CN111718318B - 一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，现有研究证明皂角刺中的黄酮类成分具有良好抗肿瘤及抗氧化活性。本发明目的在于针对皂角刺中高价值黄酮单体进行提取分离，基于该目的，本发明提供了一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，首先制备皂角刺的乙醇提取物，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取所述乙醇提取物，再通过逆流色谱分离所述乙酸乙酯萃取物，最后通过色谱分离得到了五种黄酮单体。本发明方法克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。本方法效率高，操作简单，综合成本低，具有很好的推广使用价值。

Description

一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法
技术领域
本发明属于黄酮单体化合物提取技术领域，具体涉及一种基于高速逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
皂角刺(Gleditsiae Spina)又称皂刺、皂角针和天丁等，为豆科(Leguminosae)皂荚属(Gleditsia L.)植物皂荚(Gleditsia sinensis Lam.)的干燥棘刺，为我国传统中药材，具有悠久的临床应用历史和广泛的药用价值。其味辛，性温，归肝、胃经，具有消肿托毒、排脓、杀虫、抗癌等功效，临床常用于治疗痈疽初起和脓成不溃。皂角刺对改善心血管系统、抗肝纤维化、抗菌、抗炎和提高免疫力等方面具有良好的治疗作用，对乳腺癌、肝癌、宫颈癌、直肠癌等多种癌细胞均具有一定的体外细胞毒活性，同时也是中医治疗多种癌症的常用药之一。
皂角刺的化学成分主要为黄酮类化合物，以及含量较低的皂苷类化合物等。其中皂角刺黄酮为主要活性成分，具有较强的抗肿瘤活性，具有较好的临床应用价值和开发前景。目前文献报道，皂角刺中黄酮类活性成分的分离纯化方法为柱色谱，如硅胶柱色谱、反相柱色谱等。该方法不足之处是：分离周期长，回收率低，分离效果不理想，在使用硅胶柱色谱和反相柱色谱分离时因长时间与硅胶、反相C18填料接触而致使该类成分结构发生变化。
高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相的分离方法，是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。它早起源于20世纪50年代的逆流分溶法(CCD)，但由于其设备庞大复杂、易碎，容积体系容易乳化等而被一种新的液-液分配方法-“逆流色谱”代替。20世纪70～80年代，美国国立卫生院的Ito博士研制出了早期的逆流色谱仪器，包括螺旋管行星式离心分离仪(CPC)、螺旋形逆流色谱仪、流通型螺旋管行星式离心分离仪、连续洗脱型离心分离仪等。高速逆流色谱是逆流色谱技术历了近60年发展的结果，不用固体支撑体作固定相，避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅可全部回收样品，而且样品的制备量大大提高，是一种适用于中药和天然产物研究的现代化仪器，具有适用范围广、制备量大、操作简单、高效快速等优点，在生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域得到了广泛的应用。
发明内容
基于上述研究背景，本发明目的在于提供一种操作简单、产品纯度高、样品损失量小的皂角刺中黄酮类成分提取方法。基于该目的，本发明提供了一种高速逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，能够获取高纯度的黄酮单体成分。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，所述分离方法包括以下步骤：向皂角刺中加入醇液回流提取获取皂角刺的醇提取物；依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取所述醇提取物获得石油醚、乙酸乙酯及水萃取部分；将所述乙酸乙酯萃取部分通过逆流色谱进行分离，根据图谱收集洗脱液分离得到黄酮单体。
目前，现有研究表明皂角刺中的总黄酮成分具有良好的抗氧化、抗肿瘤活性，对于多种肿瘤细胞体现抑制活性。但目前针对皂角刺中黄酮的提取分离还只能做到提取活性部位的程度。为了明确皂角刺中各活性成分的作用机制，为临床用药提供质量控制标准，对于皂角刺中的高价值化合物实体进行分离具有重要的意义。本发明目的在于分离得到尽可能多的高价值黄酮单体，基于上述提取分离方法获得的李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol，槲皮素五种成分是皂角刺中含量最高的五种单体成分，分离其单体并研究其抗肿瘤作用和机制具有重要的意义。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1.本发明方法制备的五种皂角刺黄酮单体成分：李属素、异牡荆苷、3,3',5,5',7-pentahydroflavanone、7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol、槲皮素，分离后各洗脱液经HPLC进行纯度检测，可得到纯度90％以上的单体成分。本方法的建立可以为皂角刺总黄酮的质量控制提供标准品，操作简便，稳定性好。
2.本发明方法所得5个化合物为皂角刺总黄酮提取物中含量最高的成分，有利于为皂角刺的抗肿瘤活性等提供相关研究支持。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述高速逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类成分的色谱图。
