CN103408602B - 一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，该方法包括以下步骤：⑴藏茵陈药材经醇提、浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏；⑵藏茵陈提取物浸膏溶解后用氯仿、正丁醇萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位；⑶正丁醇部位干燥后得到正丁醇部位干燥粉末；⑷将正丁醇部位干燥粉末溶解后注入到制备型高效液相色谱中，经洗脱、在线紫外检测、干燥后即得含四种化合物的组分群；⑸溶剂系统中的固定相、流动相泵入高速逆流色谱仪中，平衡后对组分群进行分离，得到纯度大于90%的四种苷类混合物；⑹混合物溶解后上样到凝胶分离柱中，经洗脱、干燥即得纯度大于98%的四种苷类化学对照品。本发明分离时间短、有机溶剂消耗少且稳定性和重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学对照品的制备方法，尤其涉及一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法。
背景技术
藏茵陈为藏医用于治疗各种肝炎、胆囊炎及利胆退黄等肝胆系统疾病。目前无法稳定从藏茵陈中获得纯度为98%以上的化学对照品，不能满足藏茵陈新药创制及相关制剂的质量控制要求，制约了藏茵陈药材的药用开发研究。
国内外的学者也对龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷、异荭草苷化学成分进行了分离纯化，例如专利CN102503996A对藏茵陈中龙胆苦苷进行分离纯化，但是未得到龙胆苦苷的化学对照品，只是得到了龙胆苦苷的混合物。专利CN102372752A采用大孔树脂、聚酰胺柱分离从秦艽中分离得到龙胆苦苷，学者雷宇佳等也应用制备型液相从川西獐牙菜中分离纯化龙胆苦苷（色谱，2010，09期），专利CN1844133采用树脂脱色等技术从芒果叶或扁桃叶中制备高纯度芒果苷，提取的芒果苷纯度大于90%。袁叶飞等采用溶剂提取法与聚酰胺柱色谱法分离芒果苷（时珍国医国药，2009，20卷），专利CN102285976从竹叶黄酮中提取异荭草苷，赵平等从荭草中采用柱分离得到了异荭草苷对照品（贵阳医学院学报，2008，33期），从上述专利与文献可以看出分离龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷、异荭草苷均采用常规的分离技术，而这些技术不仅费时、污染环境，而且对样品有不可逆行的吸附作用，不适合大规模应用。
高速逆流色谱技术是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支撑物的高效、快速的液液分配色谱分离技术。该技术具有分离量大、样品无损耗、回收率高、节约溶剂等优点，已广泛应用于生物、医药、环保等领域。专利CN101070335采用高速逆流从龙胆中分离龙胆苦苷，专利CN102617669A采用大孔树脂与高速逆流技术从芒果皮中分离纯度芒果苷。但利用制备液相色谱、高速逆流色谱和凝胶色谱从藏茵陈药材中同时分离制备获得纯度在98%以上龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷化学对照品的专利及文献尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种分离时间短、有机溶剂消耗少且稳定性和重复性好的从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材以1g：5mL~30mL的比例用体积浓度为5~95%的乙醇或体积浓度为5~100%的甲醇在提取温度为60~95℃、提取次数2~4次、每次1~4h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；所述提取液在压力为0.02~0.07MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏；
⑵萃取：
将所述藏茵陈提取物浸膏用其质量的1~10倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位；
⑶所述正丁醇部位干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末；
⑷制备液相色谱粗分离：
将所述正丁醇部位干燥粉末用其质量的1~10倍的体积浓度为5~100%的甲醇或体积浓度为5~95%的乙醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为60%~70%甲醇溶液进行洗脱，并采用210nm~280nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.02~0.07MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群；
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将所述固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到700~900转/min的转速后，将所述流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将所述步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物；所述溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：1.5~2.5：2~4：3的体积比混合而成；
⑹凝胶色谱分离纯化：
将所述獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的1~10倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为1mL/min~10mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.02~0.07MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品。
所述步骤⑴中藏茵陈药材是指川西獐牙菜（Swertiamussotii）、抱茎獐牙菜（Swertiafranchetiana）、印度獐牙菜（Swertiachirayita）和肋柱花（Lomatogoniumrotatum）中的一种。
所述步骤⑶中的干燥是指冷冻干燥、喷雾干燥、烘箱干燥中的一种。
所述冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-20~-50℃，真空度为20Pa~50Pa。
所述喷雾干燥的条件是指入料流量为200~1000mL/h，入料温度为30~70℃，进风温度为170~210℃，进风量为16~28m3/h。
所述烘箱干燥的温度为40~70℃。
所述步骤⑷中的洗脱条件是指洗脱流速为20mL/min~100mL/min，洗脱体积为色谱柱体积2~10倍。
所述步骤⑷中的制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
所述步骤⑸中高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为1~3mL/min，检测波长210nm~280nm，温度为20℃~40℃。
所述步骤⑹凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用制备色谱、高速逆流色谱和凝胶色谱相结合的分离纯化技术，可缩短分离时间，减少有机溶剂消耗，而且稳定性和重复性好。
2、由于本发明采用制备色谱、高速逆流色谱和凝胶色谱相结合的分离纯化技术，可稳定获得纯度在98%以上的化学对照品，应用于药物分析、药材及药品质量控制等领域。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明藏茵陈组分群高效液相色谱分析图；其中液相条件为0~40min，10%甲醇~40%甲醇，40~55min，40%甲醇~50%甲醇，55~60min，50%甲醇~50%甲醇，流速为1ml/min，检测波长为254nm。图中A为龙胆苦苷，B为芒果苷，C为獐牙菜苷，D为异荭草苷。
图2为本发明藏茵陈组分群高速逆流色谱分离图（I为獐牙菜苷，II为异荭草苷，III为龙胆苦苷与芒果苷的混合物）。
图3为本发明目标化合物A龙胆苦苷样品纯度检测图。其中液相条件为0~40min，10%甲醇~40%甲醇，40~55min，40%甲醇~50%甲醇，55~60min，50%甲醇~50%甲醇，流速为1ml/min，检测波长为254nm。
图4为本发明A龙胆苦苷光谱图。
