CN103342689B - 从瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法 - Google Patents
从瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及从瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法，是以瓜蒌皮为原料，经过下述步骤：（1）瓜蒌皮粗提物的制备；（3）聚酰胺柱粗分离；（4）半制备型高效液相色谱分离纯化。该工艺过程绿色环保，对环境无严重危害,综合成本低。
Description
技术领域
本发明属于化工领域，具体是涉及一种从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法。
背景技术
瓜蒌皮为葫芦科栝楼属植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Marim.）或双边栝楼（Trichosanthes rosthornii Harms.）的干燥成熟果皮，属于常用中药，具有润肺化痰、利气宽胸等功效，临床上广泛用于治疗痰热咳嗽、痰浊黄稠、咽痛、胸痛、吐血、衄血、便秘、痈疮肿毒等症。现代药理实验及临床实践表明瓜蒌皮具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、提高心肌耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抗菌、抗癌等多种药理作用，尤其是对心血管疾病具有很好的治疗作用。
现已有文献报道从瓜蒌皮中提取纯化黄酮类成分的方法。刘岱琳[瓜蒌的抗血小板凝集活性成分研究，中草药，2004年12期]对瓜蒌皮的正丁醇部位的化学成分进行了分离，先用Sephadex LH-20柱色谱分离，再用反复硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇为洗脱剂，最终得到7种成分，其中包括1种黄酮类物质—香叶木素-7-O-β-葡萄糖苷。范雪梅[瓜蒌化学成分的分离与鉴定，沈阳药科大学学报，2011年12期]对瓜蒌皮的正丁醇部位的化学成分进行了分离，先后利用了硅胶、反相中低压、凝胶Sephadex LH-20柱色谱以及制备型高效液相色谱等分离手段，最终得到4种成分，其中包括1种黄酮类物质—柯伊利素-7-O-β-葡萄糖苷。
上述方法主要是对瓜蒌皮的正丁醇部位的化学成分进行系统的分离，得到的黄酮类物质的种类少，分离过程步骤较为繁琐，有时需要使用氯仿为萃取剂或洗脱剂，对人体和环境均有严重危害，而且生产周期较长，生产成本较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、绿色环保、综合成本低、生产周期短的快速从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法。
本发明的方案如下：
从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法,步骤为：
（1）瓜蒌皮粗提物的制备：取粉碎好的瓜蒌皮药材，用乙醇-水溶液加热回流提取，提取液经减压回收至无醇后得到瓜蒌皮粗提物；
（2）萃取：将瓜蒌皮粗提物分散于水中，先后用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位；
（3）聚酰胺柱粗分离：将瓜蒌皮乙酸乙酯部位分散于水中，上聚酰胺柱进行层析，先用水进行洗脱，再用浓度为50%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为80%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，收集80%左右的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，得瓜蒌皮总黄酮苷元；
（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将瓜蒌皮总黄酮苷元用半制备型高效液相色谱进行分离纯化,色谱柱为YMC ODS-AQ柱（250 mm×10 mm I. D., 10 μm，大连江申分离科技有限公司），流动相为甲醇-水，检测波长为350 nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为1-3小时（优选为1.5-2.5小时，更加优选提取时间为2小时）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取次数为2-6次（优选提取次数为3-5次，更加优选4次）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为50%-95%（优选60%-80%，更优选70%）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）洗脱液为60%-95%的乙醇-水洗脱液（优选70%-90%，更优选80%）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）用甲醇-水洗脱液进行洗脱时，洗脱方式有70%甲醇-水等度洗脱、65%甲醇-水等度洗脱、60%甲醇-水等度洗脱或甲醇-水梯度洗脱。优选的是，控制甲醇-水洗脱液的流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min）。
本发明从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法，首先采用聚酰胺柱粗分离，再用半制备型高效液相色谱法进行分离纯化，所得目标化合物纯度高，杂质含量极低。除此之外，还具有如下优势：
（1）提取物经过聚酰胺柱粗分离后可以除去大部分的杂质，使混合物的组成得到简化，可以为后续的分离工作降低难度，并且可以保护半制备型高效液相色谱柱不被污染，有效地延长了色谱柱的使用寿命。
（2）使用半制备型高效液相色谱法一次分离纯化就可以同时得到木犀草素、芹菜素和香叶木素3种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。
（3）纯化过程中不使用对环境和人体危害大的氯仿等有机溶剂，聚酰胺经再生后可以重复使用多次，绿色环保。
（3）优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和效率都大为提高。
附图说明
图1是瓜蒌皮总黄酮苷元的高效液相色谱图。
图2是瓜蒌皮总黄酮苷元的半制备型高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。
实施例：从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法,其步骤为：
（1）瓜蒌皮粗提物的制备：瓜蒌皮药材经粉碎后，以70%乙醇为溶剂加热回流提取4次，提取时间为2小时，合并提取液，减压浓缩得粗提物。
（2）萃取：将瓜蒌皮粗提物分散于水中,先后用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取, 石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位。
（3）聚酰胺柱粗分离：将瓜蒌皮乙酸乙酯部位分散于水中，上聚酰胺柱进行层析，先用水进行洗脱,再用浓度为50%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为80%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，收集80%左右的乙醇-水洗脱液，减压浓缩得瓜蒌皮总黄酮苷元。
（4）半制备型高效液相色谱分离纯化：将瓜蒌皮总黄酮苷元用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱（250 mm×10 mm I. D., 10 μm，大连江申分离科技有限公司），流动相为甲醇-水，流出液由紫外检测器在350 nm检测，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。
