CN104645667A - 扩张床色谱与逆流色谱在线联用方法、应用及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用方法、应用及装置，方法包括：(1)将天然产物置于提取装置中，加入提取试剂，进行提取；(2)循环提取；(3)提取完毕，进行洗脱；(4)通过泵将洗脱液输送至接口，完成第一部分样品的处理与收集；(5)将已准备好的固定相泵入逆流色谱柱中，待固定相充满后，将主机转速调至设定值，以恒定流速泵入流动相；(6)待两相在色谱柱中达到平衡后，切换接口处进样阀，将样品溶液注入接口；(7)样品溶液经接口处理后，再切换进样阀，将样品注入逆流色谱仪中进行分离；(8)调节检测器，根据检测器谱图，使用自动馏分收集器收集目标馏分。本发明的优点：提取时间短、自动化程度高、目标成分损耗小。

Description

扩张床色谱与逆流色谱在线联用方法、应用及装置

【技术领域】

本发明涉及色谱装置技术领域，具体地说，是一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用方法、应用及装置。

【背景技术】

天然产物包含的化学成分非常复杂，其中起疗效作用的有效成分种类繁多，包括蛋白、多糖、氨基酸、生物碱、挥发油、黄酮类、鞣质、萜类、甾体化合物等天然成分。提取分离有效成分及有效部位可以降低原药材的毒性，提高其疗效，对于促进天然产物发展有着重要的意义。制约天然产物制药业的关键因素之一是对有效成分的提取和分离，传统的提取分离方法，普遍存在着有效成分提取率低、能耗高、工序多和生产周期长等缺点。随着我国中药现代化进程的加速，中药相关产品的质量标准不断提高，特别是指纹图谱及多指标成分定量研究工作的开展，对中药对照品的数量及品种的需求也越来越大。另一方面，中药中的单体化合物也是西药及先导化合物的重要来源。在这些药物的研制过程中，药效筛选需要一定量的单体化合物，先导化合物的修饰更需要一定量的单体化合物。从天然产物中直接提取单体成分可以大大降低成本。随着现代科技的不断发展，在药物研发中，为了达到减少杂质、提高药效，降低成本这些目标，一些现代的高新工程技术正在不断地被借鉴到药物生产中来。

扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption，EBA)是上世纪九十年代发展起来的新型分离纯化技术，集澄清、浓缩和初步纯化于一体的新型集成操作过程，可以减小离心或过滤等单元操作步骤，降低分离纯化的成本，简化了纯化工艺，是一项应用广阔的分离技术。目前扩张床主要用于生物样品的分离纯化，较少应用于中药分离。集成化分离是将固液分离和液液分离集中到扩张床分离过程中，实现操作的简便化和过程的高效化。

扩张床作为一种特殊化的流化床技术，在低流速条件下操作，能使床层达到稳定的分级，故返混较小，接近于固定床。扩张床吸附剂有一定的粒径和密度分布，在操作过程中粒径大的或密度大的吸附剂颗粒分布在床层底部，粒径小的或密度小的颗粒分布在床层上部。控制适当的操作条件，就可以使颗粒在床体中的返混运动受到限制，从而使吸附剂达到分层的要求。单个颗粒仅在小范围内做圆周运动，液相流动为活塞流。分层后的扩张床床体具有高于固定床的空隙率，这可以使固体颗粒穿过床体，这也是扩张床能够处理含有固体颗粒提取液的原因。

高速逆流色谱技术(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是当前国际上较新型无固体载体的液-液分配技术，最初由美国国立健康研究院Ito教授研制开发，经过十余年的研发，CCC进一步发展成高速逆流色谱。由于其克服了传统固相载体对样品的死吸附作用，以及与相关的分析、分离技术联用非常适合天然产物研究工作。

高速逆流色谱与传统的色谱法相比较具有明显的不同，主要在以下几个方面：(1)由于高速逆流色谱为连续的液液分配色谱，无需固体支持，避免了样品在分离过程中的不可逆性吸附、分解等问题，适合天然活性成分的分离。(2)由于液体作为流动相和固定相，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收，能够同时完成分离纯化与制备，适于制备性分离。(3)高速逆流色谱可以通过对溶剂系统的改变，对不同极性范围的化合物进行分离，特别符合天然产物的复杂、多样性的特点。(4)与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍。与常压、低压色谱相比。HSCCC的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个化合物，并且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。(5)可以采用多种洗脱方式，如等比例洗脱、梯度洗脱，或者双向洗脱方式对样品进行有效的分离。基于以上特点高速逆流色谱被广泛的应用于生物医药、农业食品，特别是天然药物化学等领域。

