CN109503373B - 一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法。包括以下步骤：将花楸果捣碎，加入乙醇溶液超声提取，减压浓缩得花楸果粗取物；采用聚酰胺色谱柱，以乙醇为洗脱液进行梯度洗脱，减压浓缩得不同梯度馏分洗脱物；再使用高速逆流色谱对不同馏分洗脱物进行分离纯化，即分别得纯度高于95％的新绿原酸、绿原酸、槲皮素‑3‑O‑(6″‑α‑L‑鼠李糖基‑4″′‑α‑L‑鼠李糖基)‑β‑D‑葡萄糖苷、3,5‑O‑双咖啡酰基奎宁酸和芦丁。本方法工艺简单，分离速度快，产品纯度高，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的分离提纯技术领域，具体为一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法。
背景技术
百华花楸(Sorbus pohuashanensis Hedl.)为蔷薇科花楸属植物，其果实称为“花楸果”，广泛分布于我国东北和华北等地。果实可以食用，民间常以果实入药，其果味苦甘、性平，具有抗炎、镇咳、平喘、强心、抗氧化、抗癌和抗辐射等药效，是保健品、食品、药品、化妆品等重要的工业原料。现在研究表明花楸中含有丰富的多酚化合物，是其主要的活性物质。其中黄酮的含量占常见浆果之首，且其抗氧化活性(ABTS指标和DPPH指标)也都位居前列。其余的多酚成分，在清除自由基和抗氧化方面有较好的活性，同时对花楸酚类提取物稳定性考察时发现其酚类成分可有效的代替合成抗氧化剂。
百华花楸作为一种珍贵的浆果，在黑龙江省资源丰富，具有巨大的潜在研究价值，但研究和开发力度仍然不够。此外，对百华花楸中酚类和黄酮类成分的分离制备更是鲜有报道。为了更好进行花楸的药效研究，同时解决目前市场上纯品化合物资源缺乏的现状，以便尽早实现花楸果在保健品、食品、药品、化妆品等工业的应用，因此，花楸果活性成分的分离是必要的。
目前，国内外多采用柱色谱法、重结晶、制备液相的方法对化合物进行分离提纯。然而传统的柱色谱法和重结晶等方法，操作繁琐，耗时费力，重现性差，且样品损失量大。制备色谱虽然样品分离纯度较高，但成本高，分离样品量少。高速逆流色谱(High-speedcounter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体，克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有仪器操作简单、应用范围广、分离量大等优点。此外，高速逆流色谱技术由于其分离机理不同于传统的高效液相色谱技术，常作为HPLC的一种强有力的补充技术而广泛应用于天然产物的分离及纯化。但目前国内外还未见有将高速逆流色谱应用于百华花楸果中多酚化合物的分离纯化。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术不足而提供一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，可以从花楸果中同时分离出三种酚类化合物和两种黄酮类化合物。该方法具有工艺简单、操作方便、样品纯度高、生产成本低等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，包括如下步骤：
1)制备提取物：由花楸果制备粗提液，减压浓缩，冷冻干燥，得花楸果粗提物；具体为：
1.1)将花楸果捣碎，按料液比1kg:5L～1kg:10L加入质量浓度为60％～90％的乙醇或甲醇水溶液超声提取，提取温度为35～45℃，提取时间为30～60min，适时搅拌，过滤，得滤液；
进一步的，将花楸果捣碎，按料液比1kg:10L，加入质量浓度为80％的乙醇水溶液超声提取，提取温度为45℃，提取时间为1h。
更进一步的，所述的花楸果来源于百华花楸。
1.2)将所得滤液，45℃下减压浓缩，冷冻干燥，得花楸果粗提物。
2)初步纯化：利用聚酰胺色谱柱对步骤1)得到的花楸果粗提物，以乙醇为洗脱液进行梯度洗脱，得到不同梯度的洗脱物；具体为：
2.1)将步骤1)所得花楸果粗提物溶于水中，以上样浓度15～25mg/mL加入到聚酰胺色谱柱中，静止2～3h，先用蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后依次使用质量浓度为40～50％乙醇和质量浓度为60～70％乙醇以3mL/min的流速进行洗脱，分别收集40～50％乙醇洗脱液和60～70％乙醇洗脱液；
2.2)分别对40～50％乙醇洗脱液和60～70％乙醇洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，由40～50％乙醇洗脱液得A组分样品，由60～70％乙醇洗脱液得B组分样品。
进一步的，将步骤1)所得花楸果粗提物溶于水中，以上样浓度15mg/mL加入到聚酰胺色谱柱中，静止2～3h，先用蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后依次使用质量浓度为50％乙醇和质量浓度为70％乙醇以3mL/min的流速进行洗脱，分别收集50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液；分别对50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，由50％乙醇洗脱液得A组分样品，由70％乙醇洗脱液得B组分样品。
3)分离化合物：利用高速逆流色谱对步骤2)得到的不同梯度的洗脱物进行分离纯化，得到化合物，具体为：
