CN109020804B - 一种银杏酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用高速逆流色谱法分离总银杏酸提取物中银杏酸单体的方法，本技术方案中采用向两相溶剂中加入硝酸银，引入银离子络合的方式，两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸。本发明方法能够实现一次性分离出白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸，五种高纯度的银杏酸单体化合物，制备方法简便高效，成本经济，适用于工业生产，具有重要的经济意义。

Description

一种银杏酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药有效成分的分离纯化方法，具体为应用逆流色谱法分离银杏酸类单体化合物(白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸)的方法。
背景技术
银杏酸类化合物是银杏中叶、白果和果皮中除了黄酮和内酯外的另一类重要的药效成分，是6-烯基水杨酸的衍生物。现代药理研究表明，银杏酸类成分具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗癌、抗寄生虫等多种药理活性。由于银杏酸成分是一种低极性结构类似物，分离难度高。传统的单体成分的分离方法包括硅胶柱色谱、制备液相色谱、大孔树脂等，其局限性是费时费力、污染环境、样品纯度低，而且反复柱层析对样品有不可逆性吸附作用，分离得到银杏酸类化合物单体制备效率低、成本较高。
高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，使用其它液相色谱法进行制备型分离时，其分配效率会显著降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。pH-区带逆流色谱是在逆流色谱基础上发展起来的一种新型制备型分离技术，利用物质解离常数和疏水性的不同进行分离，具有分离量大、分离效果好等优点，广泛的应用于生物碱和有机酸类成分的分离。
虽然现有技术中有利用金属离子络合的逆流色谱分离中药中有效成分的报道，本领域公知，逆流色谱分离中所用到的溶剂系统是影响分离结果的关键因素之一，常用到的溶剂有甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、氯仿、乙腈等，每一溶剂系统中所使用的溶剂至少为两种。中药的提取分离过程，其中所包含的化合物成分复杂、含量也不明确。因此，溶剂体系的探索是一项复杂的工作，现有技术中的提取方式往往不具备借鉴意义。
发明内容
本发明的目的是开发出一种制备成本经济，操作简便，效率高，可以较大批量从银杏果皮中分离制备出五种高纯度的银杏酸类单体化合物方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案进行实现：一种分离银杏酸中单体化合物的方法，包括以下步骤：
(1)将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮采用石油醚提取，得到总银杏酸提取物。
优选的，干燥后的外种皮加入石油醚回流提取3次，每次2-2.5h，过滤提取液，合并提取液，55±5℃下旋蒸除去溶剂，得到总银杏酸粗品。
进一步的，干燥后的银杏果外种皮与石油醚的配比为每1kg外种皮加入2-2.5L石油醚。
(2)将所述总银杏酸类成分通过基于银离子络合作用的逆流色谱法进行分离纯化，制得富含银杏酸类单体化合物溶液，所述逆流色谱的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸。
优选的，将两相溶剂体系置于分液漏斗中，加入硝酸银溶液，摇匀后平衡，待将上下两相分开，取所述总银杏酸粗品，溶解于上相和下相中待用；采用半制备型高速逆流色谱仪，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵送流动相，当达到流体动力学平衡后将上述溶解的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据紫外光谱检测结果接收组分，得到单体组分3，4，5，以及混合组分I。
进一步的，总银杏酸粗品与上相和下相的配比为100mg:1-2mL:1-2mL。
进一步的，两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸的体积比为：5:3.5-4.5:0.5-1.5:0.5-1.5，具体的，体积比为5:4:1:1。
进一步的，上述硝酸银溶液的浓度为0.20mmol/L。
进一步的，上述混合组分I经过制备液相色谱二次分离，得到单体组分1和2。
(3)将上述富含银杏酸单体溶液，加入低极性有机溶剂萃取，减压干燥即得银杏酸单体化合物。
优选的，向上述单体组分1-5的溶液中加入正己烷萃取，将正己烷层转移并减压浓缩干燥，即得银杏酸单体化合物1-5。
优选的，利用高效液相色谱分析上述单体化合物1-5，液相条件：Waters SymmetryC18column(5μm,4.6mm×250mm,i.d.,)，紫外检测波长254nm，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用甲醇/0.5％乙酸溶液(92:8，v/v)。
本发明的有益效果
银杏酸成分是一种低极性结构类似物，分离难度较大，现有技术中没有行之有效的分离方法。本发明提出了一种适用于银杏酸分离的两相溶剂体系，制备方法成本经济，操作简便，效率高，可以较大批量从中药银杏果中，分离制备出纯度大于95％的白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸，五种单体化合物，大大提高了提取分离的效率。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1本发明的工艺流程图；
图2银离子逆流色谱分离图；
其中图2A为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:4:1:1，v/v)体系未加银离子的效果图，图2B为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:4:1:1，v/v)体系加0.20mmol/L银离子的效果图；
图3银杏酸类粗提物与逆流色谱各部分的高效液相色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明。
实施例1：
1.样品提取