在线联用技术是将两种或两种以上的方法通过接口结合起来使用的技术，它们相互取长补短、协同作用，不仅可以提高方法的灵敏度、准确度，还可能获得两种方法单独使用时所不具备的功能。因此，在线联用技术一直是分析化学研究的前沿领域之一。其中，色谱联用技术发展最为迅速。色谱作为一种非常有效的分离方法，常常与其他定性方法联用，实现对复杂混合物的分析。另一方面，一种色谱也可以与另外一种色谱方法联用(二维色谱)，以发挥不同分离模式色谱各自特有的分离能力。

虽然色谱联用技术已发展多年，但其依然是分析化学领域的研究热点之一。色谱联用技术正朝着多维、小尺度等方向发展，且涉及到的方法和技术也日益增多，如气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱等分离方法与紫外、质谱、红外、核磁共振、近红外等分析方法联用。多维色谱分离技术是将样品注入呈正交分布的多个分离体系中，样品中各组分以进样点为原点在多维的分离方向上展开。其优点在于分离能力强，峰容量高，省去了复杂的前处理步骤，可用于极其复杂体系的分离与分析。未来联用技术会成为解决常规分析问题的有力手段。

将扩张床和逆流色谱联用，可充分发挥二者的优势。扩张床色谱用于天然产物的提取和第一维初步分离，所得组分通过接口转移至第二维高速逆流色谱进一步纯化，得到目标化合物。由此可见，扩张床与高速逆流色谱联用系统可以实现从天然产物中一步获得单体化合物，是一种快速、高效、损耗小的色谱在线联用模式。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用方法、应用及装置；本发明可以将天然产物材成分提取、浓缩、纯化等多个操作步骤集成于一步完成，能大大缩短操作时间、减少样品损失、提高收率、降低生产成本。通过一个单元的操作，便直接可以从天然产物材中分离出有效单体成分的提取分离天然产物有效单体成分的方法和装置。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用的装置，其包含提取装置，其特征在于，提取装置通过管路连接第一三通阀；第一三通阀通过管路分别连接第一储液罐和蠕动泵；蠕动泵通过管路连接第二三通阀；第二三通阀通过管路连接第三三通阀和第四三通阀；其中第四三通阀通过管路连接扩张床色谱柱上部和提取装置；第三三通阀通过管路连接扩张床色谱柱底部和第一检测器；检测器通过管路连接六通阀的第一端口I；六通阀的第二端口II，六通阀的第五端口V通过管路连接联用接口；六通阀的第三端口III通过管路连接恒流泵；恒流泵通过管路连接第二储液罐；六通阀的第四端口Ⅳ通过管路连接逆流色谱仪；六通阀的第六端口Ⅵ通过管路连接第三储液罐；逆流色谱仪通过管路连接第二检测器；第二检测器通过管路连接自动馏分收集器。

所述提取装置为带加热套的提取罐，超声提取装置，微波提取装置，渗漉提取装置，仿生提取装置或半仿生提取装置中的一种。

所述联用接口为定量环接口，捕集柱接口或者真空溶剂蒸发接口中的一种。

所述的检测器为紫外检测器，蒸发光散射检测器或者荧光检测器中的一种。

一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物中的应用。

一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其包括以下步骤：

(1)将天然产物置于提取装置中，加入提取试剂，进行提取；

所述的天然产物为动物，植物和微生物等多种含有生物活性物质；

所述的提取试剂为甲醇溶液，乙醇溶液，无机盐溶液，稀酸溶液或稀碱溶液；

(2)提取的同时，用蠕动泵将提取装置中提取液通过第一三通阀，第二三通阀，第三三通阀由下而上输送至扩张床色谱柱中，被扩张床色谱柱中的吸附介质吸附后，吸附余液通过第四三通阀流回至提取装置中继续参与提取，形成对药材的循环提取；

所述的扩张床色谱柱中所用的填料为大孔吸附树脂，离子交换树脂，多孔玻璃，葡聚糖-硅胶等扩张床常用吸附基质；

(3)提取完毕，关闭提取装置，通过蠕动泵将第一储液罐中的洗脱溶剂由第一三通阀，第二三通阀，第四三通阀从扩张床色谱柱顶部由上而下输送至扩张床色谱柱中，进行洗脱；

(4)通过蠕动泵将洗脱液经由第一储液罐，第一三通阀，第二三通阀，第三三通阀，第一检测器，六通阀的第一端口I，六通阀的第二端口II，六通阀的第五端口V输送联用接口，完成第一部分样品的处理与收集；

