CN109651463B - 一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，包括如下步骤：由红树莓果制备粗提液，减压浓缩，冷冻干燥，得红树莓果粗提物；利用大孔吸附树脂色谱柱对上述得到的红树莓果粗提物进行洗脱处理，得洗脱物；利用高速逆流色谱对上述得到的洗脱物进行分离纯化，得到纯度超过98％的矢车菊素‑3‑O‑β‑D‑槐糖苷、矢车菊素‑3‑O‑(2″‑O‑β‑D‑葡萄糖苷‑6″‑O‑α‑L‑鼠李糖苷)‑β‑D‑葡萄糖苷和矢车菊素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷，本方法具有分离效率高，产品纯度好、综合成本低等优点。

Description

一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法
技术领域
本发明涉及化合物的分离提纯技术领域，具体为一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法。
背景技术
红树莓(Rubus ideaus Li)为蔷薇科旋钩子属植物，在果树分类上属浆果类树莓，属多年生小灌木落叶果树，俗称托盘、覆盆子。其多产于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、新疆。生于海拔500-2000米的山地杂木林边、灌丛或荒野。日本、苏联(西伯利亚、中亚)、北美、欧洲也有分布。果实除鲜食外，尚可深加工成饮品，果汁、果酒、果酱、果脯、果冻等，其药理作用具止咳、化痰、润肺、活血、益肝、利肾等功效。其有效成分矢车菊素是一种花色苷，具有抗氧化、防治癌症、保护心血管、降血糖、降血脂、保护大脑和神经、抗衰老等多种生物活性，在医药领域具有很好的应用前景。虽然现有技术中已经发现了红树莓果中存在多种具有药理活性的酚酸类和黄酮类成分，但尚未发现同时对红树莓果中矢车菊素的有效分离方法。
目前，国内外多采用柱色谱法、重结晶、制备液相的方法对化合物进行分离提纯。然而传统的柱色谱法和重结晶等方法，操作繁琐，耗时费力，重现性差，且样品损失量大。制备色谱虽然样品分离纯度较高，但成本高，分离样品量少。高速逆流色谱(High-speedcounter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体，克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有仪器操作简单、应用范围广、分离量大等优点。此外，高速逆流色谱技术由于其分离机理不同于传统的高效液相色谱技术，常作为HPLC的一种强有力的补充技术而广泛应用于天然产物的分离及纯化。但目前国内外还未见有将高速逆流色谱应用于红树莓果中天然色素的分离纯化。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术不足而提供一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，可以从红树莓果中同时分离出三种矢车菊素化合物。该方法具有工艺简单、操作方便、样品纯度高、生产成本低等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，包括如下步骤：
1)制备提取物：由红树莓果制备粗提液，减压浓缩，冷冻干燥，得红树莓果粗提物；
2)初步纯化：利用大孔吸附树脂色谱柱对步骤1)得到的红树莓果粗提物以乙醇为洗脱液进行洗脱处理，得洗脱物；
3)分离化合物：利用高速逆流色谱对步骤2)得到的洗脱物进行分离纯化，得到化合物。
优选的，上述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，步骤1)制备提取物，具体包括如下步骤：
1.1)将红树莓果捣碎，按料液比1g:5mL～1g:10mL，加入质量浓度为60％～90％的乙醇或甲醇水溶液超声提取，提取温度为25～35℃，提取时间为30～60min，所得提取液过滤，得滤液；
1.2)将所得滤液，35℃下减压浓缩，冷冻干燥，得红树莓果粗提物。
优选的，上述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，所述的60％～90％的乙醇或甲醇水溶液的PH为2.0-3.0。
优选的，上述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，步骤2)初步纯化，具体包括如下步骤：
2.1)将步骤1)所得的红树莓果提取粉末溶于水中，以上样浓度15～25mg/mL加入到大孔吸附树脂色谱柱中，静止1～3h，先用3BV0.01％TFA水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后使用4～6BV质量浓度为70～80％乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱，收集70～80％乙醇洗脱液；
2.2)对70～80％乙醇洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到纯化后的红树莓果提取物。
优选的，上述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，步骤3)分离化合物，具体步骤如下：