图5为本发明目标化合物B芒果苷样品纯度检测图。其中液相条件为0~40min，10%甲醇~40%甲醇，40~55min，40%甲醇~50%甲醇，55~60min，50%甲醇~50%甲醇，流速为1ml/min，检测波长为254nm。
图6为本发明B芒果苷光谱图。
图7为本发明目标化合物C獐牙菜苷样品纯度检测图。其中液相条件为0~40min，10%甲醇~40%甲醇，40~55min，40%甲醇~50%甲醇，55~60min，50%甲醇~50%甲醇，流速为1ml/min，检测波长为254nm。
图8为本发明C獐牙菜苷光谱图。
图9为本发明目标化合物D异荭草苷样品纯度检测图。其中液相条件为0~40min，10%甲醇~40%甲醇，40~55min，40%甲醇~50%甲醇，55~60min，50%甲醇~50%甲醇，流速为1ml/min，检测波长为254nm。
图10为本发明D异荭草苷光谱图。
具体实施方式
实施例1一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——川西獐牙菜（Swertiamussotii）以1g：5mL的比例用体积浓度为5%的乙醇在提取温度为60℃、提取次数2次、每次1h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.02MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的1倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在冷肼温度为-20℃，真空度为20Pa的条件下经冷冻干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的1倍的体积浓度为5%的甲醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为60%甲醇溶液进行洗脱，并采用210nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.02MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为20mL/min，洗脱体积为色谱柱体积2倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到700转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：1.5：2：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为1mL/min，检测波长210nm，温度为20℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的1倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为1mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.02MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
实施例2一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——抱茎獐牙菜（Swertiafranchetiana）以1g：30mL的比例用体积浓度为95%的乙醇在提取温度为95℃、提取次数4次、每次4h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.07MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的10倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在冷肼温度为-50℃，真空度为50Pa的条件下经冷冻干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的10倍的体积浓度为100%的甲醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为70%甲醇溶液进行洗脱，并采用280nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.07MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为100mL/min，洗脱体积为色谱柱体积10倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到900转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2.5：4：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为3mL/min，检测波长280nm，温度为40℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的10倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为10mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.07MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例3一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——抱茎獐牙菜（Swertiafranchetiana）以1g：20mL的比例用体积浓度为5%的甲醇在提取温度为75℃、提取次数3次、每次2h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.05MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的5倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在温度为40℃的条件下经烘箱干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的5倍的体积浓度为5%的乙醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为65%甲醇溶液进行洗脱，并采用254nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.05MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为50mL/min，洗脱体积为色谱柱体积5倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到850转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2：3：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为2mL/min，检测波长270nm，温度为35℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的8倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为6mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.06MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例4一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——印度獐牙菜（Swertiachirayita）以1g：25mL的比例用体积浓度为100%的甲醇在提取温度为82℃、提取次数2次、每次2.5h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.04MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的7倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在温度为70℃的条件下经烘箱干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的5.5倍的体积浓度为95%的乙醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为64%甲醇溶液进行洗脱，并采用230nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.04MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为70mL/min，洗脱体积为色谱柱体积4倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到750转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2：4：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为2.5mL/min，检测波长254nm，温度为28℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的7倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为6mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.07MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例5一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——印度獐牙菜（Swertiachirayita）以1g：18mL的比例用82%的乙醇在提取温度为84℃、提取次数3次、每次2.4h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.03MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的8倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在在入料流量为200mL/h，入料温度为30℃，进风温度为170℃，进风量为16m3/h的条件下经喷雾干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的7倍的体积浓度为95%的甲醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为64%甲醇溶液进行洗脱，并采用225nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.05MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为80mL/min，洗脱体积为色谱柱体积3倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到880转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2：3：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为1.8mL/min，检测波长230nm，温度为27℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的5倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为4.5mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.06MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例6一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——印度獐牙菜（Swertiachirayita）以1g：14mL的比例用体积浓度为55%的甲醇在提取温度为75℃、提取次数3次、每次3.5h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.07MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的8倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在在入料流量为1000mL/h，入料温度为70℃，进风温度为210℃，进风量为28m3/h的条件下经喷雾干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的4倍的体积浓度为35%的乙醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为68%甲醇溶液进行洗脱，并采用268nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.05MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为80mL/min，洗脱体积为色谱柱体积6倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到770转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2.5：3：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为1.5mL/min，检测波长260nm，温度为35℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的3倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为9.5mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.05MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例7一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——肋柱花（Lomatogoniumrotatum）以1g：28mL的比例用体积浓度为72%的乙醇在提取温度为81℃、提取次数3次、每次2.5h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.06MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的7倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在入料流量为600mL/h，入料温度为50℃，进风温度为190℃，进风量为22m3/h的条件下经喷雾干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的6.5倍的体积浓度为52%的甲醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为62%甲醇溶液进行洗脱，并采用270nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.06MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为95mL/min，洗脱体积为色谱柱体积5倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到860转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2：3：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为2.2mL/min，检测波长240nm，温度为36℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的3倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为7mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.05MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例8一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——肋柱花（Lomatogoniumrotatum）以1g：12mL的比例用体积浓度为74%的甲醇在提取温度为65℃、提取次数2次、每次3h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.06MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的4倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