3.1)将乙酸乙酯、正丁醇和水按体积比2～4:0.5～2:4～6配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相；设置高速逆流色谱仪恒温器温度25℃，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，调节主机转速为800～900r/min，泵入流动相，检测波长为280nm，流动相流速为1.5～3mL/min；取A组分样品，按体积比1:0.5～2的固定相和流动相，混合均匀，配成浓度为5～20mg/mL的样品溶液，进样，观察色谱峰，待目标峰出现时收集馏分，减压浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，分别得到新绿原酸、绿原酸、槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷和芦丁。
进一步的，A组分样品所用的分配体系为：乙酸乙酯:正丁醇:水＝3.5:1.5:5(v/v)，乙酸乙酯:正丁醇:水＝3.5:1:5(v/v)或乙酸乙酯:正丁醇:水＝3:1:5(v/v)。
更进一步的，A组分样品所用的分配体系为：乙酸乙酯:正丁醇:水＝3.5:1.5:5(v/v)，主机转速为850r/min，流动相流速为2mL/min。
3.2)将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按体积比0.5～1:2～4:0.5～1:2～4配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相；设置高速逆流色谱仪恒温器温度25℃，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，调节主机转速为800～900r/min，泵入流动相，检测波长为330nm，流动相流速为1.5～3mL/min，取B组分样品溶解于流动相中，配成浓度为5～15mg/mL的样品溶液，进样，观察色谱峰，待目标峰出现时收集馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，得3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸。
进一步的，B组分样品所用的分配体系为：正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3:1:3.5(v/v)，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3.5:1:3.5(v/v)或正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3:1:4(v/v)。
更进一步的，B组分样品所用的分配体系为：正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3:1:3.5(v/v)，主机转速为850r/min，流动相流速为2mL/min。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，具体包括制备提取浓缩、初步纯化、分离花楸果中化合物等步骤。在制备提取物时，选用超声提取效率高，操作简单；在初步纯化过程，通过聚酰胺色谱柱对花楸果粗提物进行初步提纯，为后续高速逆流色谱分离降低难度，节省时间和成本；在花楸果中化合物高速逆流色谱分离过程中，通过选择合理的溶剂体系、上样量和流动相流速，使得分离效果达到相对较佳的状态，可一次性同时分离多个化合物；最后通过高效液相色谱检测，确定化合物所属种类和化合物的纯度；通过质谱和核磁检测，标准品比对，确定化合物的结构。
本发明的方法成功从花楸果中制备得到高纯度的新绿原酸、绿原酸、槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷、3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸和芦丁，且整个实验过程简单快速，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有分离效率高，产品纯度好、适于工业化生产等优点。
附图说明
图1是花楸果粗提物HPLC色谱图。
图2是A组分样品HPLC色谱图。
图3是B组分样品HPLC色谱图。
图4是HSCCC分离A组分样品色谱图。
图5是HSCCC分离B组分样品色谱图。
图6是新绿原酸HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图7是新绿原酸标准品HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图8是绿原酸HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图9是绿原酸标准品HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图10是槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图11是3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图12是芦丁HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
图13是芦丁标准品HPLC和紫外光谱(UV)检测图。
具体实施方式
以下仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。
下面将结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
1.制备提取物
取冷冻的鲜百华花楸的果实“花楸果”0.5kg，捣碎，按料液比1kg:10L加入质量浓度为80％的乙醇，超声提取，提取温度为45℃，超声时间1h，期间适当搅拌，静止过滤，在45℃下旋转蒸干，然后冷冻干燥，得花楸果粗提物87.9g。
2.初步纯化——树脂柱分离
