CN104447720A - 一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法，涉及中药化合物单体的制备方法。本发明步骤为，药材的提取；大孔树脂富集；聚酰胺纯化；样品的精制；以D101大孔树脂、聚酰胺、Sephadex LH-20、ODS为填料，设计技术流程，建立一种从溪黄草中制备新西兰牡荆苷-2的方法。本发明的有益效果：本发明能有效地从溪黄草水提液中分离制备新西兰牡荆苷-2，为进一步明确溪黄草药效物质基础提供依据；新西兰牡荆苷-2具有较强的生物活性，制备的新西兰牡荆苷-2可用作标对照品，用于控制溪黄草药材的质量。具有方法简便、稳定、重现性好等优点，经过中式放大，可大量制备新西兰牡荆苷-2单体化合物，开展更多的药理药效实验，为溪黄草这一岭南中药资源的进一步开发利用提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药材单体化合物的分离方法，具体涉及从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法。
背景技术
中药溪黄草[Isodon sorra(Maxim.)Kudo]为民间常用草药。溪黄草性味苦、甘、寒，归肝、胆经，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效，民间历代名医把溪黄草用作清热祛湿、利胆退黄药，治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎，为预防和治疗肝胆疾病的常用药。现代药理实验表明，溪黄草水提液具有较强的抗炎、保肝利胆、抗氧化、抗肿瘤等作用。
然而溪黄草药效物质基础不够明确，过去一直停留在对其低极性成分的研究，对其水溶性成分涉足较少，严重阻碍了溪黄草资源的进一步开发利用。新西兰牡荆苷-2是从溪黄草中分离制得的水溶性极强的碳苷黄酮，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤作用。
发明内容
本发明的目的为建立一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法，通过建立的方法制备新西兰牡荆苷-2单体化合物。
为达到本发明的目的所采用的技术方案：用柱色谱分离法建立一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法：具体包括如下步骤：
、药材的提取：取溪黄草干燥药材，10倍水煎提，3次，每次1.5h，趁热过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩至2.4mg/mL，即得溪黄草水提液。
、样品的精制：溪黄草水提液上D101大孔树脂柱，依次用水、10%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，先用石油醚萃取5次，弃去石油醚层，下部的水层用乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，收集下部的水层，上聚酰胺柱，用水洗脱，收集水洗脱液，上Sephadex LH-20柱，用50%甲醇洗脱，依次出现红黑色、红黄色、黄棕色、淡绿色色带，弃去红黑、红黄及黄棕色色带部分，收集淡绿色色带部分，浓缩至3.0mg/mL，得水溶性黄酮溶液，再过ODS柱，用20%-50%甲醇梯度洗脱，洗脱液50mL接一瓶，HPLC检测，将含新西兰牡荆苷-2纯度较高的洗脱液合并，浓缩，放冷，结晶，倒出母液，洗涤晶体，重结晶，真空冷冻干燥，即得新西兰牡荆苷-2样品。
进一步优选的方法可以通过下述步骤实施：