将正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈、水、三氟乙酸、按体积比12～2:2～0.5:1～0.5:4～6:0.003～0.001配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相；设置高速逆流色谱仪恒温器温度25℃，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱后，调节主机转速为800～900r/min，泵入流动相，检测波长为280nm，流动相流速为1.5～3mL/min；分别取步骤2)所得化合物，按体积比1:1～2的固定相和流动相混合均匀，配成浓度为10-20mg/mL的样品，进样，观察色谱峰，待目标峰出现时收集馏分，减压浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥即得矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷、矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷。
优选的，上述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，步骤3)中，按体积比，正丁醇:甲基叔丁基醚:乙腈:水:三氟乙酸＝5:1:1:4:0.001或正丁醇:甲基叔丁基醚:乙腈:水:三氟乙酸＝6:1:1:4:0.001。
本发明的有益效果是：
本申请提供一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，具体包括制备提取浓缩、初步纯化、分离红树莓果中矢车菊素化合物等步骤。在制备提取物时，选用超声提取效率高，操作简单；在初步纯化过程，通过AB-8大孔树脂对红树莓果粗提物进行初步提纯；在红树莓果矢车菊素高速逆流色谱分离过程中，通过选择合理的溶剂体系、上样量和流动相流速，使得分离效果达到相对较佳的状态，可一次性同时分离多个化合物；最后通过高效液相色谱检测，确定化合物所属种类和化合物的纯度；通过质谱和核磁检测，确定化合物的结构。
本发明方法成功从红树莓果中制备得到高纯度的矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷、矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷，且整个实验过程简单快速，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有分离效率高，产品纯度好、适于工业化生产等优点。
附图说明
图1纯化后红树莓果提取物HPLC色谱图
图2HSCCC分离样品色谱图
图3矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷HPLC和紫外光谱(UV)检测图
图4矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷HPLC和紫外光谱(UV)检测图
图5矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷HPLC和紫外光谱(UV)检测图
具体实施方式
以下仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。
下面将结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
1.制备提取物
取冷冻红树莓鲜果0.5kg捣碎，按料液比1g:10mL加入质量浓度为80％、pH为2.0的乙醇，超声提取，提取温度为35℃，超声时间50min，期间适当搅拌，静止过滤，滤液在35℃下旋转蒸干，然后冷冻干燥，即得红树莓果粗提物50.6g。
2.初步纯化——树脂柱分离
树脂预处理：将大孔吸附树脂用无水乙醇溶液浸泡24h，使其充分溶胀，用蒸馏水充分洗净至无醇味；然后于2％的盐酸溶液中浸泡12h，蒸馏水洗至中性；再用2％氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性；最后用95％乙醇浸泡备用，使用前用蒸馏水洗至无醇味。
吸附洗脱：取预处理好的600mL AB-8大孔吸附树脂装于45mm×50cm层析柱中，得大孔吸附树脂色谱柱。取红树莓果粗提物55.2g溶于水中，以20mg/mL的上样浓度加入到AB-8大孔吸附树脂色谱柱中，静止1h，先用3BV0.01％TFA水溶液洗脱，除去糖等水溶性杂质，然后使用6BV质量浓度80％乙醇以2mL/min的流速进行洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得80％乙醇洗脱物2.4432g。
3.分离化合物——高速逆流色谱色谱制备条件选择
3.1HPLC分析
采用Agilent 1260型液相色谱仪，配备AlltimaTM C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)-0.3％三氟乙酸水溶液为流动相梯度洗脱：0-30min，10-30％A；30-45min，30-45％A；45-50min，45-54％A；50-60min，54-100％A；60-67min，100-10％A。柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量8μL，检测波长520nm。纯化后的红树莓果提取物HPLC色谱图见图1。
3.2分配体系的筛选
按表1取两相体系，将配置好的两相溶剂体系10mL振摇静止1h，吸取4mL下层液置于5mL EP管中，加入5mg样品溶于下层液中，混合均匀得混有样品的下层液，吸取混有样品的下层液进液相色谱记录峰面积A1，然后取上层液和混有样品的下层液各2mL于5mL EP管中振摇，静止1h，再吸取下层液进液相记录峰面积A2。计算分配系数：K＝(A1-A2)/A2，组分的K值在0.5～2范围内比较理想。如果分配系数过小，则出峰时间太快，峰之间的分离度较差，且易与其他化合物或杂质共流出；而分配系数过大时，出峰时间太长且峰形变宽，影响分离度和分离效率。此外分离因子α＝K1/K2≥1.5(K1＞K2)时，样品分离效果比较好。根据样品的性质筛选满足K和α值的分配体系，样品体系筛选结果见表1。
表1.样品分配体系的筛选结果
Figure BDA0001957471050000051