将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮5kg，用10L石油醚(沸程60-90℃)回流提取3次，每次2h，然后将提取物使用真空过滤装置过滤。合并所有提取液，在55℃下旋转蒸发至干，得到总银杏酸类成分提取物247g，将其储存在4℃的冰箱中进行进一步的HSCCC纯化。
2.应用在线收集和循环逆流色谱模式分离纯化银杏外种皮中银杏酸类单体
将两相溶剂体系正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:4:1:1，v/v)按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，加入0.20mmol/L的硝酸银溶液，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取500mg粗品，溶解于5mL和5mL下相中待用。采用半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，当达到流体动力学平衡后将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据检测器紫外光谱图接收目标成分，最终分离得到峰3，峰4和峰5三个单体，以及峰1和2的混合物，该混合物经过制备液相色谱二次分离，得到二者的高纯度单体。最终分离得到峰1-峰5五个高纯度单体，液相色谱检测纯度超过95％，见图3。图2A为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:4:1:1，v/v)体系未加银离子的效果图，图2B为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸(5:4:1:1，v/v)体系加0.20mmol/L银离子的效果图，从二者结果比较，加入银离子后，实现了非常好的分离效果。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters Symmetry C18column(5μm,4.6mm×250mm,i.d.,)，紫外检测波长254nm，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用甲醇/0.5％乙酸溶液(92:8，v/v)。
结构鉴定：对分离得到的银杏酸类成分单体与中检所银杏酸混合标样进行高效液相色谱出峰时间比对(图3)。同时采用Agilent 5973N质谱仪获得质谱信息，峰1：319.2[M-H]-1为白果新酸(GA 13:0)；峰2：347.3[M-H]-1为白果酸(GA 15:1)；峰3：345.3[M-H]-1为十七烷二烯银杏酸(GA 17:2)；峰4：373.3[M-H]-1为氢化白果酸(GA 15:0)；峰5：371.3[M-H]-1为十七烷一烯银杏酸(GA 17:1)。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种分离银杏酸中单体化合物的方法，包括以下步骤：
（1）将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮采用石油醚提取，得到总银杏酸提取物；
（2）将所述总银杏酸类成分通过基于银离子络合作用的逆流色谱法进行分离纯化，制得富含银杏酸类单体化合物溶液，所述逆流色谱的两相溶剂体系为正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸；
（3）将上述富含银杏酸单体溶液，加入低极性有机溶剂萃取，减压干燥即得银杏酸单体化合物；
所述步骤（2）的操作为：将两相溶剂体系置于分液漏斗中，加入硝酸银溶液，摇匀后平衡，待将上下两相分开，取所述总银杏酸粗品，溶解于上相和下相中待用；采用半制备型高速逆流色谱仪，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵；开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800转/min时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵送流动相，当达到流体动力学平衡后将上述溶解的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，然后根据紫外光谱检测结果接收组分，得到单体组分3， 4， 5，以及混合组分I；
所述硝酸银溶液的浓度为0.20 mmol/L；
所述逆流色谱的两相溶剂体系中，正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/乙酸体积比为5:4:1:1；
所述单体组分3为十七烷二烯银杏酸；所述单体组分4为氢化白果酸；所述单体组分5为十七烷一烯银杏酸；
混合组分I为单体组分1白果新酸和单体组分2白果酸。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤（1）具体操作为：将银杏果外种皮与白果分离，外种皮置于阴凉处干燥，干燥后的外种皮加入石油醚回流提取3次，每次2-2.5 h，过滤提取液，合并提取液， 55±5℃下旋蒸除去溶剂，得到总银杏酸粗品。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述银杏果外种皮与石油醚的加入比例为每1kg加入2-2.5L石油醚。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述混合组分I经过制备液相色谱二次分离，得到单体组分1和2。
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述总银杏酸粗品与所述上相、下相的配比为100mg:1-2mL:1-2mL。
6.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体操作为：向所述单体组分1-5的溶液中加入正己烷萃取，将正己烷层转移并减压浓缩干燥，即得银杏酸单体化合物1-5。
7.如权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述单体组分1-5通过高效液相分析，液相条件为：5μm, 4.6mm× 250mm, i.d.规格的Waters Symmetry C18 column色谱柱，紫外检测波长254nm，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用体积比为92:8的甲醇/0.5%乙酸溶液。
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