CN105001190A

CN105001190A - 从广金钱草中提取分离Vicenin-2的方法和系统

Info

Publication number: CN105001190A
Application number: CN201510347362.2A
Authority: CN
Inventors: 王学海; 李莉娥; 许勇; 杨仲文; 冯芸; 杨婷; 余通; 尹海龙; 黄璐; 曹儒宾; 谢长
Original assignee: Wuhan Guanggu Humanwell Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: WUHAN KANGLE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: CN105001190B

Abstract

本发明提供了一种提取分离Vicenin-2的方法，该方法包括以下步骤：利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；利用醇体系对提取物进行多级色谱分离，其中包括，利用第一醇体系对提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，利用第三醇体系对第二分离部分进行第三色谱分离，以获得所述Vicenin-2。本发明还提供一种实施上述方法的系统。利用本发明的方法和/或系统从广金钱草中分离提取Vicenin-2，工艺操作简单，生产时间短，产品收率高，纯度高，能够获得纯度达到98％以上的Vicenin-2。

Description

从广金钱草中提取分离Vicenin-2的方法和系统

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体的，本发明涉及一种从广金钱草中提取分离Vicenin-2的方法和系统。

背景技术

广金钱草为豆科山蚂蝗属植物Desmodium styracifolium(Osbeck)Merr.，其药用部位为干燥地上部分，主要化学成分为黄酮、皂苷、多糖、生物碱等化合物。具有清热除湿，利尿通淋之功效。用于热淋、沙淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少、黄疸尿赤、尿路结石。

Vicenin-2也叫6,8-二-C-葡萄糖基芹菜素，为黄色粉末；分子式：C₂₇H₃₀O₁₅；分子量：594；图1显示其化学结构式。

Vicenin-2存在于广金钱草药材中，作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。现有提取分离Vicenin-2的方法和系统亟待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术问题的至少之一或者提供一种商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种从广金钱草中提取分离Vicenin-2的方法和系统，利用该提取分离方法和系统得到的Vicenin-2，纯度高，有利于作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品、以及作为广金钱草及其相关药物制剂的质量控制。

依据本发明的一方面，本发明提供一种提取分离Vicenin-2的方法，该方法包括以下步骤：利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其中包括，利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，利用第三醇体系对所述第二分离部分进行第三色谱分离，以获得所述Vicenin-2。

本发明的该方法，利用多级色谱分离，包括组合利用大孔树脂纯化技术，中压制备及凝胶色谱技术，采用醇-水体系，从广金钱草提取物中分离提取Vicenin-2，该工艺操作简单，生产时间短，产品收率高，纯度高，能够获得纯度达到98％以上的Vicenin-2，获得的Vicenin-2可作为含量测定用化学对照品。该工艺步骤以及各个步骤的参数条件，是发明人综合考虑、多次调整试验大孔树脂色谱、反相中压色谱析和凝胶色谱的组合及其各自的洗脱条件对广金钱草中的Vicenin-2的分离纯化效果的影响而确定下来的，该提取纯化过程不涉及毒性相对强的有机溶剂，提取分离操作过程及提取物都安全可靠。

图2显示本发明的一个实施例中的提取分离图1所示化合物的方法的步骤流程图。根据本发明的实施例，上述本发明一方面的Vicenin-2提取分离方法，还可以具有以下技术特征至少之一：

根据本发明的一个实施例，所述利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物，包括：利用浓度50-95％的乙醇对所述广金钱草进行两次回流提取，合并两次回流提取所得的提取液，获得合并提取液，除去所述合并提取液中的乙醇，和/或除去所述合并提取液中的乙醇和离子，以及任选的，进行干燥，以获得所述提取物。两次浓度为50-95％乙醇回流提取获得提取物，是发明人经过多次试验摸索确定的，既能充分利用原料也能节省时间，利于规模化生产制备；去除提取液中的乙醇和/或离子，利于排除它们对后续分离纯化的干扰。

根据本发明的一个实施例，所述两次回流提取，其中一次的乙醇和广金钱草的重量比为12:1，回流提取的时间为1.5h-3h，任选的为2h，另一次的乙醇和广金钱草的重量比为10:1，回流提取的时间为1h-2h，任选的为1.5h。回流时，浓度为50-95％乙醇和广金钱草的比例以及回流时间，是发明人经过多次试验检测确定的，能够使原料得到高提取。

根据本发明的一些实施例，所述第一醇体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30-35％，较佳的，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30％，所述第一色谱为大孔树脂。该乙醇-水洗脱体系中乙醇的浓度是发明人结合后续色谱分离条件、多次试验检测洗脱下来的峰中的Vicenin-2比例，经过多次调整优化确定的。