所述步骤样品的精制，D101大孔树脂，用95%乙醇浸泡过夜，装柱，水洗至无醇味，备用；聚酰胺（80-100目），用95%乙醇混悬，装柱，水洗至无醇味，备用；Sephadex LH-20用甲醇-水（1：1）溶胀4h，装柱，备用；ODS填料用甲醇混悬，装柱，梯度降至20%甲醇，备用；水提液用湿法上样法上D101大孔树脂柱，水洗至颜色很淡，再用95%乙醇洗脱，至颜色很淡，收集95%乙醇洗脱液，回收乙醇，先用石油醚萃取5次，弃去石油醚层，下部的水层再用乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，收集下部的水层，浓缩旋去少量有机溶剂，得水层浓缩液，用湿法上样法上聚酰胺（80-100目）柱，先用2倍柱体积水洗脱，弃去，继续用水洗脱，至颜色很淡，收集水洗脱液，浓缩至5.0mg/mL，加入等体积的甲醇，超声混匀，静置，滤过，得滤液，用湿法上样法上Sephadex LH-20柱，50%甲醇洗脱，依次出现红黑色、红黄色、黄棕色、淡绿色色带，弃去红黑、红黄及黄棕色色带部分，收集淡绿色色带部分，浓缩至3.0mg/mL，得水溶性黄酮溶液，用湿法上样法上ODS柱，20%→25%→30%→35%→50%甲醇梯度洗脱，每个梯度洗3倍柱体积，洗脱液50mL接一瓶，HPLC检测，将含新西兰牡荆苷-2纯度较高的洗脱液合并，浓缩，放冷，结晶，倒出母液，洗涤晶体，重结晶，真空冷冻干燥，即得新西兰牡荆苷-2样品。
本发明的原理是根据溪黄草水提液中主要化学成分是碳苷黄酮物质，其极性较大且有较多酚羟基，再结合D101大孔树脂、聚酰胺、Sephadex LH-20、ODS填料的性质，制定出一套从溪黄草中分离制备新西兰牡荆苷-2的方法。
本发明的有益效果如下：
本发明能有效地从溪黄草水提液中分离制备新西兰牡荆苷-2，为进一步明确溪黄草药效物质基础提供依据。
新西兰牡荆苷-2具有较强的生物活性，本发明制备的新西兰牡荆苷-2可作标准对照品，用于控制溪黄草药材的质量。
本发明具有方法简便、稳定、重现性好等优点，经过中式放大，可大量制备新西兰牡荆苷-2单体化合物，开展更多的药理药效学研究。
附图说明
图1、溪黄草中制备新西兰牡荆苷-2的技术流程。
图2、新西兰牡荆苷-2的结构。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。
实施例一：从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2
1.仪器与试药
1.1 仪器 Shimadzu 高效液相色谱仪（LC-20AT泵；SIL-20A自动进样器；SPD-20A二极管阵列检测器）；Thermo Hypersil Gold C18色谱柱（250 mm×4.6mm,5µm）；CP225D十万分之一电了天平（德国Sartorius 公司）；BP11OS万分之一天平（德国Sartorius 公司）；KQ3200DE医用数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LCQ Deca XP 液－质联用仪；Bruker AVANCE Ⅲ HD 500超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪。
1.2试剂 甲醇、95%乙醇（分析纯）、超纯水：D101大孔树脂、聚酰胺（80-100目）、Sephadex LH-20、ODS。
2.药材的提取：取溪黄草干燥药材（3.0kg），10倍水煎提，3次，每次1.5h，趁热过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至2.4mg/mL，即得溪黄草水提液。
3. 大孔树脂富集，取3.0kg的D101大孔树脂，用95%乙醇浸泡过夜，装柱，水洗至无醇味，水提液湿法上样，水洗至颜色较淡，再用95%乙醇洗脱，洗至颜色很淡，收集95%乙醇洗脱液。
4. 聚酰胺纯化，95%乙醇洗脱液回收乙醇，先用石油醚萃取5次，弃去石油醚层，下部的水层再用乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，收集下部的水层，浓缩旋去少量有机溶剂，得水层浓缩液。取聚酰胺（80-100目），用95%乙醇混悬，装柱，水洗至无醇味，水层浓缩液湿法上样，水洗2倍柱体积，弃去，继续用水洗，收集水洗液。
5. 样品的精制：水洗液浓缩至5.0mg/mL，加入等体积的甲醇，超声混匀，静置，滤过，得滤液。Sephdex LH-20用甲醇-水（1：1）溶胀4h，装柱，滤液湿法上样，甲醇-水（1：1）洗脱，依次出现红黑色、红黄色、黄棕色、淡绿色色带，收集淡绿色色带部分，浓缩至3.0mg/mL，得水溶性黄酮溶液。ODS填料用甲醇混悬，装柱，梯度降至20%甲醇，水溶性黄酮溶液湿法上样，20%→25%→30%→35%→50%甲醇梯度洗脱，每个梯度洗3倍柱体积，洗脱液50mL一瓶，HPLC检测，将含新西兰牡荆苷-2纯度较高的洗脱液合并，浓缩，放冷，析晶，再结晶，倒出母液(母液浓缩继续结晶)，洗涤晶体，真空冷动干燥，精制得新西兰牡荆苷-2样品80.8mg。
