CN103142685B - 一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法，山核桃叶干粉用体积浓度50~95%的乙醇水溶液加热回流提取，过滤得总黄酮苷元提取液；将聚酰胺进行预处理；预处理后的聚酰胺加入总黄酮苷元提取液中，加水后减压蒸馏，得到浓缩后的混合液直接上柱，其中固体聚酰胺自然沉降至平整无气泡；放出柱中液体，然后先用体积浓度20~30%的乙醇水溶液洗去杂质，再用体积浓度40~50%的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干制得总黄酮苷元。本发明的有益效果在于：通过本方法所得到的总黄酮苷元纯度较高，回收率也很高，不但工艺简单，操作方便，而且成本较低，适于工业化生产。

Description

一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法

技术领域

本发明涉及一种利用聚酰胺分离纯化中药有效成分的方法，更具体的来说是聚酰胺分离富集山核桃叶中总黄酮苷元的新方法，属于中药化学的分离纯化技术领域。

背景技术

黄酮类化合物是一种天然存在的有机化合物。在自然界中，黄酮类化合物广泛存在于多种植物的器官（如种子、花、果实、和叶子）和其他中药材原料中，例如回心草、甜茶、金莲花、益母草、银杏叶、山楂、甘蔗、板栗花、蜂胶等里面都含有丰富的黄酮类化合物。凡是有两个苯环（A环和B环）通过三碳链相连结而形成的一类化合物统称为黄酮类化合物，其基本骨架为C6-C3-C6，常有羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等取代。根据其B环的连接位置（2位或3位），C环氧化程度和C环是否成环等因素将黄酮类化合物分为七大类：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇类、异黄酮和二氢异黄酮、查耳酮和二氢查耳酮、橙酮类、花色素和黄烷醇类以及其他黄酮类。目前已经有6000多种黄酮类化合物的结构被鉴定出来，相信随着研究的深入，将会有更多的黄酮类化合物的结构被鉴定出来。黄酮类化合物多是以黄酮苷（黄酮和多糖之间以糖苷键相连）和黄酮苷元（游离的黄酮单体）的形式存在于植物体内和天然中药材原料中。

黄酮类化合物的研究已经非常广泛而深入，其生理及药理作用和活性研究也相当深入。有文献表明，黄酮类化合物有抗炎镇痛、抗过敏、扩张血管、抗氧化、抗心律失常、改善微循环、抗脂肪肝、防止动脉硬化、抗病毒、降血脂、减少糖尿病并发症、协同增进抗肿瘤药物疗效等药理作用。作为一种天然存在的有机化合物，其在治疗心血管疾病领域有着很重要的地位。故从天然植物和中药材原料中提取、分离纯化黄酮类化合物，进而进行有效地药理实验研究是一项极有必要性和有意义的工作。

目前实验室多采用聚酰胺树脂法精制纯化黄酮类化合物，不仅方法简单、成本低、效率高、稳定性好和容易再生等特点，而且其安全性也高，没有重金属和有毒有机试剂残留等问题。层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66。聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键(-CO-NH-)的高分子聚合物，酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附，而与不能形成氢键的化合物分离。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。

查阅相关文献，传统的用聚酰胺纯化精制总黄酮的方法基本上是一致的，下面以用聚酰胺纯化野菊花中的蒙花苷为例简述这种方法。首先，配制蒙花苷标准品溶液，用HPLC制作标准曲线。然后，80%的乙醇浸泡提取野菊花，把提取液浓缩，真空干燥至浸膏状（或干粉）。取少量浸膏加水配制已知浓度的上柱样品液，通过静态吸附考察和动态吸附考察确定综合性能最好的聚酰胺，评价聚酰胺的性能标准是静态吸附量和解吸率，动态吸附量和解吸率。选取最佳的聚酰胺，上柱以后，开始上样（上样液浓度已知），一般都是采用湿法上样。在上样后聚酰胺开始吸附黄酮，由于上样液的浓度、上样液的体积及上样吸附时间这些条件都会影响聚酰胺吸附黄酮的效果，故需要对这些条件进行优化。黄酮吸附在聚酰胺上以后，用洗脱液进行洗脱，洗脱条件的控制亦会对洗脱效果产生很大的影响。例如，洗脱液的浓度、洗脱液的用量、洗脱速度以及除杂液的用量这些条件也需要优化，使洗脱效果达到最佳。由于聚酰胺在水环境下吸附黄酮的效果最佳，故上样液一般都是配制成水溶液，而洗脱液一般都是用不同浓度乙醇来解吸附。