注：“-”未检测到结果
由表1可见，分离化合物所用的分配体系：正丁醇/甲基叔丁基醚/乙腈/水/TFA＝5:1:1:4:0.001(v/v)或正丁醇/甲基叔丁基醚/乙腈/水/TFA＝6:1:1:4:0.001(v/v)为优选，基于K和α值，正丁醇/甲基叔丁基醚/乙腈/水/TFA＝5:1:1:4:0.001(v/v)为本实验最优体系。
3.3高速逆流色谱分离纯化化合物
将正丁醇/甲基叔丁基醚/乙腈/水/TFA按体积比5:1:1:4:0.001配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相，使用前超声脱气20min，静置至室温备用。设置高速逆流色谱仪恒温器温度，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱，调节主机转速，泵入流动相。分别考察了转速、进样量、温度等参数对HSCCC(同田TBE300B)的影响。发现转速越高体系的保留率越高，但转速过高样品分离效果不太好。升高温度有利于分离，温度太高体系易挥发不稳定。进样量太大分离效果不好，易造成峰拖尾，过低分离效率低。鉴于实际操作中仪器载样量、样品溶解度及以上参数的考虑，设置如下较优参数：称取样品150mg溶解于15mL上下相备用，高速逆流色谱仪恒温器设为25℃，主机转速850r/min，流动相流速2mL/min，检测波长280nm。进样后根据色谱流出图分别在113～125min，130～140min和185～202min收集组分，对应的馏分分别为化合物1、化合物2、化合物3，见图2，分别用高效液相色谱仪检测馏分，旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，分别得矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷15.8mg，矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷8.0mg和矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷7.7mg。
3.4目标化合物的结构鉴定
按照“3.1HPLC分析”方法对收集的馏分进行检测，样品分离出的3个目标化合物分别是：矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷、矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷，经液相检测其纯度超过98％。其液相和紫外谱图见图3，图4和图5。
化合物1：ESI-MS,m/z 611.1629[M]+，分子式:C27H31O16 +,1H-NMR(CD3OD/CF3COOD＝95:5v/v,500MHz),δ(ppm):8.99(1H,s,H-4),6.66(1H,d,J＝3.0Hz,H-6),6.89(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),8.05(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),6.77(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),8.19(1H,dd,J＝8.8,2.2Hz,H-6'),5.98(1H,d,J＝8.5Hz,H-1″),4.03(1H,m,H-2″),3.83(1H,m,H-3″),3.77(1H,m,H-4″),3.68(1H,m,H-5″),4.26(1H,dd,J＝9.0,4.5Hz,H-6″α),3.93(1H,m,H-6″β),5.45(1H,m,H-1″'),3.56(1H,m,H-2″')3.51(1H,m,H-3″'),3.46(1H,m,H-4″'),3.44(1H,m,H-5″')3.81(1H,m,H-6″'a),3.59(1H,m,H-6″'b)。以上数据与文献1(Tetsuya Arita,Shinya Miyazaki,Susumu Teramoto,Kunijiro Yoshitama.Major anthocyaninbiosynthesis in the brilliant crimson petals from Erythrina crista-galli L[J].Scientia Horticulturae,2014,168:272-280)和文献2(A.S Zarena,K.UdayaSankar.Isolation and identification of pelargonidin 3-glucoside in mangosteenpericarp[J].Food Chemistry,2012,130:665-670)报道的矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷数据一致，故确定化合物1为矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷，结构式如(I)。
Figure BDA0001957471050000061