通过上述方法所建立的一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的技术流程如图1所示。
所分离的新西兰牡荆苷结构如图2所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，于此所揭示的实施例与所有观点，应被视为用以说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以权利要求为准，并涵盖其合法均等物。
Claims (3)
1. 一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法，该方法包括如下步骤：
、药材的提取：取溪黄草干燥药材，10倍水煎提，3次，每次1.5h，趁热过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩至2.4mg/mL，即得溪黄草水提液；
、样品的精制：溪黄草水提液上D101大孔树脂柱，依次用水、10%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，先用石油醚萃取5次，弃去石油醚层，下部的水层用乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，收集下部的水层，上聚酰胺柱，用水洗脱，收集水洗脱液，上Sephadex LH-20柱，用50%甲醇洗脱，依次出现红黑色、红黄色、黄棕色、淡绿色色带，弃去红黑、红黄及黄棕色色带部分，收集淡绿色色带部分，浓缩至3.0mg/mL，得水溶性黄酮溶液，再过ODS柱，用20%→50%甲醇梯度洗脱，洗脱液50mL接一瓶，HPLC检测，将含新西兰牡荆苷-2纯度较高的洗脱液合并，浓缩，放冷，结晶，倒出母液，洗涤晶体，重结晶，真空冷冻干燥，即得新西兰牡荆苷-2样品。
2. 根据权利要求1所述的一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法，其特征在于：
所述步骤样品的精制，D101大孔树脂，用95%乙醇浸泡过夜，装柱，水洗至无醇味，备用；聚酰胺（80-100目），用95%乙醇混悬，装柱，水洗至无醇味，备用；Sephadex LH-20用甲醇-水（1：1）溶胀4h，装柱，备用；ODS填料用甲醇混悬，装柱，梯度降至20%甲醇，备用；水提液用湿法上样法上D101大孔树脂柱，水洗至颜色很淡，再用95%乙醇洗脱，至颜色很淡，收集95%乙醇洗脱液，回收乙醇，先用石油醚萃取5次，弃去石油醚层，下部的水层再用乙酸乙酯萃取5次，弃去乙酸乙酯层，收集下部的水层，浓缩旋去少量有机溶剂，得水层浓缩液，用湿法上样法上聚酰胺（80-100目）柱，先用2倍柱体积水洗脱，弃去，继续用水洗脱，至颜色很淡，收集水洗脱液，浓缩至5.0mg/mL，加入等体积的甲醇，超声混匀，静置，滤过，得滤液，用湿法上样法上Sephadex LH-20柱，50%甲醇洗脱，依次出现红黑色、红黄色、黄棕色、淡绿色色带，弃去红黑、红黄及黄棕色色带部分，收集淡绿色色带部分，浓缩至3.0mg/mL，得水溶性黄酮溶液，用湿法上样法上ODS柱，20%→25%→30%→35%→50%甲醇梯度洗脱，每个梯度洗3倍柱体积，洗脱液50mL接一瓶，HPLC检测，将含新西兰牡荆苷-2纯度较高的洗脱液合并，浓缩，放冷，结晶，倒出母液，洗涤晶体，重结晶，真空冷冻干燥，即得新西兰牡荆苷-2样品。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种从溪黄草中分离新西兰牡荆苷-2的方法，其特征在于：所制备的新西兰牡荆苷-2，为芹菜素6，8-二-C-ß-D-葡萄糖苷，水溶性极强的碳苷黄酮，且有多方面的生物活性，可作标准对照品用于溪黄草的含量测定。
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