但是，若是用这种方法分离富集黄酮苷元却存在很多问题。我们发现，采用聚酰胺传统分离、富集工艺根本难以做到，原因在于：其一，待分离的黄酮苷元脂溶性较强，用蒸馏水稀释根本无法溶解；其二，虽然可以先用适量的乙醇溶解，然后大量蒸馏水稀释能够溶解，但其体积将非常巨大；其三，聚酰胺在水溶液中对黄酮类物质的吸附能力最强，稀释后的乙醇上样液是否会影响其黄酮苷元吸附仍有待考证。在实际中，无论是用聚酰胺分离富集黄酮苷元还是黄酮苷，我们都有类似问题，然而，检索文献资料，未有相关文献论述这一问题，而且几乎所有文献都只分离富集总黄酮。鉴于前述现象和问题，我们认为有必要采用新的方法工艺，对聚酰胺分离富集黄酮进行改进，以适应实际需求。

发明内容

传统的聚酰胺分离富集黄酮的方法存在一些问题和不足，主要是难以应用于极性较小的黄酮苷及黄酮苷元。

本发明的目的是提供一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法，用以解决目前分离富集黄酮苷元所存在的问题。本方法的操作工艺简单、且分离效果较好。

本发明的目的可以通过以下技术方案予以实现：

一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）山核桃叶干粉用体积浓度50~95%的乙醇水溶液加热回流提取，过滤得总黄酮苷元提取液；

（2）聚酰胺上柱，先用体积浓度80~100%（优选95%）的乙醇冲洗至流出液蒸干后无白色固体，再用蒸馏水洗至pH值中性，然后用4~6倍（优选5倍）柱体积的3~6wt%（优选5wt%）NaOH水溶液冲洗，再用蒸馏水洗至pH值中性，最后用4~6倍（优选5倍）柱体积的5~15wt%（优选10wt%）醋酸冲洗，再用蒸馏水洗至pH值中性，将聚酰胺取出于50~90℃（优选60~70℃）烘干，得到预处理后的聚酰胺；

（3）将步骤（2）得到的预处理后的聚酰胺加入步骤（1）得到的总黄酮苷元提取液中，加入体积为总黄酮苷元提取液20~80%的水（优选为40%），于35~55℃（优选40℃）温度下减压浓缩至反应混合液中无醇味，得到浓缩后的混合液；所述预处理后的聚酰胺和山核桃叶干粉的质量比为20~40∶100（优选为30:100）；

（4）步骤（3）得到的浓缩后的混合液上柱，其中固体聚酰胺自然沉降至平整无气泡；放出柱中液体，然后先用体积浓度20~30%（优选30%）的乙醇水溶液洗去杂质，再用体积浓度40~50%（优选40%）的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干制得总黄酮苷元。

本发明所述步骤（1）优选按以下方法操作：

干燥的山核桃叶粉碎，过50目筛，得山核桃叶干粉，加入体积浓度为50~95%的乙醇水溶液（优选为体积浓度95%的乙醇水溶液）加热回流提取，每次提取时所述乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量计为20~35mL/g（优选25mL/g），所述提取的次数为1~3次（优选提取2次），每次提取通常时间为10~30min，优选为10min，将每次提取后的得到的提取液过滤后合并，即得所述总黄酮苷元提取液。

所述步骤（3）中，减压浓缩的温度优选为40℃；在减压浓缩的过程中，随着乙醇蒸除，反应混合物中浓度的逐渐降低，黄酮和聚酰胺之间会以氢键的方式结合，逐渐吸附在聚酰胺的表面。

所述步骤（4）中，放出柱中液体优选缓慢让柱子中的水流下来，把水溶性的杂质带出来一部分，用体积浓度20~30%的乙醇水溶液洗去杂质，主要除去一些极性稍大的杂质。

所述步骤（4）中，所述体积浓度20~30%的乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量通常计为20~40mL/g，优选为30mL/g，所述体积浓度40~50%的乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量通常计为40~70mL/g，优选为60mL/g。