根据本发明的一些实施例，所述第二醇体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇的浓度为8-30％，所述第二色谱为反向色谱，较佳的，选择的反向色谱为反向中压色谱，更佳的，选择C18柱，其柱压为1-10bar，洗脱流速为5～30ml/min。该乙醇-水洗脱体系中的乙醇浓度是发明人结合第一分离部分中目标成分的比例，以及第一色谱分离中的乙醇-水洗脱体系，多次试验优化确定的，利于在简单操作和短时间内，获得收率高、纯度高的Vicenin-2。

根据本发明的一个实施例，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，包括：利用乙醇浓度为a的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱25-40min，接着换用乙醇浓度为[a,b]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱180-220min，收集以获得所述第二分离部分，其中，a的取值范围为8-14％，b的取值范围为20-30％。先利用一个浓度的乙醇-水体系等度洗脱，再进行梯度洗脱，能够提高分离提取效率；等度洗脱和梯度洗脱的乙醇浓度或浓度范围，以及洗脱时间，是发明人考虑收率、时间、回收的分离部分的复杂度、分离部分中目标成分的比例等，多次试验确定的。

如图3所示，根据本发明的另一个实施例，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，包括：利用乙醇浓度为c的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[c,d]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱200min，收集获得初级第二分离部分；利用乙醇浓度为e的乙醇-水体系对所述初级第二分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[e,f]的乙醇-水体系对所述初级第二分离部分进行梯度洗脱200min，收集获得所述第二分离部分，其中，c和e的取值范围为8-14％，d和f的取值范围为20-30％，e>c，f>d。前后两次，都先利用一个浓度的乙醇-水体系等度洗脱，再进行梯度洗脱，能够提高分离提取Vicenin-2的效率；前后两次的等度洗脱和梯度洗脱的乙醇浓度或浓度范围、各自的洗脱时间、速度，是发明人结合考虑两次等度-梯度洗脱的条件、收率、时间、回收的分离部分的复杂度、分离部分中目标成分的比例等，多次试验优化确定的，利于在简单操作和短时间内，获得收率高、纯度高的Vicenin-2。在本发明的一个较佳实施例中，c＝10％，d＝30％，e＝12％，f＝20％，能够使最终获得的提取纯化产物的纯度达98％以上。

根据本发明的另一个实施例，所述第三醇体系为纯甲醇，所述第三色谱为凝胶色谱。在本发明的一个实施例中，所选凝胶色谱为葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-50。利于进一步提高目标化合物的纯度。

依据本发明的另一方面，本发明提供一种提取分离Vicenin-2的系统，该系统能够用以实施上述本发明一方面或者任一实施例中的Vicenin-2提取分离方法，该系统包括：回流提取装置，用以利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；色谱分离装置，用于利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其包括，第一色谱分离单元，与所述回流提取装置相连，用于利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，

第二色谱分离单元，与所述第一色谱分离单元相连，用于利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，第三色谱分离单元，与所述第二色谱分离单元相连，用于利用第三醇体系对所述第二分离部分进行第三色谱分离，以获得所述Vicenin-2。图4显示本发明的一个实施例中的提取分离系统1000的结构，包括回流提取装置100和色谱分离装置200，色谱分离装置包括第一色谱分离单元202、第二色谱分离单元204和第三色谱分离单元206。上述对本发明一方面的Vicenin-2提取分离方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的系统，在此不再赘述。本领域技术人员可以理解，该系统还能包括其它的装置、子装置或者功能单元来实施上述的相应的实施例。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示Vicenin-2的化学结构式；

图2显示本发明的一个实施例中的提取分离图1所示化合物的方法的步骤流程；

图3显示本发明的一个实施例中的提取分离图1所示化合物的方法的步骤流程；

图4显示本发明的一个实施例中的提取分离图1所示化合物的系统的结构示意图；

图5显示本发明的一个实施例中的提取分离图1所示化合物的方法的流程图；

图6显示本发明一个实施例中的提取纯化产物的ESI-MS质谱图；

图7显示本发明一个实施例中的提取纯化产物的H¹-NMR谱图；以及

图8显示本发明一个实施例中的提取纯化产物的C¹³-NMR谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

