CN109369382B

CN109369382B - 一种银杏酸类成分的制备方法

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Publication number: CN109369382B
Application number: CN201810844527.0A
Authority: CN
Inventors: 王岱杰; 耿岩玲; 于金倩; 李丽丽; 陈龙; 宋祥云
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN109369382A

Abstract

本发明公开一种银杏酸类成分的制备方法，其采用在线收集和循环高速逆流色谱模式进行分离纯化，制得纯度高于95％的银杏酸类单体；最后将未完全分离的两个银杏酸单体进行制备液相色谱分离。高速逆流色谱分离所用到的条件是：溶剂系统为正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝5:4:1:1，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量500mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，检测波长254nm。本发明成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从银杏果皮中分离制备出纯度大于95％的银杏酸类单体化合物方法。

Description

一种银杏酸类成分的制备方法

技术领域

本发明涉及中药有效成分的高效制备方法，具体为一种银杏酸类成分的制备方法。

背景技术

银杏酸类化合物是银杏中叶、白果和果皮中除了黄酮和内酯外的另一类重要的药效成分，是 6-烯基水杨酸的衍生物。现代药理研究表明，银杏酸类成分具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗癌、抗寄生虫等多种药理活性。由于银杏酸成分是一种低极性结构类似物，分离难度高。目前，传统的单体成分的分离方法包括硅胶柱色谱、制备液相色谱、大孔树脂和 CO₂临界萃取法等，杨长龙等，研究发现采用高效液相色谱法制备分离银杏酸，分离到的银杏酸中存在大量的脂肪酸；尹秀莲，银杏外种皮中银杏酸的分离技术研究，大孔树脂 S-8 分离银杏酸的纯度为 85.59%，然后又采用 CO₂临界萃取法分离到的银杏酸的纯度为 77.66%，两方法分离纯度都不高；后来有学者对工艺不足进行改进，张敏敏，通过改进后的乙醇提取法对银杏酸进行提取，然后用膜分离技术对其进行纯化，获得的银杏酸的纯度由 33.9% 提升至 77.8%。可见，以上方法费时费力、污染环境、样品纯度低，而且样品通过反复柱层析对有不可逆性吸附作用，分离得到银杏酸类化合物单体制备效率低、成本较高；所以，仍需继续寻找新的简单高效的方法制备高纯度的银杏酸。

高速逆流色谱（High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC）是近 30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，使用其它液相色谱法进行制备型分离时，其分配效率会显著降低，溶剂消耗量大，HSCCC 保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。目前尚无采用高速逆流色谱用于制备分离银杏酸类单体化合物。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术背景中的不足，本发明公开一种制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从银杏果皮中分离制备出纯度大于95%的银杏酸类单体化合物方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案来实现：

一种银杏酸类成分的制备方法，它包括以下步骤：

（1）将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮采用石油醚提取三次，得到总银杏酸提取物；

银杏酸是低极性化合物，本发明利用低极性的石油醚，根据相似相容的原理，使外种皮提取效率最高，同时对于其它类型的有效成分，如黄酮和银杏内酯类成分不会被提取出来。

（2）将总银杏酸类成分采用在线收集和循环逆流色谱模式进行分离纯化，制得纯度高于 95%的银杏酸类单体。

银杏酸是一类低极性结构类似物，不同的化合物间仅在于脂肪链的长度和双键位置的不同，长脂肪酸链结构决定了银杏酸类化合物极性极小，可适用的逆流色谱溶剂体系较少，因此常规的逆流色谱分离方式很难将这些结构类似物一次分开，而本申请公开的循环逆流色谱模式体系可以完全分离纯化杏酸。

（3）将未完全分离的银杏酸单体进行制备液相色谱分离。

优选地，所述步骤（2）的操作步骤为：

2.1 将逆流色谱两相溶剂体系平衡好后进样，将组分I和II分离并分步收集；

2.2 切换六通阀2，将组分III引入收集管；

2.3 切换六通阀1和2，进行组分IV的循环逆流色谱；

2.4 切换六通阀2，将组分III引入逆流色谱进行循环分离。

进一步，优选地，所述步骤2.1中两相溶剂体系为：将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/ 甲醇/乙酸按体积比为2:1:0.5~1.5:1的比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，分为上下两相分开。

进一步，优选地，所述步骤2.1中进样为：取步骤（1）所的500mg总银杏酸提取物，溶解于上述5 mL上相和5 mL下相中。

进一步，优选地，所述步骤2.1中进样的具体过程为：采用半制备型高速逆流色谱仪的进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收组分I和II。

