CN105017273A

CN105017273A - 一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法

Info

Publication number: CN105017273A
Application number: CN201510447577.1A
Authority: CN
Inventors: 杨方秀; 孙世安; 汤道权; 陆益红; 栗政; 董露露
Original assignee: Xuzhou Medical College
Current assignee: Xuzhou Medical College
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明公开了一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法，涉及补骨脂素和异补骨脂素提取技术领域。该方法首先用有机溶剂加热回流将香豆素类成分提取出来；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析；然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到2种化合物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定。优点：高效、快速、简便的从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素。

Description

一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法

技术领域

本发明涉及补骨脂素和异补骨脂素提取技术领域，具体是涉及一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法。

背景技术

补骨脂为豆科植物Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有补肾壮阳、扶正固本、纳气止泻及妇科止血等功效，主治肾虚冷泻、小便频数、阳萎遗精、腰膝冷痛、虚寒咳喘及五更泄泻等症。药理研究表明，补骨脂有扩张血管、增强心肌收缩力、提高机体非特异性免疫功能，在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老等方面具有独到之处，还可以用于皮肤癌、银屑病、白癜风、斑秃和骨质疏松等症的治疗。补骨脂主要含有香豆素、黄酮等成分，补骨脂素和异补骨脂素是香豆素类成分的代表，二者也是补骨脂及其相关制剂质量控制的主要指标。据文献报道，分离纯化补骨脂香豆素的方法主要有反复硅胶柱层析法及高速逆流色谱法，硅胶柱层析法的操作过程繁琐，回收率较低，经常使用氯仿、苯等毒性较强的有机溶剂；在高速逆流色谱法中溶剂系统的选择比较困难，缺乏理论指导。因此，建立一种高效快速的提取、分离纯化补骨脂香豆素的方法对于深化补骨脂的药理作用研究及完善质量控制体系均具有重要的意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明提供一种一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法，高效、快速、简便的从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素。

本发明是以如下技术方案实现的：一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,具体步骤如下：

(1)补骨脂香豆素的提取：将补骨脂药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物；有机溶剂的用量为补骨脂药材的6-12倍；

(2)补骨脂香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤(1)中的粗提物的组成进行分离分析，流动相为甲醇-水，流速为1.0mL/min；

(3)补骨脂香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇与水，流速为20-30mL/min，然后根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；

(4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用分析型高效液相色谱法进行检测，分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98％以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是补骨脂素和异补骨脂素。

其进一步是：步骤(2)中的分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用参数为250×4.6mm I.D.,5μm的C18柱，检测波长为254nm，柱温为室温。

步骤(3)中的半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用参数为250×4.6mm I.D.,10μm的C18柱，检测波长为254nm，柱温为室温。

步骤(1)中有机溶剂为甲醇或乙醇或石油醚或乙酸乙酯；提取方法为冷浸或超声或加热回流，提取次数为2-5次，提取时间为1-3小时。

更进一步是：步骤(1)中有机溶剂为乙醇，提取方法为加热回流。

乙醇的浓度为50％～95％。

乙醇的浓度为70％。

有机溶剂的用量为补骨脂药材的8倍，提取次数为3次，提取时间为1.5小时。

步骤(2)分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有42％甲醇-水等度洗脱或45％甲醇-水等度洗脱或48％甲醇-水等度洗脱。

步骤(3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或47％甲醇-水等度洗脱或50％甲醇-水等度洗脱或53％甲醇-水等度洗脱。

本发明的有益效果是：高效、快速、简便的从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素，工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

附图说明

图1是补骨脂粗提物的分析型高效液相色谱图。

图2是补骨脂粗提物的半制备型高效液相色谱图。

图3是补骨脂素的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图4是异补骨脂素的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图中：I：补骨脂素；II：异补骨脂素。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自天津市化学试剂三厂，所用水为去离子水。

实施例：

一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法，其步骤为：

(1)补骨脂香豆素的提取：将补骨脂药材粉碎，用8倍量70％乙醇-水溶液加热提取3次，每次1.5h，过滤，将提取液合并，减压浓缩得粗提物。

(2)补骨脂香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C₁₈柱(250×4.6mm I.D.,5μm)，流动相为甲醇-水(45：55，V/V)；流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为室温。

(3)补骨脂香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C₁₈柱(250×25.4mm I.D.,10μm)，流动相为甲醇-水(50：50，V/V)，流速为25.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。

(4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98％以上。经核磁共振波谱分析2种化合物分别是补骨脂素和异补骨脂素。

发明人通过使用不同浓度的甲醇-水溶液作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30mL/min(优选25mL/min)，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一补骨脂粗提物的半制备型高效液相色谱分离条件