图2为实施例1中所述皂角刺乙酸乙酯粗提物的高效液相色谱图。
图3为实施例1中所述皂角刺中各黄酮单体成分的高效液相色谱图和结构式。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中针对皂角刺中黄酮成分提取分离技术的研究还较为空白，相关研究结果表明，皂角刺中含有丰富的黄酮成分，具有良好的抗肿瘤及抗氧化应激效果。针对该研究结果，本发明目的在于提供一种高效分离皂角刺中黄酮单体的方法。
本发明第一方面，提供一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，所述提取方法包括以下步骤：向皂角刺中加入醇液回流提取获取皂角刺的醇提取物；依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取所述醇提取物获得石油醚、乙酸乙酯及水萃取部分；将所述乙酸乙酯萃取部分通过逆流色谱进行分离，根据图谱收集洗脱液分离得到黄酮单体。
优选的，所述黄酮单体为李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol及槲皮素。
优选的，所述醇液为乙醇的水溶液，其浓度大于等于90％。
进一步优选的，所述乙醇溶液浓度为92～98％。
由于黄酮类成分极性小，易溶于有机溶剂，采用乙醇作为提取溶剂，有利于尽可能将黄酮类成分提取出来，降低毒性试剂的残留。经本发明研究，采用上述浓度范围的乙醇进行提取，可以有效地提高黄酮单体的溶出概率，同时减少其他杂质成分的溶出概率。
优选的，所述醇提的固液比为1:2～4；进一步优选的，所述固液比为1:3。
优选的，所述醇提的次数为2～4次；进一步优选的，所述提取次数为3次。
在上述优选技术方案的一些实施方式中，所述三次回流提取的时间分别为2h，1h，1h；将三次回流提取液合并后除去溶剂得到所述醇提取物。
优选的，所述逆流色谱的分离溶剂系统为二氯甲烷-甲醇-正丁醇-水，所述二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝3～5:2～4:0.4～0.6:1～3。
进一步优选的，所述溶剂系统为二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2(v/v)。
优选的，所述高速逆流色谱转速为800～900rpm。
优选的，所述高速逆流色谱的流速为1.8～2.2mL/min。
上述优选的技术方案一些实施方式中，所述乙酸乙酯萃取部分通过逆流色谱分离的方式如下：所述溶剂系统为二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2(v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为850rpm，流速2.0mL/min，检测波长280nm。
本领域公知，由于逆流色谱不采用固体填料作为固定相，离心时通过两种不互溶组分的不断混合实现组分的再次分配。该逆流色谱转速条件能够实现固定相保留率达到75.8％，有利于乙酸乙酯萃取部分中的黄酮成分高效溶出。
优选的，所述根据图谱收集洗脱液分离得到黄酮单体的步骤如下：根据紫外检测收集逆流色谱洗脱液，将洗脱液进一步通过色谱分析得到单体成分。
进一步优选的，依据紫外检测器在线监测，收集逆流色谱洗脱液，并将不同洗脱液进行减压干燥，将所得洗脱成分进行液相色谱分析，分离得到李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol，槲皮素。
更进一步的，所述液相色谱流动相为乙腈(A)和0.1％甲酸-水溶液(B)。
更进一步的，所述液相色谱采用梯度洗脱方式。
上述优选技术方案的一些具体实施方式中，所述利用高效液相色谱分析所得流份，液相条件：流动相采用乙腈(A)和0.1％甲酸-水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-5min,5％A-10％A；5-15min,10％A；15-25min,10％A-15％A；25-45min,15％A-16％A；45-55min,16％A-18％A；55-65min,18％A-20％A；65-70min,20％A-25％A；70-80min,25％A；80-85min,25％A-40％A；色谱柱为Waters-C18(250×4.6mm,5μm)(Waters,USA)，紫外检测波长为280nm，柱温为25℃，流速为0.9mL/min，进样量为10μL。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案，以下实施例中所述试剂，除特别限定外，均为市售产品。
实施例1
本实施例中，提供一种基于高速逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，所述方法包括以下步骤：
取皂角刺药材，粉碎至40-60目，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得皂角刺粗提物；将步骤1中粗提物用水打散，分别用石油醚，乙酸乙酯进行萃取，萃取液减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯和水部位，其中乙酸乙酯部位主要为黄酮类成分，液相分析图见图2。
应用高速逆流色谱对所得皂角刺乙酸乙酯部位进行黄酮类化合物的分离纯化：
采用二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2(v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为850rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率75.8％，检测波长280nm。对皂角刺乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得相应高纯度化合物，如图1所示。