进一步，优选地，上述高速逆流色谱仪柱体积为300 mL，上样量500 mg，转速800转

/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0 mL/min，检测波长254 nm。

进一步，优选地，所述步骤2.2中当分离进行到组分III的前沿，切换六通阀2，将组分

III引入收集管；

进一步，优选地，所述步骤2.3中组分IV经过第6次分离，得到化合物7和8。

进一步，优选地，所述步骤2.4中经过第10次分离，得到峰4、峰5和峰6的混合物。进一步，优选地，上述峰5和6经过制备液相色谱二次分离，得到二者的高纯度单体。进一步，优选地，所述高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters Symmetry C18

column (5 μm, 4.6 mm× 250 mm, i.d.,)，紫外检测波长254 nm，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL，流动相采用甲醇/0.5%乙酸溶液（92:8，v/v）。

本发明的有益效果：

1、本发明公开的制备方法成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从银杏果皮中分离制备出纯度大于95%的银杏酸类单体化合物。

附图说明

图1 本发明的工艺流程图；

图2 逆流分离模式示意图；

图3 银杏酸类成分的一次逆流色谱分离图；

图4 组分IV的循环逆流色谱图；

图5 组分III的循环逆流色谱图；

图6 银杏酸类粗提物与逆流色谱各部分的高效液相色谱图；

图7 对比例1的逆流色谱图；

图8对比例2的逆流色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 样品提取

将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮 5kg，用10L 石油醚（沸程 60-90℃）回流提取 3 次，每次 2 h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液，在 55℃下旋转蒸发至干，得到总银杏酸类成分提取物 247g，将其储存在 4℃的冰箱中进行进一步的 HSCCC 纯化。

实施例2 应用在线收集和循环逆流色谱模式分离纯化银杏外种皮中银杏酸类单体

本发明使用在线收集和循环逆流色谱的分离方法，从银杏果皮总银杏酸提取物中成功分离出 6 种银杏酸类单体化合物，结构图如图 2 所示，通过增加两个六通阀和一个收集管，实现在线收集和循环逆流色谱模式的切换，具体分为 4 个操作步骤：1）将逆流色谱两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸（2:1:0.5:1，v/v）平衡好后进样，先将图 3中组分 I 和 II 分离并分步收集；2）切换六通阀 2，将图 3 中组分 III 引入收集管；3）切换六通阀 1 和 2，进行组分 IV 的循环逆流色谱；4）切换六通阀 2，将组分 III 引入逆流色谱进行循环分离。高速逆流色谱仪柱体积为 300 mL，上样量 500 mg，转速 800 转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速 2.0 mL/min，检测波长 254 nm。

具体的操作步骤是：先按上述步骤 1，将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸（5:4:1:1，v/v）按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取 500mg 粗品，溶解于 5 mL 上相和 5 mL 下相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱

（由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为 300 mL）等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达 800 转/min 时，设置流动相流速为 2.0 mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收图 2中组分 I 和 II。当分离进行到组分 III 的前沿，切换到步骤 2，将组分 III 收集到收集管，当收集完毕后，切换至步骤 3，见图 4，组分 IV 经过第 6 次分离，成功分离得到化合物 7 和 8。切换至步骤 4，对组分 III 进行循环逆流色谱分离，经过第 10 次分离得到峰4 以及峰 5 和 6 的混合物。峰 5 和 6 经过制备液相色谱二次分离，得到二者的高纯度单体。最终分离得到峰 1（19.7 mg），峰 4（17.2 mg），峰 5（53.8mg），峰 6（10.9 mg），峰 7（56.8 mg）和峰8（16.4 mg）六个高纯度单体，液相色谱检测纯度超过 95%，见图 6。

利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters Symmetry C18 column (5 μm,4.6 mm× 250 mm, i.d.,)，紫外检测波长 254 nm，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL，流动相采用甲醇/0.5%乙酸溶液（92:8，v/v）。

结构鉴定：对分离得到的银杏酸类成分单体应用 Agilent 5973N 质谱仪和Varian 600MHz 核磁共振波谱仪分别进行 MS，NMR 谱的测定，所得数据如下：