图5显示本发明方法的一般流程，包括以下：

1.原料：选用豆科植物广金钱草45000-50000重量份，切成5-10cm小段，饮用水清洗掉泥沙，沥干，投料。

2.乙醇提取：80％乙醇回流提取两次，第一次12倍量2h，第二次10倍量1.5h；合并两次醇提液，回收乙醇至无醇味。

3.减压浓缩：提取浓缩液加水稀释至药材重量的5倍体积；200目滤布过滤；得上柱液；将事先用95％乙醇处理过的净品树脂装柱，纯化水替换；将上柱液用泵打入柱中，吸附，控制流速0.5-1倍BV/h，吸附完毕后，静置2h；用纯化水冲洗，洗脱流速3-4BV/h，洗脱量10BV；再用60％乙醇洗脱，洗脱流速2-3BV/h，洗脱量5BV；60％洗脱液合并，打入浓缩罐，回收乙醇至无醇味，至真空干燥箱中50-70℃干燥，得广金原料药300-400重量份。

4.三级色谱分离

(1)将广金原料药300-400重量份用AB-8大孔树脂色谱分离，即色谱分离I：乙醇-水混合溶剂20：80,30:70,40:60,60:40梯度洗脱，每个梯度冲到无颜色即可，合并各流份得20％，30％，40％和60％共四个部位。

(2)色谱I得到的30％部位用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅱ：用乙醇-水，条件为10％等度30min，10-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集40-50个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅱ得到的41-50流份合并，进一步用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅲ，用乙醇-水，条件为12％等度30min，12-20％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集35-45个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份。

(3)色谱分离Ⅲ得到的第25-35流份合并，减压浓缩至有少量沉淀即可停止，进一步放置至析出淡黄色沉淀，过滤得到Vicenin-2粗品。最后用葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-50分离，即色谱分离Ⅳ：将Vicenin-2粗品加入至甲醇-水(体积比为1:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第10-22流份合并，回收溶剂得到黄色的粉末。

5.结构鉴定

经电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H¹-NMR和C¹³-NMR)对得到黄色粉末进行鉴定，结合ESI-MS、H¹-NMR和C¹³-NMR谱图信息推断该化合物的分子式为C₂₇H₃₀O₁₅，确定上述从广金钱草中分离提取的黄色粉末为Vicenin-2，经HPLC纯度检验，纯度达到98％以上，可作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。

图6为对上述黄色粉末Vicenin-2进行电喷雾电离质谱的质谱图，显示黄色粉末中各成分的分子量，主成分分子量为ESI-MS m/z:595[M+H]⁺。

图7显示上述黄色粉末Vicenin-2的H¹-NMR谱图，H¹-NMR(DMSO，400HZ)δ：13.72(5-OH),8.01(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.91(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.79(1H,s,H-3)。

图8显示上述黄色粉末Vicenin-2的C¹³-NMR谱图，C¹³-NMR(DMSO，100HZ)δ:164.1(C-2),102.5(C-3),182.2(C-4),158.7(C-5),107.6(C-6),160.7(C-7),105.3(C-8),155.1(C-9),104.1(C-10),121.6(C-1’),128.9(C-2’6’),115.9(C-3’5’),161.2(C-4’),73.4(C-1-Glc)，71.0(C-2-Glc)，77.9(C-3-Glc)，69.1(C-4-Glc)，80.9(C-5-Glc)，59.8(C-6-Glc)，74.1(C-1-Glc)，71.9(C-2-Glc)，78.9(C-3-Glc)，70.5(C-4-Glc)，81.9(C-5-Glc)，61.3(C-6-Glc)，其中Glc代表葡萄糖。

实施例2

选用豆科植物广金钱草45000-50000重量份，切成5-10cm小段，饮用水清洗掉泥沙，沥干，投料。80％乙醇回流提取两次，第一次12倍量2h，第二次10倍量1.5h；合并两次醇提液，回收乙醇至无醇味。提取浓缩液加水稀释至药材重量的5倍体积；200目滤布过滤；得上柱液；将事先用95％乙醇处理过的净品树脂装柱，纯化水替换；将上柱液用泵打入柱中，吸附，控制流速0.5-1倍BV/h，吸附完毕后，静置2h；用纯化水冲洗，洗脱流速3-4BV/h，洗脱量10BV；再用60％乙醇洗脱，洗脱流速2-3BV/h，洗脱量5BV；60％洗脱液合并，打入浓缩罐，回收乙醇至无醇味，至真空干燥箱中50-70℃干燥，得广金原料药300-400重量份；

将广金原料药300-400重量份用AB-8大孔树脂色谱分离，即色谱分离I，乙醇-水混合溶剂25:75,35:65,45:55,65:35梯度洗脱，每个梯度冲到无颜色即可，合并各流份得25％，35％，45％，65％，共四个部位；色谱I得到的35％部位用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅱ，用乙醇-水，条件为8％等度30min，8-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集40-50个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅱ得到的30-50流份合并，进一步用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅲ，用乙醇-水，条件为10％等度30min，10-20％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集35-45个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅲ得到的第20-35流份合并，回收至溶剂得到Vicenin-2粗品。最后用凝胶色谱分离，即色谱分离Ⅳ，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第12-22流份合并，回收溶剂得到黄色的粉末，利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H¹-NMR和C¹³-NMR)对得到黄色粉末进行鉴定，鉴定黄色粉末为Vicenin-2，纯度为92％。