化合物2：ESI-MS,m/z 757.2183[M]+,分子式:C33H41O20 +,1H-NMR(CD3OD/CF3COOD＝95:5v/v,500MHz)δ(ppm)：8.92(1H,s,H-4),6.19(1H,d,J＝4.0Hz,H-6),6.90(1H,d,J＝1.5Hz,H-8),8.04(1H,d,J＝2.5Hz,H-2'),6.75(1H,d,J＝9.0Hz,H-5'),8.20(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-6'),6.13(1H,d,J＝8.5Hz,H-1″),6.03(1H,d,J＝8.5Hz,H-1″'),5.98(1H,d,J＝8.0,H-1″″),1.15(3H,d,J＝6.5Hz,H-6″″),4.04-3.60(m,糖质子信号)。以上数据与文献3(AndersenOeyvind M,FossenTorgils.Characterizationof anthocyanins by NMR[J].Handbook of Food Analytical Chemistry:Pigments,Colorants,Flavors,Texture,and Bioactive Food Components,2005,17:47-69)报道的矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷数据一致，故确定化合物2为矢车菊素-3-O-(2″-O-β-D-葡萄糖苷-6″-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷，结构式如(Ⅱ)。
Figure BDA0001957471050000071
化合物3：ESI-MS,m/z 449.1087[M]+,分子式:C21H21O11 +,1H-NMR(CD3OD/CF3COOD＝95:5v/v,500MHz)δ(ppm):9.03(1H,s,H-4),6.66(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),6.90(1H,d,J＝1.5Hz,H-8),8.06(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),7.03(1H,d,J＝8.5Hz,H-5'),8.26(1H,dd,J＝8.8,2.3Hz,H-6'),5.29(1H,d,J＝8.0Hz,H-1″),3.68(1H,dd,J＝9.1,8.1Hz,H-2″),3.54(1H,t,J＝9.0Hz,H-3″),3.43(1H,t,J＝9.2Hz,H-4″),3.67-3.66(1H,m,H-5″),3.67-3.66(1H,m,H-6″α),3.71(br d,J＝12.5Hz,H-6″β)。以上数据与文献4(Silke Hillebrand,Michael Schwarz,Peter Winterhalter.Characterization of Anthocyanins andPyranoanthocyanins from Blood Orange[Citrus sinensis(L.)Osbeck]Juice[J].Agricultural and Food Chemistry,2004,52:7331-7338)报道的矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷数据一致,故确定化合物3为矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷，结构式如(Ⅲ)。
Figure BDA0001957471050000081

Claims (3)

1.一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）制备提取物，具体包括如下步骤：
1.1）将红树莓果捣碎，按料液比1g:5mL~1g:10mL，加入质量浓度为60%~90%的乙醇或甲醇水溶液超声提取，提取温度为25~35℃，提取时间为30~60 min，所得提取液过滤，得滤液；
1.2）将所得滤液，35℃下减压浓缩，冷冻干燥，得红树莓果粗提物；
步骤2）初步纯化，具体包括如下步骤：
2.1）将步骤1）所得的红树莓果提取粉末溶于水中，以上样浓度15~25mg/mL加入到大孔吸附树脂色谱柱中，静止1~3h，先用3BV0.01%TFA水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后使用4~6BV质量浓度为70~80%乙醇溶液以2 mL/min的流速进行洗脱，收集70~80%乙醇洗脱液；
2.2）对70~80%乙醇洗脱液进行减压浓缩、冷冻干燥，得到纯化后的红树莓果提取物；
步骤3）分离化合物，具体步骤如下：
将正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈、水、三氟乙酸、按体积比12~2:2~0.5:1~0.5:4~6:0.003~0.001配成混合溶液，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，取上层作为固定相，下层作为流动相；设置高速逆流色谱仪恒温器温度25℃，然后泵入固定相，待固定相充满高速逆流色谱柱后，调节主机转速为800～900 r/min，泵入流动相，检测波长为280 nm，流动相流速为1.5～3 mL/min；分别取步骤2）所得化合物，按体积比1:1~2的固定相和流动相混合均匀，配成浓度为10-20 mg/mL的样品，进样，观察色谱峰，待目标峰出现时收集馏分，减压浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥即得矢车菊素-3-O-β-D-槐糖苷、矢车菊素-3-O-(2''-O-β-D-葡萄糖苷-6''-O-α-L-鼠李糖苷)-β-D-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，其特征在于，所述的60%~90%的乙醇或甲醇水溶液的PH为2.0-3.0。
3.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离红树莓果中矢车菊素的方法，其特征在于，步骤3）中，按体积比，正丁醇:甲基叔丁基醚:乙腈:水:三氟乙酸=5:1:1:4:0.001或正丁醇:甲基叔丁基醚:乙腈:水:三氟乙酸=6:1:1:4:0.001。
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