较为具体的，推荐本发明方法按照以下步骤进行：

（1）干燥的山核桃叶粉碎，过50目筛，得山核桃叶干粉，加入体积浓度为95%的乙醇水溶液加热回流提取2次，每次提取时所述乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量计为20~35mL/g，每次提取时间为10~20min，2次提取后的提取液过滤后合并，即得所述总黄酮苷元提取液；

（2）聚酰胺上柱，先用体积浓度95%的乙醇冲洗至流出液蒸干后无白色固体，再用蒸馏水洗至pH值中性，然后用5倍柱体积的5wt%的NaOH水溶液冲洗，再用蒸馏水洗至pH值中性，最后用5倍柱体积的10wt%醋酸冲洗，再用蒸馏水洗至pH值中性，将聚酰胺取出于60~70℃烘干，得到预处理后的聚酰胺；

（3）将步骤（2）得到的预处理后的聚酰胺加入步骤（1）得到的总黄酮苷元提取液中，加入体积为总黄酮苷元提取液40%的水，于40℃温度下减压浓缩至反应混合液中无醇味，得到浓缩后的混合液；所述预处理后的聚酰胺和山核桃叶干粉的质量比为30∶100；

（4）步骤（3）得到的浓缩后的混合液上柱，其中固体聚酰胺自然沉降至平整无气泡；放出柱中液体，然后先用体积浓度30%的乙醇水溶液洗去杂质，再用体积浓度40%的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干制得总黄酮苷元。

本发明与现有的方法相比较，具有以下优点：1）该方法操作简便，工艺较简单，而且成本较低，非常适合工业化生产分离富集黄酮苷元；2）用此种方法得到的黄酮纯度较高，可以达到87.47%，而且加样回收率也较高，可以达到95.52%。

附图说明

图15种黄酮单体化合物的标准品和实施例1制得的山核桃叶的总黄酮苷元固体产品72nm检测波长下的HPLC色谱图，A曲线对应标准品，B曲线对应实施例1制得的山核桃树叶总黄酮苷元；1-5号峰分别依次对应汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查耳酮和松属素。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步对本发明方案进行说明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1：

（a）聚酰胺的预处理：

1）将80-100目柱层析用聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）上柱，用体积浓度95%的乙醇冲洗至流出液蒸干后无白色固体；

2）再用蒸馏水洗至pH值中性，然后用5倍柱体积的5wt%NaOH水溶液冲洗；

3）再用蒸馏水洗至pH值中性，然后用5倍柱体积的10wt%醋酸冲洗；

4）再用蒸馏水洗至pH值中性，将聚酰胺取出于60℃烘干，得到预处理后的聚酰胺备用。

（b）山核桃叶总黄酮苷元提取液的制备：

称取1Kg山核桃树叶干粉；加入25L的体积浓度95%乙醇加热回流提取，提取2次，每次10min；将2次的提取液过滤后合并，即得到50L山核桃叶总黄酮苷元提取液。

（c）制作标准曲线：

山核桃叶中含有5种黄酮单体化合物，分别是汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查耳酮和松属素。

1）操作步骤：以汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查耳酮和松属素这5种单体化合物为对照品，分别配置成不同浓度的混合溶液，利用HPLC技术以标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积（mUV*min）为纵坐标绘制标准曲线（Y）。

2）高效液相色谱条件及系统适应性：戴安UltiMate3000液相色谱仪分析，戴安Acclaim120C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)，戴安UltiMate3000自动进样器，戴安UltiMate3000DAD检测器，检测波长262nm、272nm、284nm、342nm，流动相0.1wt%乙酸水:100%甲醇=30:70（v/v），流速1mL/min，柱温30℃。汉黄芩素检测波长为272nm、白杨素为262nm、小豆蔻明和球松素查耳酮为342nm、松属素为284nm。各峰与相邻的峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均在1万以上，汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查耳酮、松属素的相对保留时间分别为9.4，10.7，14.9，15.8，20.4min左右。图1中A曲线为标准品在272nm检测波长下的HPLC色谱图。