树脂预处理：将聚酰胺用95％乙醇溶液浸泡24h，用蒸馏水洗至无醇味；然后于2％的Na0H溶液中浸泡24h，用蒸馏水洗至中性；最后用2％的柠檬酸浸泡24h，用蒸馏水洗至中性。
吸附洗脱：取预处理好的600mL聚酰胺装于层析柱(4.5cm×50cm)中，得聚酰胺色谱柱。称取花楸果粗提物20.0g溶于水中，以15mg/mL的上样浓度加入到聚酰胺色谱柱中，静止2h后，先用3BV蒸馏水洗脱，除去糖等水溶性杂质，然后依次使用5BV质量浓度为50％乙醇和4BV质量浓度为70％乙醇以3mL/min的流速进行洗脱，分别收集50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，得50％乙醇洗脱物(A组分样品)1.2977g，70％乙醇洗脱物(B组分样品)1.1461g。
3.分离化合物——高速逆流色谱色谱制备条件选择
3.1 HPLC分析
采用Agilent 1260型液相色谱仪，配备AlltimaTM C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)-0.05％三氟乙酸水溶液为流动相梯度洗脱：0-10min，10-30％A；10-20min，30-35％A；20-35min，35-50％A；35-45min，50-70％A；45-50min，70-100％A；5min平衡时间回到初始流动相。柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，检测波长280nm。得花楸果粗提物HPLC色谱图见图1；A组分样品HPLC色谱图见图2；B组分样品HPLC色谱图见图3；
3.2分配体系的筛选
将配置好的两相溶剂体系振摇静止1h，吸取3mL下层液置于5mL EP管中，加入5mg样品(A组分或B组分)溶于下层液中，混合均匀，吸取下层样品溶液进液相色谱记录峰面积A1。然后取上层液和溶解样品的下层液各2mL于5mL EP管中振摇，静止1h，吸取下层液进液相色谱记录峰面积A2。计算分配系数：K＝(A1-A2)/A2。理想情况下K在0.5～2范围内，如果分配系数过小，则出峰时间太快，峰之间的分离度较差；而分配系数过大时，出峰时间太长且峰形变宽，此外分离因子α＝K1/K2≥1.5时，样品分离效果比较好。根据样品的性质筛选满足K和α值的分配体系，A组分样品和B组分样品体系筛选结果见表1和表2。
表1.A组分样品分配体系的筛选结果
注：“-”未检测到结果
表2.B组分样品分配体系的筛选结果
注：“-”未检测到结果
由表1和表2可见，A组分样品所用的分配体系：乙酸乙酯:正丁醇:水＝3.5:1.5:5(v/v)，乙酸乙酯:正丁醇:水＝3.5:1:5(v/v)或乙酸乙酯:正丁醇:水＝3:1:5(v/v)为优选，基于K和α值，乙酸乙酯:正丁醇:水＝3.5:1.5:5(v/v)为本实验优选体系。B组分样品所用的分配体系：正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3:1:3.5(v/v)，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3.5:1:3.5(v/v)或正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3:1:4(v/v)为优选，基于K和α值，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水＝1:3:1:3.5(v/v)为本实验优选体系。
3.3高速逆流色谱分离纯化多酚化合物
3.3.1高速逆流色谱分离纯化A组分样品
将乙酸乙酯/正丁醇/水，按体积比3.5:1.5:5配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相，使用前超声脱气20min备用。设置高速逆流色谱仪恒温器温度，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，调节主机转速，泵入流动相。分别考察了转速、进样量、温度等参数对HSCCC(同田TBE300B)的影响，发现转速越高体系的保留率越高，但太高样品分离效果不好。升高温度有利于分离，但温度太高体系不太稳定。鉴于实际操作中仪器载样量、样品溶解度及以上参数的考虑，设置如下较优参数：称取A组分样品150mg溶解于15mL固定相和流动相(v/v,1:1)中备用，恒温器温度设为25℃，主机转速850r/min，流动相流速2mL/min，检测波长280nm。进样，然后根据色谱流出图分别在145～184min，270～322min，97～107min和223～243min收集馏分，对应的馏分分别为化合物1、化合物2、化合物3和化合物5，见图4。分别用高效液相色谱仪检测馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，得到新绿原酸30.2mg(图4中化合物1)，绿原酸28.5mg(图4中化合物2)，槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷7.5mg(图4中化合物3)，芦丁9.4mg(图4中化合物5)。
3.3.2高速逆流色谱分离纯化B组分样品
将正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，按体积比1:3:1:3.5配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相，使用前超声脱气20min备用。设置高速逆流色谱仪恒温器温度，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，调节主机转速，泵入流动相。分别考察了转速、进样量、温度等参数对HSCCC(同田TBE300B)的影响，发现转速越高体系的保留率越高，但太高样品分离效果不好。升高温度有利于分离，但温度太高体系不太稳定。鉴于实际操作中仪器载样量、样品溶解度及以上参数的考虑，设置如下较优参数：称取B组分样品150mg溶解于20mL流动相中备用，恒温器温度设为25℃，主机转速850r/min，流动相流速2mL/min，检测波长330nm。进样，然后根据色谱流出图在108～139min收集馏分，对应的馏分为化合物4，见图5，用高效液相色谱仪检测馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，得3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸6.3mg(图5中化合物4)。