具体的操作步骤是：按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取0.25g皂角刺乙酸乙酯部位，溶解于5mL上相和5mL下相中作为待分离样品。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达850rpm时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，直至两相平衡，不停泵，然后使进样阀处于进样状态，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，得李属素(1,3.7mg)，异牡荆苷(2,2.5mg)，
3,3',5,5',7-pentahydroflavanone(3,11.2mg)，
7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol(4,4.1mg)，槲皮素(5,3.8mg)，HPLC分析纯度均为90％以上(图3所示)。
利用高效液相色谱分析所得流份，液相条件：流动相采用乙腈(A)和0.1％甲酸-水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-5min,5％A-10％A；5-15min,10％A；15-25min,10％A-15％A；25-45min,15％A-16％A；45-55min,16％A-18％A；55-65min,18％A-20％A；65-70min,20％A-25％A；70-80min,25％A；80-85min,25％A-40％A；色谱柱为Waters-C18(250×4.6mm,5μm)(Waters,USA)，紫外检测波长为280nm，柱温为25℃，流速为0.9mL/min，进样量为10μL。
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪，Varian600MHz和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行ESI-MS和NMR谱的测定，所得数据如下，结构式见图3：
李属素(1):ESI-MS(正离子模式)m/z:319.3[M+H]+(C16H14O7)；1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:11.91(1H,brs,5-OH),7.09(1H,brd,H-2'),6.90(1H,dd,J＝1.8,8.4Hz,H-6'),6.77(1H,d,J＝8.4Hz,H-5'),5.87(1H,brd,H-6),5.83(1H,brd,H-8),5.01(1H,d,J＝11.4Hz,H-2),4.62(1H,d,J＝11.4Hz,H-3),3.65(3H,s,7-OMe)。13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:197.9(4-CO),166.8(C-7),163.6(C-5),162.8(C-9),147.7(C-4'),147.3(C-3'),128.4(C-1'),121.5(C-6'),115.3(C-2'),112.5(C-5'),100.5(C-10),96.5(C-6),95.5(C-8),83.5(C-2),71.7(C-3),56.0(7-OMe).
异牡荆苷(2):ESI-MS(正离子模式)m/z:433.4[M+H]+(C21H20O10)；1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:13.55(1H,s,5-OH),10.41(1H,brs,7-OH),7.92(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.92(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),6.77(1H,s,H-3),6.51(1H,s,H-8),4.58(1H,d,J＝5.6Hz,H-1″)；13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:181.8(4-CO),163.4(C-7),163.2(C-2),161.1(C-4′),160.5(C-5),156.1(C-9),128.3(C-2′,6′),121.0(C-1′),115.9(C-3′,5′),108.8(C-6),103.3(C-10),102.7(C-3),93.5(C-8),81.4(C-5″),78.8(C-3″),73.0(C-1″),70.5(C-2″),70.1(C-4″),61.4(C-6″)。
3,3',5,5',7-Pentahydroflavanone(3):ESI-MS(正离子模式)m/z:305.4[M+H]+(C15H12O7)；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:11.90(s,7-OH),9.05(2H,s,3',5'-OH),6.88(s,H-4'),6.74(2H,br d,H-2',6'),5.90(s,H-6),5.88(s,H-8),4.97(d,J＝11.0Hz,H-4'),4.50(d,J＝11.0Hz,H-3)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:198.0(4-CO),167.2(C-7),163.6(C-5),162.8(C-9),146.1(C-3'),145.2(C-5'),128.3(C-1'),119.8(C-4'),115.7(C-2'),115.5(C-6'),100.8(C-10),96.4(C-6),95.3(C-8),83.4(C-2),71.9(C-3).