(5)用恒流泵将第二储液罐中的固定相泵入逆流色谱仪中，待固定相充满色谱柱后，将逆流色谱仪主机转速调至设定值，以恒定流速泵入第二储液罐中的流动相；

(7)待两相在逆流色谱仪中达到平衡后，切换六通阀，连同六通阀的第一端口I和六通阀的第六端口Ⅵ，六通阀的第五端口V和六通阀的第四端口Ⅳ，六通阀的第三端口III和六通阀的第二端口II，用恒流泵将联用接口中的样品溶液注入逆流色谱仪中进行分离；

(8)调节第二检测器，根据检测器谱图，使用自动馏分收集器收集目标成分；

所述的目标成分指预提取或分离的天然产物的有效成分；

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

(1)本发明从天然产物中一步制备纯化合物的扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用方法及装置，集合了过去天然产物提取和逆流色谱样品前处理过程中离心、过滤、浓缩、复溶等多个步骤于一个操作单元，具有时间短、效率高的特点；

(2)本发明及装置采用全封闭操作环境，减少了外界环境的接触，可避免样品的污染和损耗；

(3)由于本发明提取分离耗时短，可减少样品与热源的接触时间，能防止样品受热降解导致的损耗。

【附图说明】

图1本发明的结构示意图；

附图中的标记为：1提取装置，2第一三通阀，3第一储液罐，4蠕动泵，5第二三通阀，6第三三通阀，7第四三通阀，8扩张床色谱柱，9第一检测器，10六通阀，11恒流泵，12第二储液罐，13第三储液罐，14联用接口，15逆流色谱仪，16第二检测器，17自动馏分收集器；I第一端口，II第二端口，、III第三端口，Ⅳ第四端口，V第五端口，Ⅵ第六端口。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用方法、应用及装置的具体实施方式。

实施例1

请参见附图1，一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用的装置，其包含提取装置，提取装置1通过管路连接第一三通阀2；第一三通阀2通过管路分别连接第一储液罐3和蠕动泵4；蠕动泵4通过管路连接第二三通阀5；第二三通阀5通过管路连接第三三通阀6和第四三通阀7；其中第四三通阀7通过管路连接扩张床色谱柱8上部和提取装置1；第三三通阀6通过管路连接扩张床色谱柱8底部和第一检测器9；检测器9通过管路连接六通阀10第一端口I；六通阀10第二端口II、第五端口V通过管路连接联用接口14；六通阀第三端口III通过管路连接恒流泵11；所述恒流泵11通过管路连接第二储液罐12；所述六通阀第四端口Ⅳ通过管路连接逆流色谱仪15；六通阀第六端口Ⅵ通过管路连接第三储液罐13；逆流色谱仪15通过管路连接第二检测器16；第二检测器16通过管路连接自动馏分收集器17。

一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其包括以下步骤：

(1)将天然产物置于提取装置1中，加入提取试剂，进行提取；(2)提取的同时，用蠕动泵4将提取装置1中的提取液经第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6，由下而上输送至扩张床色谱柱8中，吸附余液经第四三通阀7流回至提取装置1中继续参与提取，形成对药材的循环提取；(3)提取完毕，关闭提取装置1，切换第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6、第四三通阀7，通过蠕动泵4将第一储液罐3中洗脱溶剂从扩张床色谱柱8顶部由上而下输送至扩张床色谱柱8中，进行洗脱；(4)通过蠕动泵4将第一储液罐3中洗脱液经第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6、检测器9、六通阀10第一端口I、第二端口II输送至联用接口14，完成第一部分样品的处理与收集，余液经六通阀10第五端口V、第六端口Ⅵ流至第三储液罐13；(5)用恒流泵11将第二储液罐12中已准备好的逆流色谱固定相经六通阀10第三端口III、第四端口Ⅳ泵入逆流色谱仪15中，待逆流色谱固定相充满后，将逆流色谱仪15主机转速调至设定值，以恒定流速泵入储液罐12中的逆流色谱流动相；(6)待两相在逆流色谱仪15中达到平衡后，切换六通阀10，用储液罐12中的逆流色谱流动相经六通阀10的第三端口III、第二端口II，将联用接口中的样品经六通阀10的第五端口V、第四端口Ⅳ注入逆流色谱仪15中进行分离；(8)调节第二检测器16，根据第二检测器16谱图，使用自动馏分收集器17收集目标馏分。

通过本发明装置对丹参有效成分的提取分离，详细说明本发明从天然产物中一步制备纯化合物的扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用的方法，本发明方法包括以下步骤：