实施例3

选用豆科植物广金钱草45000-50000重量份，切成5-10cm小段，饮用水清洗掉泥沙，沥干，投料。80％乙醇回流提取两次，第一次12倍量2h，第二次10倍量1.5h；合并两次醇提液，回收乙醇至无醇味。提取浓缩液加水稀释至药材重量的5倍体积；200目滤布过滤；得上柱液；将事先用95％乙醇处理过的净品树脂装柱，纯化水替换；将上柱液用泵打入柱中，吸附，控制流速0.5-1倍BV/h，吸附完毕后，静置2h；用纯化水冲洗，洗脱流速3-4BV/h，洗脱量10BV；再用60％乙醇洗脱，洗脱流速2-3BV/h，洗脱量5BV；60％洗脱液合并，打入浓缩罐，回收乙醇至无醇味，至真空干燥箱中50-70℃干燥，得广金原料药300-400重量份。

将广金原料药300-400重量份用AB-8大孔树脂色谱分离，即色谱分离I，乙醇-水混合溶剂20：80,30:70,40:60,60:40梯度洗脱，每个梯度冲到无颜色即可，合并各流份得20％，30％，40％，60％，共四个部位；色谱I得到的30％部位用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅱ，用乙醇-水，条件为12％等度30min，12-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集40-50个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅱ得到的36-45流份合并，进一步用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅲ，用乙醇-水，条件为14％等度30min，14-20％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集35-45个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅲ得到的第20-30流份合并，回收至溶剂得到Vicenin-2粗品。最后用凝胶色谱分离，即色谱分离Ⅳ，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第10-20流份合并，回收溶剂得到黄色的粉末，利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H¹-NMR和C¹³-NMR)对得到黄色粉末进行鉴定，鉴定黄色粉末为Vicenin-2，纯度为90％。

实施例2和3的工艺条件生产出的黄色粉末Vicenin-2，纯度显著低于实施例1分离提取的Vicenin-2。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种提取分离Vicenin-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；

利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其中包括，

利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，

利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，

利用第三醇体系对所述第二分离部分进行第三色谱分离，以获得所述Vicenin-2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物，包括：

利用浓度50-95％的乙醇对所述广金钱草进行两次回流提取，合并两次回流提取所得的提取液，获得合并提取液，

除去所述合并提取液中的乙醇，和/或除去所述合并提取液中的乙醇和离子，以及任选的，进行干燥，以获得所述提取物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述两次回流提取，其中

一次的乙醇和广金钱草的重量比为12:1，回流提取的时间为1.5h-3h，任选的为2h，

另一次的乙醇和广金钱草的重量比为10:1，回流提取的时间为1h-2h，任选的为1.5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一醇体系为乙醇-水体系，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30-35％，

优选的，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30％，

所述第一色谱为大孔树脂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二醇体系为乙醇-水体系，

所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为8-30％，

所述第二色谱为反向色谱。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反向色谱为反向中压色谱，

任选的，所述反向中压色谱为C18柱，其柱压为1-10bar，洗脱流速为5～30ml/min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，包括：

利用乙醇浓度为a的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱25-40min，接着换用乙醇浓度为[a,b]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱180-220min，收集以获得所述第二分离部分，其中，

a的取值范围为8-14％，b的取值范围为20-30％。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，包括：

利用乙醇浓度为c的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[c,d]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱200min，收集获得初级第二分离部分，

利用乙醇浓度为e的乙醇-水体系对所述初级第二分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[e,f]的乙醇-水体系对所述初级第二分离部分进行梯度洗脱200min，收集获得所述第二分离部分，其中，

c和e的取值范围为8-14％，d和f的取值范围为20-30％，e>c，f>d。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三醇体系为纯甲醇，所述第三色谱为凝胶色谱。

10.一种提取分离Vicenin-2的系统，其特征在于，包括：

回流提取装置，用以利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；

色谱分离装置，用于利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其包括，

第一色谱分离单元，与所述回流提取装置相连，用于利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，

第二色谱分离单元，与所述第一色谱分离单元相连，用于利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，获得第二分离部分，

第三色谱分离单元，与所述第二色谱分离单元相连，用于利用第三醇体系对所述第二分离部分进行第三色谱分离，以获得所述Vicenin-2。