CN105330710B - 一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，该方法用乙醇水溶液提取得到女贞子总浸膏，用大孔树脂柱进行层析分离得到女贞子总苷，女贞子总苷用反相高效制备液相色谱纯化分离，得到纯度均大于98％的三种环烯醚萜苷类化学对照品特女贞苷、女贞苷Gl3和油女贞苷。本发明经过简单处理即可以同时得到三种、纯度高达98％的环烯醚萜苷类化学对照品，解决了现有技术中只能得到一种化合物、步骤繁琐且纯度不够的问题。

Description

一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的 方法

技术领域

本发明涉及一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品

的方法。

背景技术

女贞子为木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果实，是扶正固本的常用中药，具有滋补肝肾、明目乌发的功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等。研究表明女贞子可以促进成骨细胞分化和抗雌激素缺乏导致的骨质疏松，调节体内钙离子的平衡，具有抗骨质疏松的作用。

女贞子中的化学成分主要含有三萜类、环烯醚萜苷类、苯乙醇类、苯丙素类、黄酮类等。其中水溶性活性成分环烯醚萜苷类化合物是女贞子中的主要药效成分之一，药理活性丰富，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝利胆、降血糖等广泛的药理作用，尤其是治疗骨质疏松方面引起了极大的研究兴趣，具有广泛的开发应用前景。环烯醚萜苷类化合物包括特女贞苷 (specnuezhenide)、女贞苷Gl3(nuezhenoside G13)和油女贞苷(oleonuezhenide)。

目前，报道了很多从女贞子中提取单一环烯醚萜苷的方法，尤其是特女贞苷。CN102260307A公开了一种特女贞苷的制备方法，该方法先用80％乙醇提取，乙酸乙酯萃取，正丁醇萃取，正丁醇提取液经大孔树脂梯度洗脱，再经凝胶柱纯化之后重结晶得到特女贞苷。CN102372754A公开了一种特女贞苷粗品和纯品的制备方法，该方法将药材用水煎煮后经大孔树脂纯化，醇沉，再通过正相硅胶柱纯化之后得到特女贞苷的粗品，最后经过反相硅胶柱纯化可得特女贞苷纯品。CN101704857A公开了一种反相硅胶柱制备特女贞苷的方法，主要步骤为乙醇提取，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，将正丁醇部位通过大孔树脂分离，最后经反相硅胶柱纯化可得特女贞苷。

此外，还有一些制备女贞子总苷的报道。CN103301205A公开了一种将药材的乙醇提取物经大孔树脂柱分离洗脱后浓缩得到女贞子精制总苷的方法。CN101810652A一种从女贞子中提取裂环环烯醚萜类女贞总苷的方法，通过使用石灰水提取，微滤膜纯化，大孔树脂富集和结晶，得到产品。 CN101955504A公开了一种高速逆流色谱法制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法，该方法将药材水提物经大孔树脂和高速逆流色谱纯化之后得到女贞苷和女贞苦苷，醇提取经高速逆流色谱纯化之后得到齐墩果酸。

现有的这些方法存在以下缺点：1)仅能制备单一环烯醚萜苷，对药材的利用率太低；2)多采用了大量的有毒有机溶剂来萃取、正相硅胶柱纯化或重结晶等，不利于规模化生产，制备通量小；3)制备多成分的提取物时，步骤繁琐，耗时较长，且纯度不能保证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：

1)提取女贞子总浸膏

将女贞子药材粉碎过筛，在体积浓度为40-60％的乙醇水溶液中加热回流提取，过滤，减压浓缩干燥，得到女贞子总浸膏；

2)大孔树脂柱层析分离

将步骤1)得到的女贞子总浸膏进行大孔树脂柱层析分离，以体积浓度为 50-60％的乙醇水溶液作为洗脱剂，洗脱液浓缩干燥，得到女贞子总苷；

3)反相高效制备液相色谱纯化

将步骤2)得到的女贞子总苷用甲醇水溶液溶解，微孔滤膜过滤，得到供试品；

将供试品用反相高效制备液相色谱纯化分离，色谱柱的填充填料为C18，柱长20-22cm、直径5-7.5cm，以体积浓度为45-55％的甲醇水溶液为流动相，甲醇水溶液的pH用甲酸调节为3，进样体积为1-5mL，流速为80-180mL/min，紫外检测器254nm监测，分别收集三个主要色谱峰的流份，将三个流份分别浓缩干燥，得到纯度均大于98％的三种环烯醚萜苷类化学对照品特女贞苷、女贞苷Gl3和油女贞苷。