(1)将丹参饮片37g置于提取装置1中，加入提取液(本实施例采用250mL水)，启动提取装置1，对提取装置1中的丹参进行提取；

(2)在提取的同时，用蠕动泵4将提取装置1中的提取液经第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6，由下而上输送至扩张床色谱柱8中，提取液被吸附介质吸附后，吸附余液经第四三通阀7流回至提取装置1中继续参与提取，形成对药材的循环提取；

(3)提取完毕，关闭提取装置1，切换第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6、第四三通阀7，通过蠕动泵4将第一储液罐3中洗脱溶剂从扩张床色谱柱8顶部由上而下输送至扩张床色谱柱8中，用4倍柱体积进行洗脱，洗脱液经第三三通阀6、检测器9、六通阀10第一端口I、第二端口II、联用接口14、六通阀10第五端口V、第六端口Ⅵ流至第三储液罐13中储存；

(4)通过蠕动泵4将第一储液罐3中洗脱液经第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6输送通过检测器9，当被检测的洗脱液中丹参有效成分高于预设值后，高浓度洗脱液充满定量环接口14，切换六通阀10，使六通阀10的第一端口I和第二端口Ⅱ，第三端口III和第四端口Ⅳ，第五端口V和第六端口Ⅵ连通，待样品溶液充满定量环接口14，完成第一部分样品的处理与收集，余液流至第三储液罐13；

(5)配制逆流色谱溶剂体系，将上、下相分别作为逆流色谱的固定相和流动相；(6)用恒流泵11将固定相从第二储液罐12中经六通阀10的第三端口III和第四端口Ⅳ泵入逆流色谱仪15中，待固定相充满逆流色谱仪15后，将逆流色谱仪15主机转速调至设定值，再以恒定流速将流动相从第二储液罐12中泵入；

(7)待两相在逆流色谱仪15中达到平衡后，切换六通阀10，通过恒流泵将流动相，经六通阀10的第三端口III、第二端口II将联用接口14中的样品溶液通过六通阀10的第五端口V、第四端口Ⅳ，注入逆流色谱15中进行分离；

(8)调节第二检测器16，根据检测器谱图，使用自动馏分收集器17收集目标成分。

采用本发明方法和装置，对丹参的提取纯化结果，与离线提取分离方法相比较，其结果对比如下：

表1本发明与离线方法在一步分离37g丹参有效成分的情况对比

从表1对比结果可以看出，本方法及装置具有环保、快速、步骤简化、效率高，主产物(丹酚酸B)纯度好等优点。

实施例3

通过本发明装置对黄连有效成分的提取分离，详细说明本发明从天然产物中一步制备纯化合物的扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用的方法，本发明方法包括以下步骤：

(1)将黄连饮片10g置于提取装置1中，加入提取液(本实施例采用150mI水)，启动提取装置1，对提取装置1中的黄连进行提取；

(2)在提取的同时，用蠕动泵4将提取装置1中的提取液经第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6，由下而上输送至扩张床色谱柱8中，提取液被吸附介质吸附后，吸附余液经第四三通阀7流回至提取装置1中继续参与提取，形成对药材的循环提取；

(3)提取完毕，关闭提取装置1，切换第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6、第四三通阀7，通过蠕动泵4将第一储液罐3中洗脱溶剂从扩张床色谱柱8顶部由上而下输送至扩张床色谱柱8中，用4倍柱体积进行洗脱，洗脱液经第三三通阀6、检测器9、六通阀10第一端口I、第二端口II、联用接口14、六通阀10第五端口V、第六端口Ⅵ流至第三储液罐13中储存；

(4)通过蠕动泵4将第一储液罐3中洗脱液经第一三通阀2、第二三通阀5、第三三通阀6输送通过检测器9，当被检测的洗脱液中黄连有效成分高于预设值后，高浓度洗脱液充满定量环接口14，切换六通阀10，使六通阀10的第一端口I和第二端口II，第三端口III和第四端口Ⅳ，第五端口V和第六端口Ⅵ连通，待样品溶液充满定量环接口14，完成第一部分样品的处理与收集，余液流至第三储液罐13；

(5)配制逆流色谱溶剂体系，将上、下相分别作为逆流色谱的固定相和流动相；

(6)用恒流泵11将固定相从第二储液罐12中经六通阀10的第三端口III和第四端口Ⅳ泵入逆流色谱仪15中，待固定相充满逆流色谱仪15后，将逆流色谱仪15主机转速调至设定值，再以恒定流速将流动相从第二储液罐12中泵入；