峰 1: ESI-MS m/z: 317 [M - H]-. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ_H 6.23 (2H,d, J = 2.3 Hz, H-4, 6), 6.17 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-2), 5.35 (2H, m, CH=CH),2.46 (2H, m, H-1’), 2.01 (4H, m,CH₂-CH=CH-CH₂), 1.55 (2H, m, H-2’), 1.29 (16H,m), 0.87 (3H, t, J = 6.7 Hz, CH₃). ¹³C NMR(CDCl₃, 100MHz): δ_C156.8 (C-1, 3),146.0 (C-5), 130.0, 107.9 (C-4, 6), 100.2 (C-3), 35.9 (C-1’),31.8, 31.1 (C-2’, 3’), 29.8, 29.7, 29.4, 29.3, 29.2, 29.0, 27.2 (CH₂), 22.7 (C-14’), 14.1(C-15’)。对照 MS、¹H 和¹³C NMR 数据鉴定为银杏酚（15:1）。

峰 4: ESI-MS m/z: 319 [M - H]-. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ_H 7.34 (1H,dd, J = 8.2, 7.4Hz, H-4), 6.85 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-3), 6.75 (1H, d, J = 7.4Hz, H-5), 2.96 (2H, t, J = 7.8 Hz,H-1’), 1.59 (2H, m, H-2’), 1.25 (20H, m),0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz, CH₃). ¹³C NMR (CDCl₃,100MHz): δ_C 174.7 (COOH), 163.6(C-2), 147.5 (C-6), 134.9 (C-4), 122.5 (C-5), 115.7 (C-3),110.8 (C-1), 36.5(C-1’), 32.1, 31.9 (C-2’, 3’), 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4(CH₂), 22.7 (C-12’),14.1 (C-13’)。对照 MS、¹H 和¹³C NMR 数据鉴定为白果新酸（GA 13:0）。

峰 5: ESI-MS m/z: 347 [M - H]-. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.35 (1H,dd, J = 8.2, 7.4 Hz, H-4), 6.86 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-3), 6.76 (1H, d, J =7.4 Hz, H-5), 2.95 (2H, t, J = 7.6 Hz,H-1’), 1.60 (2H, m, H-2’), 1.26 (24H,m), 0.88 (3H, t, J= 6.8 Hz, CH₃). ¹³C NMR (CDCl₃,100MHz): δ_C 175.7 (COOH),163.5 (C-2), 147.4 (C-6), 134.8 (C-4), 122.6 (C-5), 115.6 (C-3),110.6 (C-1),36.5 (C-1’), 32.0, 31.8 (C-2’, 3’), 29.8, 29.7, 29.7, 29.5, 29.4(CH₂), 22.6(C-14’),14.0 (C-15’)。对照 MS、¹H 和¹³C NMR 数据鉴定为白果酸（GA 15:1）。

峰 6: ESI-MS m/z: 345 [M - H]-. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.34 (1H,dd, J = 8.2, 7.4 Hz, H-4), 6.86 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-3), 6.76 (1H, d, J =7.4 Hz, H-5), 5.35 (2H, m, CH=CH),2.97 (2H, m, H-1’), 2.01 (4H, m, CH₂-CH=CH-CH₂), 1.59 (2H, m, H-2’), 1.29 (16H, m), 0.87 (3H, t, J = 6.8 Hz, CH₃).¹³C NMR(CDCl₃, 100MHz): δ_C 175.8 (COOH), 163.5 (C-2), 147.7 (C-6), 135.2 (C-4),130.3, 129.9 (C=C), 122.7 (C-5), 115.8 (C-3), 110.8 (C-1), 36.4 (C-1’), 32.0,31.8 (C-2’, 3’), 29.8, 29.7, 29.4, 29.3, 29.0, 27.2 (CH₂), 22.7 (C-14’), 14.1(C-15’)。对照 MS、¹H和¹³C NMR 数据鉴定为十七烷二烯银杏酸（GA 17:2）。

峰 7: ESI-MS m/z: 373 [M - H]-. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.33 (1H,dd, J = 8.2, 7.4 Hz, H-4), 6.87 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-3), 6.77 (1H, d, J =7.4 Hz, H-5), 5.34 (2H, m, CH=CH),2.98 (2H, m, H-1’), 2.01 (4H, m, CH₂-CH=CH-CH₂), 1.60 (2H, m, H-2’), 1.30 (20H, m), 0.89 (3H, t, J = 6.7 Hz, CH₃). ¹³CNMR (CDCl₃, 100MHz): δ_C 176.2 (COOH), 163.5 (C-2), 147.8 (C-6), 135.3 (C-4),129.9, 129.8 (C=C), 122.7 (C-5), 115.8 (C-3), 110.9 (C-1), 36.5 (C-1’), 32.0,31.8 (C-2’, 3’), 29.80, 29.76, 29.69, 29.64, 29.59, 29.53, 29.35, 29.01,27.24 (CH₂), 22.7 (C-16’),14.1 (C-17’)。对照 MS、¹H 和¹³C NMR 数据鉴定为氢化白果酸（GA 15:0）。