7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol(4):ESI-MS(正离子模式)m/z:333.1[M+H]+(C17H16O7)；1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:7.05(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),6.87(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6'),6.76(1H,d,J＝8.0Hz,H-5'),6.02(1H,d,J＝1.6Hz,H-6),5.87(1H,d,J＝1.6Hz,H-8),4.90(1H,d,J＝11.6Hz,H-2),4.34(1H,d,J＝11.2Hz,H-3),3.76(6H,s,OMe).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:190.1(4-CO),165.1(C-7),164.0(C-9),162.5(C-5),147.7(C-3’),147.3(C-4’),130.0(C-1'),121.3(C-6'),115.3(C-5'),112.5(C-2'),102.0(C-10),96.0(C-8),94.0(C-6),82.9(C-2),72.7(C-3),56.0(5,3'-OMe).
槲皮素(5):ESI-MS(正离子模式)m/z:303.7[M+H]+(C15H10O7)；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.4(s,5-OH),10.6(s,7-OH),9.35(3H,s,3,3',5'-OH),7.67(d,J＝1.7Hz,H-2'),7.54(d,J＝1.7,8.4Hz,H-6'),6.89(d,J＝8.4Hz,H-5'),6.40(d,J＝1.6Hz,H-8),6.18(d,J＝1.6Hz,H-6)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:176.2(4-CO),164.3(C-7),161.1(C-9),156.5(C-5),148.1(C-4'),147.2(C-2),145.4(C-3'),136.1(C-3),122.3(C-1'),120.2(C-6'),116.0(C-5'),115.4(C-2'),103.3(C-10),98.6(C-6),93.7(C-8).
实施例2
本实施例中，提供一种基于逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)皂角刺提取物的制备：取皂角刺药材，粉碎，90％乙醇加热回流提取，固液比为1:4，提取四次，时间分别为2h，1h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得皂角刺粗提物；
(2)将步骤1中粗提物用水打散，分别用石油醚，乙酸乙酯萃取，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯和水部位浓缩物；
(3)单体的分离：溶剂系统为二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2(v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.2g，分离柱转速为800rpm，流速1.8mL/min，检测波长280nm。对皂角刺乙酸乙酯萃取部位进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，根据紫外检测图收集洗脱液，并将不同洗脱液进行减压干燥，将所得洗脱成分进行HPLC分析，最终分离得到李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，
7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol，槲皮素。
实施例3
本实施例中，提供一种基于逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)皂角刺提取物的制备：取皂角刺药材，粉碎，98％乙醇加热回流提取，固液比为1:2，提取两次，时间分别为3h，2h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得皂角刺粗提物；
(2)将步骤1中粗提物用水打散，分别用石油醚，乙酸乙酯萃取，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯和水部位浓缩物；
(3)单体的分离：溶剂系统为二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2(v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为900rpm，流速2.2mL/min，检测波长280nm。对皂角刺乙酸乙酯萃取部位进行HSCCC分离，紫外检测器在线监测，根据紫外检测图收集洗脱液，并将不同洗脱液进行减压干燥，将所得洗脱成分进行HPLC分析，最终分离得到李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，
7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol，槲皮素。
实施例4
本实施例中，提供一种基于逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，与实施例1中所述方法不同之处在于，本实施例中采用正己烷:乙酸乙酯:正丁醇:水＝1:1:8:10(v/v)作为高速逆流色谱分离的溶剂系统。
采用该系统进行高速逆流色谱分离后，由于化合物1-5均分布于上相体系中，故分离过程中化合物1-5以混合物形式洗脱出，未得到单体成分。