3.4目标化合物的结构鉴定
按照“3.1HPLC分析”方法对收集的馏分进行检测，A组分样品分离出的4个目标化合物分别是：新绿原酸、绿原酸、槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷、芦丁，经液相检测其纯度超过95％。其液相和紫外谱图见图6，图8，图10，图12。B组分样品分离出1个目标化合物：3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸，经液相检测其纯度超过95％。其液相和紫外谱图见图11。标准品的液相和紫外谱图见图7，图9，图13。
化合物1：ESI-MS,m/z 353.0886[M-H]-,分子式:C16H18O9,1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ(ppm)：9.52(1H,br s,4'-OH),9.13(1H,br s,3'-OH),7.45(1H,d,J＝16Hz,H-7'),7.00(1H,d,J＝1.5Hz,H-2'),6.96(1H,dd,J＝1.5,8.0Hz,H-6'),6.75(1H,d,J＝8Hz,H-5'),6.18(1H,d,J＝16Hz,H-8'),5.17(1H,m,H-5),4.85(1H,m,H-3),3.84(1H,d,J＝4.5Hz,H-4),1.80-1.99(4H,m,H-2,6)。以上数据与文献1(倪付勇,宋亚玲,刘露,赵祎武,洪奎,黄文哲,王振中,萧伟.中低压制备色谱制备新绿原酸对照品的研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2015,17(09):1818-1822)和文献2(刘珊珊.吴茱萸水溶性成分及其品质评价研究[D].首都医科大学,2016)报道的新绿原酸数据一致。在相同的HPLC色谱条件下检测，与新绿原酸对照品的保留时间一致。故确定化合物1为新绿原酸，结构式如(I)。
化合物2：ESI-MS,m/z 353.1738[M-H]-,分子式:C16H18O9,1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ(ppm)：9.59(1H,br s,4'-OH),9.14(1H,br s,3'-OH),7.41(1H,d,J＝16Hz,H-7'),7.02(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),6.97(1H,dd,J＝2.0,8.5Hz,H-6'),6.75(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.14(1H,d,J＝16Hz,H-8'),5.06(1H,d,J＝4.5Hz,H-5),3.91(1H,br s,H-3),3.55(1H,d,J＝4.5Hz,H-4),2.00(2H,m,H-6),1.91(1H,br d,J＝6Hz,H-2α),1.77(1H,br d,J＝7.5Hz,H-2β)。以上数据与文献3(程智,王伦,陈斌,李甫,王明奎.苍耳子的化学成分[J].应用与环境生物学报,2011,17(03):350-352)和文献4(石伯阳,李佳银,周桥,朱丽娜,陆英.紫甘薯中绿原酸及异绿原酸的高速逆流色谱分离[J].食品科学,2013,34(13):87-90)报道的绿原酸数据一致。在相同的HPLC色谱条件下检测，与绿原酸对照品的保留时间一致。故确定化合物2为绿原酸，结构式如(Ⅱ)。
化合物3：ESI-MS,m/z 755.2031[M-H]-，分子式：C33H40O20,1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ(ppm):12.65(1H,s,5-OH),7.52(1H,dd,J＝2.5,8.5Hz H-6'),7.47(1H,d,J＝2.5Hz,H-2'),6.82(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),6.36(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.17(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.51(1H,d,J＝8.0Hz,H-1″),5.11(1H,d,J＝6.0Hz,H-1”'),4.58(1H,d,J＝4.0Hz,H-1””),3.21-4.08(14H,m,H-2″,2”',2””,3″,3”',3””,4″,4”',4””,5″,5”',5””,6″),0.96(3H,d,J＝6.5Hz,H-6”'),0.78(3H,d,J＝6.0Hz,H-6””)；13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)δ(ppm):177.2(C-4),164.0(C-7),161.2(C-5),156.7(C-9),156.3(C-2),148.3(C-4'),144.7(C-3'),132.7(C-3),121.5(C-1'),121.2(C-6'),116.1(C-5'),115.1(C-2'),103.9(C-10),100.8(C-1″),100.5(C-1”'),98.6(C-1””),98.5(C-6),93.5(C-8),78.2(C-4”'),77.1(C-3″),75.7(C-5″),72.3(C-2″),72.2(C-4””),71.8(C-3””),71.8(C-2”'),70.6(C-3”'),70.5(C-2””),70.3(C-4″),68.2(C-5”'),68.2(C-5””),67.1(C-6″),17.7(C-6”'),17.2(C-6””)。