3）结果表明：汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查耳酮和松属素浓度分别在1.27～25.30、2.56～51.20、1.29～25.60、5.01～100.20和5.06～101.20μg/mL范围内线性关系良好，相应的回归方程分别为：

Y＝1.0120X+0.0590  r=0.9999

Y＝0.8255X-0.0903  r=0.9999

Y＝1.0463X-0.0587  r=0.9999

Y＝0.8067X-0.4716  r=0.9999

Y＝0.7391X+0.3407  r=0.9999

（d）聚酰胺分离富集提取总黄酮苷元：

将步骤（b）得到的50L的山核桃叶总黄酮苷元提取液（预先用HPLC检测其中总黄酮苷元纯度，计算得到提取液中已知物含量）中加入300g步骤（a）得到的预处理后的聚酰胺，然后再加入20L的蒸馏水，把混合液40℃下减压浓缩，使浓缩后的液体体积在15L（这时残余液几乎无醇味）。然后把残余混合液直接上柱，待其慢慢沉降以后，使水慢慢流出。先用30L的体积浓度30%乙醇冲洗，除去极性稍小的杂质，然后用60L的体积浓度40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，得总黄酮苷元固体产品。

将沉降后的流出的水、30L30%乙醇冲洗后收集的冲洗液蒸干，得到固体物，与最后60L40%乙醇洗脱后收集的洗脱液蒸干得到的总黄酮苷元固体产物，均用HPLC检测其中总黄酮苷元含量，即已知物纯度，相应计算得到各洗脱液得到的固体物中已知物的质量，所得结果如下表1，HPLC参数同步骤（c）。

表1聚酰胺分离富集山核桃叶总黄酮苷元结果

由表1可得，最后40%乙醇洗脱得到的总黄酮苷元产品的纯度高达87.47%，而且加样回收率可以达到95.52%，说明山核桃叶总黄酮苷元在聚酰胺上面几乎无死吸附现象。从上面的数据可以得出结论，本发明工艺分离富集山核桃叶总黄酮苷元的效果极好。

Claims (6)

1.一种山核桃叶中总黄酮苷元的提取方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)山核桃叶干粉用体积浓度50～95％的乙醇水溶液加热回流提取，过滤得总黄酮苷元提取液；

(2)聚酰胺上柱，先用体积浓度80～95％的乙醇水溶液冲洗至流出液蒸干后无白色固体，再用蒸馏水洗至pH值中性，然后用4～6倍柱体积的3～6wt％NaOH水溶液冲洗，再用蒸馏水洗至pH值中性，最后用4～6倍柱体积的5～15wt％醋酸冲洗，再用蒸馏水洗至pH值中性，将聚酰胺取出于50～90℃烘干，得到预处理后的聚酰胺；

(3)将步骤(2)得到的预处理后的聚酰胺加入步骤(1)得到的总黄酮苷元提取液中，加入体积为总黄酮苷元提取液体积的20～80％的水，于35～55℃温度下减压浓缩至反应混合液中无醇味，得到浓缩后的混合液；所述预处理后的聚酰胺和山核桃叶干粉的质量比为20～40∶100；

(4)步骤(3)得到的浓缩后的混合液上柱，其中固体聚酰胺自然沉降至平整无气泡；放出柱中液体，然后先用体积浓度20～30％的乙醇水溶液洗去杂质，再用体积浓度40～50％的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液蒸干制得总黄酮苷元。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)按以下方法操作：

干燥的山核桃叶粉碎，过50目筛，得山核桃叶干粉，加入体积浓度为50～95％的乙醇水溶液加热回流提取，每次提取时所述乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量计为20～35mL/g，所述提取的次数为1～3次，每次提取后的提取液过滤后合并，即得总黄酮苷元提取液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，加水的体积为总黄酮苷元提取液体积的40％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述预处理后的聚酰胺和山核桃叶干粉的质量比为30:100。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述乙醇水溶液的体积浓度为95％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述体积浓度20～30％的乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量计为20～40mL/g；所述体积浓度40～50％的乙醇水溶液的体积用量以山核桃叶干粉的质量计为40～70mL/g。