	洗脱条件
		实施例1	53％甲醇-水等度洗脱
实施例2	50％甲醇-水等度洗脱
		实施例3	47％甲醇-水等度洗脱
实施例4	甲醇-水梯度洗脱

在实施例1中，洗脱液中甲醇的浓度较高，洗脱时间较短，补骨脂素和异补骨脂素之间分离效果不够理想，所得化合物的纯度较低。实施例2中，洗脱液中甲醇的浓度适中，两组分之间分离效果良好，分离时间也较为适宜。实施例3中，洗脱液中甲醇的浓度较低，两组分之间分离效果良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。

图2是当选用实施例2体系时补骨脂粗提物的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离效果良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱峰面积归一化法分析测试，纯度高于98％，这一点可从图3至图4中看出。

经核磁共振波谱分析证实分离纯化得到的2个化合物的化学结构式如下：

2个化合物的鉴定结果如下：

补骨脂素：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δppm:7.8(1H,d,J＝10.0Hz,4-H),7.7(1H,d,J＝2.4Hz,12-H),7.6(1H,s,5-H),7.5(1H,s,8-H),6.8(1H,d,J＝2.4Hz,11-H),6.4(1H,d,J＝10.0Hz,3-H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):δppm:161.1(C-2),156.4(C-7),152.0(C-9),147.0(C-12),144.1(C-4),124.9(C-6),119.8(C-5),115.4(C-10),114.6(C-3),106.4(C-11),99.9(C-8).

异补骨脂素：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δppm:7.8(1H,d,J＝9.6Hz,4-H),7.7(1H,d,J＝2.4Hz,12-H),7.5(1H,d,J＝8.8Hz,6-H),7.4(1H,d,J＝8.8Hz,5-H),7.2(1H,d,J＝2.4Hz,11-H),6.4(1H,d,J＝9.6Hz,3-H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):δppm:160.7(C-2),157.3(C-7),148.9(C-9),145.9(C-12),144.6(C-4),141.3(C-3),123.8(C-5),117.0(C-8),114.1(C-10),108.8(C-6),104.1(C-11).

由实施例可以看出，本发明从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素，首先用70％乙醇-水溶液加热回流将香豆素类成分提取出来；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析；然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到2种化合物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的结构进行鉴定。该方法所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图3至图4中看出。除此之外，还具有如下优势：

(1)补骨脂中含有大量的油脂和糖类成分，在提取过程中易发生皂化反应，易形成胶状物，难以过滤。用乙醇-水溶液加热回流提取补骨脂中的香豆素类成分可以使香豆素最大程度溶出，而极性较大的糖类成分和极性较小的油脂尽量不被溶出。不仅提高了提取效率，而且可以使粗提物尽可能纯净，最大限度降低了制备型C₁₈柱被污染的程度。

(2)用高效液相色谱法对补骨脂粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动相等度洗脱可以在短时间内对2种目标化合物实现基线分离。

(3)用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到2种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。

(4)用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速。

(5)提取、分离、纯化过程中仅用到乙醇、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的氯仿、苯等有机溶剂，乙醇-水提取液及甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后均可以重复使用多次，绿色环保。

(6)优化了层析方法的条件(洗脱液的组成和流速)，使化合物的纯度和纯化效率都大为提高。

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本发明所要保护的范围。

Claims

1.一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：步骤(2)中的分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用参数为250×4.6mm I.D.,5μm的C18柱，检测波长为254nm，柱温为室温。

3.根据权利要求1所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：步骤(3)中的半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用参数为250×4.6mm I.D.,10μm的C18柱，检测波长为254nm，柱温为室温。

4.根据权利要求1所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：步骤(1)中有机溶剂为甲醇或乙醇或石油醚或乙酸乙酯；提取方法为冷浸或超声或加热回流，提取次数为2-5次，提取时间为1-3小时。

5.根据权利要求4所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：步骤(1)中有机溶剂为乙醇，提取方法为加热回流。

6.根据权利要求4所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：乙醇的浓度为50％～95％。

7.根据权利要求6所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：乙醇的浓度为70％。

8.根据权利要求4所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：有机溶剂的用量为补骨脂药材的8倍，提取次数为3次，提取时间为1.5小时。

9.根据权利要求1所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：步骤(2)分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有42％甲醇-水等度洗脱或45％甲醇-水等度洗脱或48％甲醇-水等度洗脱。

10.根据权利要求1所述的一种从补骨脂中提取、分离纯化补骨脂素和异补骨脂素的方法,其特征在于：步骤(3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或47％甲醇-水等度洗脱或50％甲醇-水等度洗脱或53％甲醇-水等度洗脱。