在温度为55℃条件下经烘箱干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的4倍的体积浓度为65%的甲醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为62%甲醇溶液进行洗脱，并采用255nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.07MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为100mL/min，洗脱体积为色谱柱体积10倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到725转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2：3.5：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为2.4mL/min，检测波长210nm，温度为23℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的7.5倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为4.5mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.06MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
实施例9一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材——川西獐牙菜（Swertiamussotii）以1g：8mL的比例用体积浓度为45%的甲醇在提取温度为84℃、提取次数2次、每次3.5h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；提取液在压力为0.05MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏。
⑵萃取：
将藏茵陈提取物浸膏用其质量的4.5倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位。
⑶正丁醇部位在冷肼温度为-35℃，真空度为35Pa的条件下经冷冻干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末。
⑷制备液相色谱粗分离：
将正丁醇部位干燥粉末用其质量的4.8倍的体积浓度为25%的甲醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为69%甲醇溶液进行洗脱，并采用230nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.06MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群（液相色谱分析图如图1）。
其中：洗脱条件是指洗脱流速为75mL/min，洗脱体积为色谱柱体积4.5倍。
制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um。
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到850转/min的转速后，将流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物（高速逆流色谱图如图2）；溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：2：3：3的体积比（mL/mL）混合而成。
其中：高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为2.7mL/min，检测波长248nm，温度为34℃。
⑹凝胶色谱分离纯化：
将獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的5.5倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为7.2mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.07MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品（液相检测图如图3~10）。
其中：凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
Claims (5)
1.一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴制备提取物浸膏：
将藏茵陈药材以1g：5mL~30mL的比例用体积浓度为5~95%的乙醇或体积浓度为5~100%的甲醇在提取温度为60~95℃、提取次数2~4次、每次1~4h的条件下进行加热回流提取，合并提取液；所述提取液在压力为0.02~0.07MPa条件下经减压浓缩后得到藏茵陈提取物浸膏；所述藏茵陈药材是指川西獐牙菜、抱茎獐牙菜、印度獐牙菜和肋柱花中的一种；
⑵萃取：
将所述藏茵陈提取物浸膏用其质量的1~10倍去离子水溶解后，依次用氯仿、正丁醇进行萃取，分别得到氯仿部位、正丁醇部位和水部位；
⑶所述正丁醇部位干燥至恒重后，得到正丁醇部位干燥粉末；
⑷制备液相色谱粗分离：
将所述正丁醇部位干燥粉末用其质量的1~10倍的体积浓度为5~100%的甲醇或体积浓度为5~95%的乙醇溶解，然后注入到制备型高效液相色谱中，用体积浓度为60%~70%甲醇溶液进行洗脱，并采用210nm~280nm的检测波长进行在线紫外检测，收集洗脱液A；该洗脱液A在压力为0.02~0.07MPa条件下经浓缩干燥后即得含龙胆苦苷、芒果苷、獐牙菜苷和异荭草苷四种化合物的组分群；所述洗脱条件是指洗脱流速为20mL/min~100mL/min，洗脱体积为色谱柱体积2~10倍；所述制备型高效液相柱为市售产品，且其填料为C8或C18键合相填料，填料粒径为5~20um；
⑸高速逆流色谱分离：
将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层，取下相为固定相，上相为流动相；将所述固定相泵入高速逆流色谱仪中，启动主机，待达到700~900转/min的转速后，将所述流动相泵入所述高速逆流色谱仪，待平衡后，将所述步骤⑷所得的组分群溶于上相溶液中，过滤，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分，得到纯度大于90%的獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物；所述溶剂系统由氯仿、正丁醇、甲醇、水按4：1.5~2.5：2~4：3的体积比混合而成；所述高速逆流色谱仪的工作条件是指流速为1~3mL/min，检测波长210nm~280nm，温度为20℃~40℃；
⑹凝胶色谱分离纯化：
将所述獐牙菜苷和异荭草苷粗品及龙胆苦苷和芒果苷混合物用其质量的1~10倍的体积浓度为100%的甲醇溶解后，上样到凝胶分离柱中，并采用体积浓度为100%的甲醇溶液进行洗脱，流速为1mL/min~10mL/min，得到洗脱液B；该洗脱液B在压力为0.02~0.07MPa条件下经浓缩干燥至恒重后得到纯度大于98%的獐牙菜苷、异荭草苷、龙胆苦苷和芒果苷化学对照品；所述凝胶分离柱中的凝胶填料为SephadexLH-20。
2.如权利要求1所述的一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，其特征在于：所述步骤⑶中的干燥是指冷冻干燥、喷雾干燥、烘箱干燥中的一种。
3.如权利要求2所述的一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，其特征在于：所述冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-20~-50℃，真空度为20Pa~50Pa。
4.如权利要求2所述的一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，其特征在于：所述喷雾干燥的条件是指入料流量为200~1000mL/h，入料温度为30~70℃，进风温度为170~210℃，进风量为16~28m3/h。
5.如权利要求2所述的一种从藏茵陈中分离制备四种苷类化学对照品的方法，其特征在于：所述烘箱干燥的温度为40~70℃。
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