以上数据与文献5(Xu H,Zhou T,Wen J,et al.Isolation andPurification of Three Flavonoids from the Hawthorn Leaves by High SpeedCountercurrent Chromatography,Combined with Isocratic Preparative Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography[J].Journal of LiquidChromatography&Related Technologies,2009,32(15):2216-2231)和文献6(Han J T,Bang M H,Chun O K,et al.Flavonol glycosides from the aerial parts ofAceriphyllum rossii,and their antioxidant activities[J].Archives of PharmacalResearch,2004,27(4):390-395)报道的槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷数据一致。故确定化合物3为槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4”'-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷，结构式如(Ⅲ)。
化合物4：ESI-MS,m/z 515.1207[M-H]-，分子式：C25H24O12,1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ(ppm):9.59(2H,br s,4'-OH and 4″-OH),9.20(2H,br s,3'-OH and 3″-OH),7.49(1H,d,J＝15.6Hz,H-7″),7.45(1H,d,J＝15.6Hz,H-7'),7.06(1H,br s,H-2'),7.04(1H,br s,H-2″),7.00(1H,d,J＝8.4Hz,H-6'),6.99(1H,d,J＝8.4Hz,H-6″),6.77(2H,d,J＝8.4Hz,H-5'and H-5″),6.23(1H,d,J＝15.6Hz,H-8'),6.20(1H,d,J＝15.6Hz,H-8″),5.27(1H,m,H-5),5.18(1H,m,H-3),3.81(1H,s,H-4),2.14(1H,br d,J＝10.2Hz,H-6α),2.07(1H,m,H-6β),1.92-1.94(2H,m,H-2)；13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)δ(ppm):175.7(C-7),166.2(C-9″),165.7(C-9'),148.4(C-4″),148.3(C-4'),145.6(C-3',C-3″),145.1(C-7″),144.7(C-7'),125.9(C-1″),125.6(C-1'),121.4(C-6″),121.2(C-6'),115.8(C-5″),115.7(C-5'),114.8(C-8″),114.7(C-8'),114.2(C-2',C-2″),72.7(C-1),71.0(C-5and C-4),67.8(C-3),35.1(C-2),35.0(C-6)。以上数据与文献7(Beninger C W.A flavanone andtwo phenolic acids from Chrysanthemum morifolium with phytotoxic and insectgrowth regulating activity[J].Journal of Chemical Ecology,2004,30(3):589-606)和文献8(Shi S,Zhao Y,Zhou H,et al.Identification of antioxidants fromTaraxacum mongolicum by high-performance liquid chromatography-diode arraydetection-radical-scavenging detection-electrospray ionization massspectrometry and nuclear magnetic resonance experiments[J].Journal ofChromatography A,2008,1209(1):145-152)报道的3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸数据一致。故确定化合物4为3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸，结构式如(Ⅳ)。
