最重要的组成部分，能通过酪氨酸激酶B特异性结合促进突出可塑性，发挥神经保护和促进神经发生的作用。研究表明，成年海马神经元能自身分泌BDNF并作用于自身，从而促进树突的发育；且将BDNF与神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子联合使用能提高NSCs体外增殖能力。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)是脑内微环境中常见的两种促炎因子，TNF-α能通过促进小胶质细胞活化和神经元坏死性凋亡诱导小鼠神经功能障碍。有研究表明，桃叶珊瑚苷能通过激活NF-κB信号通路抑制LPS/IFN-γ诱导的BV2小胶质细胞炎症作用并改善AD模型小鼠的学习与记忆能力。相似的是，化合物A和化合物B也能有效促进BDNF的分泌，并降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达。
综上所述，化合物A和化合物B能有效促进BDNF的分泌，并降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达，通过Wnt/β-catenin信号通路调控海马NSCs向神经元分化。
实施例2：一种治疗阿尔茨海默病的药物，包含治疗有效量的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物或其药学上可接受的盐或药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括pH调节剂、渗透压调节剂、防腐剂中的任意一种或两种以上。
在本发明的优选实施方案中，所述效量的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物其浓度为0.25-1μM，优选为1μM。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，其特征在于，其结构如通式A所示：
通式A。
2.权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物的制备方法，其特征在于，通式A化合物的制备包括如下步骤：
用95%乙醇提取干燥粗糙凤尾蕨药材获得提取液，提取液减压回收得到浸膏，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取浸膏水溶液，获得相应萃取物；
以不同浓度乙醇为洗脱剂，用聚酰胺脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别获得水及30%，60%，95%乙醇四个部位，分别记作Fr.1-Fr.4；
用中压制备液相色谱对Fr.1部位进行分离获得W1-W86的86个流份，色谱条件为MeOH-H2O梯度洗脱；
制备型高效液相色谱对W19进行分离获得通式A所示粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物，色谱条件为CH3CN-H2O。
3.权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在制备抑制神经细胞氧化应激损伤的药物中的用途。
4.权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在制备促进海马神经元分泌脑源性神经营养因子的药物中的用途。
5.权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在制备降低炎症因子TNF-α和IFN-γ表达的药物中的用途。
6.权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在制备调控海马神经干细胞向神经元分化的药物中的用途。
7.权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
8.一种治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1所述的粗糙凤尾蕨有效部位中单体化合物。
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