发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为3.5 mL/min，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：
表一 半制备型高效液相色谱洗脱条件
| 洗脱液条件 | |
| 实施例1 | 70%甲醇-水等度洗脱 |
| 实施例2 | 65%甲醇-水等度洗脱 |
| 实施例3 | 60%甲醇-水等度洗脱 |
| 实施例4 | 甲醇-水梯度洗脱 |
在实施例1中，采用70%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例2中采用65%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中采用60%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，各成分分离良好，分离时间也可以，但洗脱液由于浓度变化导致回收再利用存在较大困难。
图2是当选用实施例2体系时的色谱图，由图2可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，实施例2所得到的各个组分的纯度很高，均在98%以上。根据核磁共振氢谱和碳谱的测试，对所得峰组分进行鉴定，得到了木犀草素、芹菜素和香叶木素。
经现代波谱数据证实所提取纯化得到的木犀草素、芹菜素和香叶木素的化学结构式如下：
3种化合物的鉴定结果如下：
化合物I（木犀草素）：1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12.99 (1H, s, 5-OH), 9.5-11.0 (2H, br s, 3’ -OH, 4’-OH), 7.41 (2H, m, 6’-H, 2’-H), 6.89 (1H, d, J=8.0 Hz, 5’-H), 6.67 (1H, s, 3-H), 6.44 (1H, s, 8-H), 6.18 (1H, s, 6-H)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 181.5 (4-C), 164.4 (7-C), 163.8 (2-C), 161.4 (9-C), 157.2 (5-C), 149.8 (4’-C), 145.7 (3’-C), 121.2 (6’-C), 118.8 (1’-C), 115.9 (5’-C), 113.2 (2’-C), 103.5 (10-C), 102.7 (3-C), 98.8 (6-C), 93.8 (8-C)。
化合物II（芹菜素）：1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12.97 (1H, s, 5-OH), 10.2-11.2 (2H, br s, 7, 4’-OH), 7.93 (2H, d, J=8.8 Hz, 2’-H, 6’-H), 6.93 (2H, d, J=8.8 Hz, 3’-H, 5’-H), 6.79 (1H, s, H-3), 6.47 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.18 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 181.7 (4-C), 163.9 (7-C), 162.4 (2-C), 161.5 (9-C), 161.2 (4’-C), 157.3 (5-C), 128.4 (6’-C), 128.5 (2’-C), 121.1 (1’-C), 116.1 (3’-C), 116.0 (5’-C), 103.6 (10-C), 102.8 (3-C), 98.9 (6-C), 94.0 (8-C)。
化合物III（香叶木素）：1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δppm: 12.98 (1H, s, 5-OH), 10.80 (1H, br s, 7-OH), 10.00 (1H, br s, 3’-OH), 7.57 (2H, m, 6’-H, 2’-H), 6.94 (1H, d, J=8.8 Hz, 5’-H), 6.92 (1H, s, 3-H), 6.51 (1H, d, J=1.6 Hz, 8-H), 6.20 (1H, d, J=2.0 Hz, 6-H), 3.89 (3H, s, 4’-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ ppm: 181.6 (4-C), 164.0 (7-C), 163.6 (2-C), 161.3 (9-C), 157.2 (5-C), 150.7 (4’-C), 147.9 (3’-C), 121.4 (6’-C), 120.3 (1’-C), 115.7 (2’-C), 110.2 (5’-C), 103.6 (10-C), 103.1 (3-C), 98.7 (6-C), 93.9 (8-C), 55.9 (4’-OCH3)。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
Claims (8)
1.从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、芹菜素和香叶木素的方法，其特征是，步骤为：
(1)瓜蒌皮粗提物的制备：取粉碎好的瓜蒌皮药材，用乙醇-水溶液加热回流提取，加热回流提取时间为1-3小时，提取次数为2-6次，提取液经减压回收至无醇后得到瓜蒌皮粗提物，加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为50％-95％；
(2)萃取：将瓜蒌皮粗提物分散于水中，先后用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩，得石油醚部位和乙酸乙酯部位；
(3)聚酰胺柱粗分离：将瓜蒌皮乙酸乙酯部位分散于水中，上聚酰胺柱进行层析，先用水进行洗脱，再用浓度为50％的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为80％的乙醇-水溶液进行洗脱，收集80％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，得瓜蒌皮总黄酮苷元；
(4)半制备型高效液相色谱分离纯化：将瓜蒌皮总黄酮苷元用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱，流动相为甲醇-水，检测波长为350nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物；洗脱方式有70％甲醇-水等度洗脱、65％甲醇-水等度洗脱、60％甲醇-水等度洗脱或甲醇-水梯度洗脱，控制甲醇-水洗脱液的流速为2.5-4.5mL/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)加热回流提取时提取时间为1.5-2.5小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)加热回流提取时提取时间为2小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)提取次数为3-5次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，步骤(1)提取次数为4次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为60％-80％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为70％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，控制甲醇-水洗脱液的流速为3.5mL/min。
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