实施例5
本实施例中，提供一种基于逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，与实施例1中所述方法不同之处在于，本实施例中所述高效液相洗脱程序如下：流动相采用乙腈(A)和水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-10min,5％A-12％A；10-15min,12％A；15-20min,12％A-15％A；20-40min,15％A-16％A；40-50min,16％A-18％A；50-60min,18％A-20％A；60-65min,20％A-25％A；65-75min,25％A；75-80min,25％A-40％A。
本实施例方法HPLC分析结果化合物1与其他峰重叠一起，化合物2和3形成肩峰连在一起，且由于未加甲酸调节流动相pH值，使得黄酮类化合物峰形变为后拖尾峰。
实施例6
本实施例中，提供一种基于逆流色谱分离纯化皂角刺中黄酮类单体的方法，与实施例1中所述方法不同之处在于，本实施例中皂角刺粗提物提取方法如下：取皂角刺药材，粉碎至40-60目，甲醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得皂角刺黄酮粗提物。
本实施例方法所得皂角刺黄酮经高速逆流色谱分离后仅得到3,3',5,5',7-pentahydroflavanone(纯度90％以上)，其余3个化合物：李属素，异牡荆苷和7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol纯度低于70％且样品量少，由于甲醇极性大，所得皂角刺黄酮粗提物中无槲皮素。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：向皂角刺中加入醇液回流提取获取皂角刺的醇提取物；依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取所述醇提取物获得石油醚、乙酸乙酯及水萃取部分；将所述乙酸乙酯萃取部分通过高速逆流色谱进行分离，根据图谱收集洗脱液分离得到黄酮单体；
所述高速逆流色谱的分离溶剂系统为二氯甲烷-甲醇-正丁醇-水，所述二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2；
所述黄酮单体为李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol及槲皮素；
所述醇液为乙醇的水溶液，其浓度大于等于90％；
所述高速逆流色谱转速为800～900rpm；
或，所述高速逆流色谱的流速为1.8～2.2mL/min；
所述根据图谱收集洗脱液分离得到黄酮单体的步骤如下：根据紫外检测收集高速逆流色谱洗脱液，将洗脱液进一步通过色谱分析得到单体成分；
依据紫外检测器在线监测，收集高速逆流色谱洗脱液，并将不同洗脱液进行减压干燥，将所得洗脱成分进行液相色谱分析，分离得到李属素，异牡荆苷，3,3',5,5',7-pentahydroflavanone，7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavanonol，槲皮素；
所述液相色谱流动相为乙腈(A)和0.1％甲酸-水溶液(B)。
2.如权利要求1所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述乙醇溶液浓度为92～98％。
3.如权利要求1所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述醇提的固液比为1:2～4。
4.如权利要求3所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述固液比为1:3。
5.如权利要求1所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述醇提的次数为2～4次。
6.如权利要求5所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述醇提的次数为3次。
7.如权利要求6所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述三次醇提的时间分别为2h，1h，1h；将三次回流提取液合并后除去溶剂得到所述醇提取物。
8.如权利要求1所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述乙酸乙酯萃取部分通过高速逆流色谱分离的方式如下：溶剂系统为二氯甲烷:甲醇:正丁醇:水＝4:3:0.5:2，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为850rpm，流速2.0mL/min，检测波长280nm。
9.如权利要求1所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述液相色谱采用梯度洗脱方式。
10.如权利要求1所述基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法，其特征在于，所述利用高效液相色谱分析所得流份，液相条件：流动相采用乙腈(A)和0.1％甲酸-水溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-5min,5％A-10％A；5-15min,10％A；15-25min,10％A-15％A；25-45min,15％A-16％A；45-55min,16％A-18％A；55-65min,18％A-20％A；65-70min,20％A-25％A；70-80min,25％A；80-85min,25％A-40％A；色谱柱为Waters-C18，紫外检测波长为280nm，柱温为25℃，流速为0.9mL/min，进样量为10μL。
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