CN104650164A - 一种制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法 - Google Patents

一种制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法 Download PDF

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    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Abstract

一种制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，先从辣椒叶中提取辣椒叶粗多酚，然后采用高速逆流色谱分离，或将辣椒叶粗多酚经大孔树脂富集总多酚后分离，分离溶剂系统由酯类、醇类、水组成。根据检测器谱图接收目标成份，得到化合物A:木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和化合物B:芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷两种黄酮苷。这两个化合物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗虫等生物活性，可开发为天然药物和生物农药。本发明工艺流程简单、成本低、产品纯度高，产率高、环境友好，能工业化生产含量大于95％的黄酮苷单体。

Description

一种制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法
技术领域
本发明属天然产物提取、分离纯化领域，具体地说是涉及一种利用高速逆流色谱从辣椒叶粗多酚或富集后的辣椒叶总多酚中分离纯化木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷单体的方法。
背景技术
辣椒为一年生草本植物，其成熟植株叶与果实的产量相当，但目前国内外在采收辣椒果实后，根、茎和叶通常被当作农业垃圾废弃，并没有被有效利用，对资源造成了极大的浪费。研究表明辣椒叶中黄酮类和多酚类化合物含量丰富，具有抗氧化、降血糖、抗菌、抗炎、抗虫等活性。
黄酮类化合物以其广泛的药理活性和生物活性倍受关注，植物中黄酮类化合物母核主要有山奈酚、木犀草素、槲皮素、芹菜素、杨梅素、芦丁等，它们与糖基结合形成的黄酮苷亦广泛存在。植物中的黄酮类化合物拥有很多有益人类健康的生物活性，包括抗氧化、抗过敏、抗炎免疫、抗菌和抗病毒、抗肿瘤、降血压和降血糖、保护心血管、调节脂质代谢、提高免疫能力等多种药理和生物活性。
中国专利申请201210136560.0从辣椒叶中提取的黄酮苷具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，但其含量极低，不足0.2‰，辣椒叶中大部分活性成分没有得到利用。迄今，现有技术中未见有应用高速逆流色谱对辣椒茎叶多酚进行提取和纯化的方法的报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一种快速制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法。该方法先从辣椒叶中提取辣椒叶多酚，然后采用高速逆流色谱分离，也可经大孔树脂富集获得辣椒叶总多酚后用高速逆流色谱分离，获得木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷单体，纯度均在95％以上，且获得的这两种黄酮苷具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗虫等生物活性。该方法工艺简单，效率高，单体纯度高，成本低，环境友好，适合于工业化生产活性木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷单体。该两种黄酮苷单体具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗虫等生物活性，可以开成天然药物和生物农药。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，该方法包括如下步骤：
(1)从辣椒叶中提取辣椒叶粗多酚；
(2)辣椒叶粗多酚用大孔树脂富集，得辣椒叶总多酚；
(3)采用高速逆流色谱对步骤(1)所得辣椒叶粗多酚或步骤(2)所得辣椒叶总多酚进行分离，所述高速逆流色谱分离溶剂系统由酯类、醇类、水组成，其中酯类、醇类、水用量体积比为1～5∶1～5∶1～5，将上述溶剂系统配置于分液漏斗中充分振摇后静置，分层，取上相为固定相，下相作为流动相，在体系温度5～60℃时使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份，得到纯度95％以上的木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述的从辣椒叶中提取辣椒叶粗多酚的方法是采用30％～85％酒精从辣椒叶中提取，提取方法用温浸法、加热回流法、超声波提取法或微波辅助提取法。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述的采用高速逆流色谱进行分离的辣椒叶多酚是用酒精从辣椒叶中提取的辣椒叶粗多酚，或用大孔树脂富集后的辣椒叶总多酚。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述高速逆流色谱分离溶剂系统中的酯类为乙酸乙酯。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述高速逆流色谱分离溶剂系统中的醇类为正丁醇。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述高速逆流色谱分离溶剂系统由乙酸乙酯-正丁醇-水组成，其体积比为4∶1∶5。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述逆流色谱仪为分析型逆流色谱仪或半制备型逆流色谱仪或制备型逆流色谱仪。
根据所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其中所述逆流色谱仪流速为4.0mL/min～20.0mL/min。
与现有技术相比，本发明的优越性在于：
1.本发明的原料来源于废弃的辣椒叶，资源丰富，成本低，附加值高。
2.本发明提供了木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷的制备方法，为化合物活性深入研究奠定基础。
3.本发明采用HSCCC方法分离，不需使用固体填料，没有不可逆吸附，样品无损失、无污染，能高效、快速、低成本和大量制备木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷，获得的单体纯度达95％以上，且活性好。
附图说明
图1为辣椒叶粗多酚HSCCC色谱图，图中HSCCC条件：溶剂系统，乙酸乙酯-正丁醇-水(3：2：5)；柱体积300ML；柱温35℃；转速890rpm；流速5.0mL/min；检测波长254nm；进样量150mg；固定相保留率62.5％。
图2为木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷及辣椒叶多酚HPLC分析图，图中HPLC条件：色谱柱：ZORBAX XDB-C18柱(4.6×150mm，5.0μm)；紫外检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈—水(H3PO4调PH＝3)(0-30min ACN 10％→50％)。
图3为为辣椒叶总多酚HSCCC色谱图，图中HSCCC条件：溶剂系统，乙酸乙酯-正丁醇-水(4：1：5)；柱体积300ML；柱温35℃；转速890rpm；流速7.0mL/min；检测波长254nm；进样量500mg；固定相保留率62.5％。
图4为化合物木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷结构式图；化合物A结构为R1＝OH，名称：木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷；化合物B结构为R1＝H，名称：芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
(1)称取干燥辣椒叶500g于圆底烧瓶中，加入5L75％乙醇，80℃回流提取2h，过滤，再向滤渣中加入5L75％乙醇，80℃回流提取2h，过滤，合并滤液，减压浓缩除酒精，干燥得58.43g辣椒叶粗多酚。
(2)采用上海同田TBE-300C半制备型高速逆流色谱系统进行分离，柱的容积为300mL，溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水3:2:5，柱温：35℃。木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷的制备分两步进行:①将体积比为3:2:5的乙酸乙酯-正丁醇-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为890rpm，以5.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，建立整个体系的动态平衡②用1:1的上相和下相混合液4mL溶解取得的辣椒叶粗多酚150mg由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分。分离色谱图见图1，分别收集峰A、峰B。将峰A、峰B流分减压干燥，得到峰A48.3mg，峰B52.7mg。经HPLC分析，峰A纯度为98.27％，峰B纯度为98.62％，HPLC分析图见图2。
实施例2
峰A、峰B化合物结构鉴定：
将化合物A、B用20％甲醇水溶液溶解后，测定MS，化合物A的分子离子峰(m/z＝581.15[M+H]+)；化合物B的分子离子峰(m/z＝565.15[M+H]+)。将化合物A、B用氘代试剂DMSO溶解后测定1H-NMR、13C-NMR，数据见表1，经与文献比对数据后确定化合物A为木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷，化合物B为芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷，结构式见图4。
表1化合物A、B的NMR数据(TMS，DMSO，δin ppm，J in Hz)
实施例3
(1)称取干燥辣椒叶2kg于圆底烧瓶中，加入30L50％乙醇，25℃浸泡24h，过滤，再向滤渣中加入30L50％乙醇，25℃浸泡24h，过滤，合并滤液，减压浓缩除酒精。
(2)向浓缩液中加水2L，过滤，大孔树脂富集，分别用水、30％乙醇、70％乙醇、95％乙醇洗脱。收集70％乙醇洗脱流分，减压浓缩，干燥，得到辣椒叶总多酚0.98g。(3)采用上海同田TBE-300C半制备型高速逆流色谱系统进行分离，柱的容积为300mL，溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水4:1:5，柱温：35℃。木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷的制备分两步进行：①将体积比为4:1:5的乙酸乙酯-正丁醇-水混溶于分液漏斗中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为890rpm，以7.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，建立整个体系的动态平衡②用1:1的上相和下相混合液4mL溶解取得的辣椒叶总多酚500mg由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分。分离色谱图见图3，分别收集峰A、峰B。将峰A、峰B流分减压干燥，得到峰A48.3mg，峰B52.7mg。经HPLC分析，峰A纯度为98.27％，峰B纯度为98.62％。
本发明结合应用高速逆流色谱对辣椒茎叶多酚进行提取和纯化，提取率高，高效节能，条件温和，产物活性保持好。本发明的方法所得辣椒多酚抗菌活性和体外抗癌活性良好，具有较广泛的应用前景。