化合物5：ESI-MS,m/z 609.1451[M-H]-,分子式:C27H30O16,1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ(ppm):12.58(1H,5-OH),7.54(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),7.53(1H,dd,J＝2.0,9.0Hz,H-6'),6.82(1H,d,J＝9.0Hz,H-5'),6.36(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.17(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.33(1H,d,J＝7.5Hz,H-1″),4.37(1H,d,J＝1.0Hz,H-1”'),3.02-3.70(10H,m,H-2″,2”',3″,3”',4″,4”',5″,5”',6″),0.98(3H,d,J＝7.5Hz,H-6”')。以上数据与文献9(王先.芳樟叶黄酮和多糖的提取分离、结构鉴定及抗氧化活性研究[D].厦门大学,2008)报道的芦丁数据一致。在相同的HPLC色谱条件下检测，与芦丁对照品的保留时间一致。故确定化合物5为芦丁，结构式如(Ⅴ)。
Claims (4)
1.一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备提取物：由花楸果制备粗提液，减压浓缩，冷冻干燥，得花楸果粗提物；具体包括如下步骤：
1.1）将花楸果捣碎，按料液比1 kg : 5 L～1 kg : 10 L，加入质量浓度为60%～90%的乙醇或甲醇水溶液超声提取，提取温度为35～45℃，提取时间为30～60 min，适时搅拌，过滤，得滤液；
1.2）将所得滤液，45℃下减压浓缩，冷冻干燥，得花楸果粗提物；
2）初步纯化：利用聚酰胺色谱柱对步骤1）得到的花楸果粗提物，以乙醇为洗脱液进行梯度洗脱，得到不同梯度的洗脱物；具体包括如下步骤：
2.1）将步骤1）所得花楸果粗提物溶于水中，以上样浓度15～25 mg/mL加入到聚酰胺色谱柱中，静止2～3 h，先用蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后依次使用质量浓度为40～50％乙醇和质量浓度为60～70％乙醇以3 mL/min的流速进行洗脱，分别收集40～50％乙醇洗脱液和60～70％乙醇洗脱液；
2.2）分别对40～50％乙醇洗脱液和60～70％乙醇洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，由40～50％乙醇洗脱液得A组分样品，由60～70％乙醇洗脱液得B组分样品；
3）分离化合物：利用高速逆流色谱对步骤2）得到的不同梯度的洗脱物进行分离纯化，得到多酚化合物，具体包括如下步骤：
3.1）将乙酸乙酯、正丁醇和水，按体积比2～4 : 0.5～2 : 4～6配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相；设置高速逆流色谱仪恒温器温度25℃，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱后，调节主机转速为800～900 r/min，泵入流动相，检测波长为280 nm，流动相流速为1.5～3 mL/min；取A组分样品，按体积比1:0.5～2的固定相和流动相，混合均匀，配成浓度为5～20 mg/mL的样品溶液，进样，观察色谱峰，待目标峰出现时收集馏分，减压浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥得新绿原酸、绿原酸、槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4'''-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷和芦丁；
3.2）将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水，按体积比0.5～1 : 2～4 : 0.5～1 : 2～4配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相；设置高速逆流色谱仪恒温器温度25℃，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱后，调节主机转速为800～900 r/min，泵入流动相，检测波长为330 nm，流动相流速为1.5～3 mL/min；取B组分样品溶解于流动相中，配成浓度为5～15 mg/mL的样品溶液，进样，观察色谱峰，待目标峰出现时收集馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥得3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸。
2.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，其特征在于，步骤3.1）中，按体积比：乙酸乙酯:正丁醇:水=3.5:1.5:5，乙酸乙酯:正丁醇:水=3.5:1:5或乙酸乙酯:正丁醇:水=3:1:5。
3.根据权利要求1所述的一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，其特征在于，步骤3.2）中，按体积比：正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1:3:1:3.5，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1:3.5:1:3.5或正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1:3:1:4。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种快速分离纯化花楸果中多酚化合物的方法，其特征在于，所述的花楸果来源于百华花楸。
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