峰 8: ESI-MS m/z: 371 [M - H]-. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃):δ_H 7.31 (1H,dd, J = 8.2, 7.4 Hz, H-4), 6.85 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-3), 6.75 (1H, d, J =7.4 Hz, H-5), 5.35 (4H, m, CH=CH),2.95 (2H, m, H-1’), 2.77 (2H, m, =CH-CH₂-CH=), 2.03 (4H, m, CH₂-CH=CH-CH₂-CH=CH-CH₂),1.57 (2H, m, H-2’), 1.32 (14H, m),0.88 (3H, t, J = 6.7 Hz, CH₃). ¹³C NMR (CDCl₃, 100MHz): δ_C176.8 (COOH), 163.3(C-2), 147.4 (C-6), 135.0 (C-4), 130.2, 130.1, 128.0, 127.9 (2C=C), 122.6(C-5), 115.7 (C-3), 110.1 (C-1), 36.4 (C-1’), 32.0, 31.5, 29.8, 29.7, 29.4,29.4, 29.3, 27.2, 27.2 (CH₂), 25.6 (=CH-CH₂-CH=), 22.6 (C-16’), 14.1 (C-17’)。对照 MS、¹H 和¹³C NMR 数据鉴定为十七烷一烯银杏酸（GA 17:1）。

实施例 2

与实施例 1 的区别在于，正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝2:1: 1.5:1，其余步骤和实施例 1 一样。

对比例 1：

正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝5:3:1.5:1，高速逆流色谱仪柱体积为300 mL，上样量500 mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0 mL/min，检测波长254nm。与实施例1不同的是溶剂系统的比例发生了改变，溶剂系统组分不变，其他条件与操作都与实施例1中的一样。

对比例 2：

正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝2:1:0.5:1，高速逆流色谱仪柱体积为300 mL，上样量500

mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0 mL/min，检测波长254nm。与实施例1不同的是溶剂系统将乙酸换成了水，溶剂系统的比例都没有改变，其他条件与操作都与实施例1中的一样。

由图 7 和图 8 可以看出，将溶剂系统的比例发生了改变或者溶剂系统的组分发生改变，都会导致各有效成分之间不能分离。发明人通过实验发现只有本发明的实验条件才能将银杏酸类单体很好的分离出来。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种分离银杏酸类成分的制备方法，其特征是：应用高速逆流色谱分离，所述分离用到的条件是：溶剂系统为正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：乙酸＝5:4:1:1，高速逆流色谱仪柱体积为300 mL，上样量500 mg，转速800转/min，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0 mL/min，检测波长254 nm；

所述制备方法包括以下步骤：

（1）将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮采用石油醚提取，得到总银杏酸提取物；

（2）将总银杏酸类成分采用在线收集和循环高速逆流色谱模式进行分离纯化，制得纯度高于95%的银杏酸类单体；

（3）将未完全分离的两个银杏酸单体进行制备液相色谱分离;

步骤（2）中所述在线收集和循环高速逆流色谱的方法为：

(a):将所述的高速逆流色谱的两相溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相；

(b):取总银杏酸提取物溶解于5 mL上相和5 mL下相的混合液中待用；

(c):首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0 mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收组分I和II；当分离进行到组分III的前沿，切换到六通阀2，将组分III收集到收集管；当收集完毕后，切换六通阀1和2，组分IV经过6次分离，成功分离得到峰7和峰8的单体化合物；切换至六通阀2，对组分III进行循环逆流色谱分离，经过10次分离得到峰4的单体化合物以及峰5和6的混合物；

峰4：白果新酸（GA 13:0）；

峰5：白果酸（GA 15:1）；

峰6：十七烷二烯银杏酸（GA 17:2）；

峰7：氢化白果酸（GA 15:0）；

峰8：十七烷一烯银杏酸（GA 17:1）。

2.根据权利要求1所述的分离银杏酸类成分的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述石油醚提取的沸程为60-90℃。

3.根据权利要求1所述的分离银杏酸类成分的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述石油醚提取3次，每次2 h。

4.根据权利要求1所述的分离银杏酸类成分的制备方法，其特征在于，步骤（1）中总银杏酸提取物为500mg。

5.根据权利要求1所述的分离银杏酸类成分的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的峰5和6的混合物经过制备液相色谱二次分离，得到二者的高纯度单体。

6.根据权利要求5所述的分离银杏酸类成分的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的峰5和6的混合物经过制备液相色谱二次分离，分离条件：Waters Symmetry C18column，紫外检测波长254 nm，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。