(7)待两相在逆流色谱仪15中达到平衡后，切换六通阀10，通过恒流泵将流动相，经六通阀10的第三端口III、第二端口II将联用接口14中的样品溶液通过六通阀10的第五端口V、第四端口Ⅳ，注入逆流色谱15中进行分离；

(8)调节第二检测器16，根据检测器谱图，使用自动馏分收集器17收集目标成分。

采用本发明方法和装置，对黄连的提取纯化结果，与离线提取分离方法相比较，其结果对比如下：

表2本发明与离线方法在一步分离10g黄连有效成分的情况对比

从表2对比结果可以看出，本方法及装置具有环保、快速、步骤简化、效率高，产物纯度好等优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用的装置，其包含提取装置，其特征在于，提取装置通过管路连接第一三通阀；第一三通阀通过管路分别连接第一储液罐和蠕动泵；蠕动泵通过管路连接第二三通阀；第二三通阀通过管路连接第三三通阀和第四三通阀；其中第四三通阀通过管路连接扩张床色谱柱上部和提取装置；第三三通阀通过管路连接扩张床色谱柱底部和第一检测器；检测器通过管路连接六通阀的第一端口I；六通阀的第二端口II，六通阀的第五端口V通过管路连接联用接口；六通阀的第三端口III通过管路连接恒流泵；恒流泵通过管路连接第二储液罐；六通阀的第四端口Ⅳ通过管路连接逆流色谱仪；六通阀的第六端口Ⅵ通过管路连接第三储液罐；逆流色谱仪通过管路连接第二检测器；第二检测器通过管路连接自动馏分收集器。

2.如权利要求1所述的一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用的装置，其特征在于，所述提取装置为带加热套的提取罐，超声提取装置，微波提取装置，渗漉提取装置，仿生提取装置或半仿生提取装置中的一种。

3.如权利要求1所述的一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用的装置，其特征在于，所述联用接口为定量环接口，捕集柱接口或者真空溶剂蒸发接口中的一种。

4.如权利要求1所述的一种扩张床色谱与逆流色谱在线联用的装置，其特征在于，所述的检测器为紫外检测器，蒸发光散射检测器或者荧光检测器中的一种。

5.一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物中的应用。

6.一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)将天然产物置于提取装置中，加入提取试剂，进行提取；

(2)提取的同时，用蠕动泵将提取装置中提取液通过第一三通阀、第二三通阀，第三三通阀由下而上输送至扩张床色谱柱中，被扩张床色谱柱中的吸附介质吸附后，吸附余液通过第四三通阀流回至提取装置中继续参与提取，形成对药材的循环提取；

(3)提取完毕，关闭提取装置，通过蠕动泵将第一储液罐中的洗脱溶剂由第一三通阀，第二三通阀，第四三通阀从扩张床色谱柱顶部由上而下输送至扩张床色谱柱中，进行洗脱；

(4)通过蠕动泵将洗脱液经由第一储液罐，第一三通阀，第二三通阀、第三三通阀，第一检测器，六通阀的第一端口I，六通阀的第二端口II，六通阀的第五端口V输送联用接口，完成第一部分样品的处理与收集；

(5)用恒流泵将第二储液罐中的固定相泵入逆流色谱仪中，待固定相充满色谱柱后，将逆流色谱仪主机转速调至设定值，以恒定流速泵入第二储液罐中的流动相；

(7)待两相在逆流色谱仪中达到平衡后，切换六通阀，连同六通阀的第一端口I和六通阀的第六端口Ⅵ，六通阀的第五端口V和六通阀的第四端口Ⅳ，六通阀的第三端口III和六通阀的第二端口II，用恒流泵将联用接口中的样品溶液注入逆流色谱仪中进行分离；

(8)调节第二检测器，根据检测器谱图，使用自动馏分收集器收集目标成分。

7.如权利要求6所述的一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的天然产物为动物、植物和微生物等多种含有生物活性物质。

8.如权利要求6所述的一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的提取试剂为甲醇溶液、乙醇溶液、无机盐溶液、稀酸溶液或稀碱溶液。

9.如权利要求6所述的一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的扩张床色谱柱中所用的填料为大孔吸附树脂，离子交换树脂，多孔玻璃，葡聚糖-硅胶等扩张床常用吸附基质。

10.如权利要求6所述的一种扩张床色谱与高速逆流色谱在线联用装置在天然产物中一步制备纯化合物的应用方法，其特征在于，在所述的步骤(8)中，所述的目标成分指预提取或分离的天然产物的有效成分。