Claims (8)

1.一种制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是该方法包括如下步骤：
(1)从辣椒叶中提取辣椒叶粗多酚；
(2)辣椒叶粗多酚用大孔树脂富集，得辣椒叶总多酚；
(3)采用高速逆流色谱对步骤(1)所得辣椒叶粗多酚或步骤(2)所得辣椒叶总多酚进行分离，所述高速逆流色谱分离溶剂系统由酯类、醇类、水组成，其中酯类、醇类、水用量体积比为1～5∶1～5∶1～5，将上述溶剂系统配置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，取上相为固定相，下相作为流动相，在体系温度5～60℃时使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份，得到纯度95％以上的木犀草素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-芹糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述从辣椒叶中提取辣椒叶粗多酚是采用30％～85％酒精从辣椒叶中提取，提取方法用温浸法、加热回流法、超声波辅助提取法或微波辅助提取法。
3.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述采用高速逆流色谱进行分离的辣椒叶多酚是用酒精从辣椒叶中提取的辣椒叶粗多酚，或用大孔树脂富集后的辣椒叶总多酚。
4.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述高速逆流色谱分离溶剂系统中的酯类为乙酸乙酯。
5.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述高速逆流色谱分离溶剂系统中的醇类为正丁醇。
6.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述高速逆流色谱分离溶剂系统由乙酸乙酯-正丁醇-水组成，其体积比为4∶1∶5。
7.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述逆流色谱仪为分析型逆流色谱仪或半制备型逆流色谱仪或制备型逆流色谱仪。
8.根据权利要求1所述的制备辣椒叶活性黄酮苷单体的方法，其特征是所述逆流色谱仪流速为4.0mL/min～20.0mL/min。
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