特女贞苷、女贞苷Gl3和油女贞苷的结构式如下：

进一步地，步骤1)中，药材粉碎过筛时，选择筛子的目数为30-50目。

使用乙醇水溶液提取时，提取时间和提取次数不限，一般提取1-3次，每次提取1-3小时。

进一步地，步骤1)中，女贞子药材与乙醇水溶液的用量比为1g：30mL。

进一步地，步骤2)的具体方法为：将步骤1)得到的女贞子总浸膏用水分散，经HPD-100、Diaion或D101树脂柱层析分离，先用水作为洗脱剂，洗脱1-2个柱体积，之后以体积浓度为50-60％的乙醇水溶液作为洗脱剂，洗脱 3-5个柱体积，将洗脱液浓缩干燥得女贞子总苷。

进一步地，步骤2)中，女贞子总浸膏与分散用水的用量比为1g： 0.9-1.15mL。

进一步地，步骤3)中，将步骤2)得到的女贞子总苷用体积浓度为40-60％的甲醇水溶液溶解。

进一步地，步骤3)中，微孔滤膜为0.45μm微孔滤膜。

进一步地，步骤3)中，将步骤2)得到的女贞子总苷用甲醇水溶液溶解后，女贞子总苷在甲醇水溶液中的浓度为50-200mg/mL。

本发明的有益效果如下：

1、本发明经过简单的步骤处理即可同时得到三种、纯度高达98％的环烯醚萜苷类化学对照品，解决了现有技术中只能得到一种化合物、步骤繁琐或纯度不够的问题。

2、本发明仅使用乙醇和甲醇来进行萃取和分离，与现有技术中使用大量、多成分有机溶剂相比，安全性更高，且原料更简单易得。

3、本发明的制备规模能达到克级，且反相高效制备液相色谱纯化为快速型制备方法，一次进样分离时间在20分钟，十分高效，适合大批量化学对照品的提取，易实现规模化生产。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1-a为实施例1得到的女贞子总苷的HPLC分析图谱(含1％甲酸的50％甲醇水溶液，254nm)。

图1-b为实施例1的制备高效液相的制备色谱图(254nm)。

图1-c为实施例2的制备高效液相的制备色谱图(254nm)。

图2-a、2-b、2-c分别为实施例1得到的特女贞苷的HPLC分析图谱(254nm)、¹H NMR图谱、¹³C NMR图谱。

图3-a、3-b、3-c分别为实施例1得到的女贞苷Gl3的HPLC分析图谱 (254nm)、¹HNMR图谱、¹³C NMR图谱。

图4-a、4-b、4-c分别为实施例1得到的油女贞苷的HPLC分析图谱 (254nm)、¹H NMR图谱、¹³C NMR图谱。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：

1)女贞子总浸膏提取

取女贞子药材50g，粉碎后过30目筛，用150mL体积浓度为40％的乙醇水溶液加热回流提取3次，每次3小时，合并三次提取液，减压回收，得到女贞子总浸膏，约22g。

2)提取女贞子总苷

将女贞子总浸膏加入约20mL水分散，用HPD-100大孔树脂柱 (45cm*4cm)进行层析分离，先用2倍柱体积的水洗脱，之后用3倍柱体积的体积浓度为50％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到女贞子总苷，约16g。

3)反相高效制备液相色谱纯化

将女贞子总苷用体积浓度为40％的甲醇水溶液溶解，配置成50mg/mL的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品；

采用反相高效制备液相色谱纯化分离，制备型高效液相柱填料品牌为Chromatorex C18键合相填料；粒径为9μm，柱长20cm、直径5cm；进样体积为3mL，以pH＝3(加入甲酸调节)、体积浓度为45％的甲醇水溶液为流动相，流速控制在80mL/min，紫外检测器254nm检测，分别收集三个主要色谱峰的流份(保留时间为7.0-7.8min，15.0-16.0min，16.0-17.5min)，分别干燥，得到三种化合物，外观为白色粉末。

对得到的三种化合物测试HPLC分析图谱(254nm)、¹H NMR图谱、¹³C NMR图谱。经测试，三种化合物分别为：特女贞苷，约1.3g；女贞苷Gl3，约1.0g；油女贞苷，约0.2g，纯度均高达98％，均可作为化学对照品。

实施例2

一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：

1)女贞子总浸膏提取

取女贞子药材500g，粉碎后过50目筛，用1500mL的体积浓度为50％的乙醇水溶液加热回流提取2次，每次3小时，合并两次提取液，减压回收，得到女贞子总浸膏，约195g。

2)提取女贞子总苷

将女贞子总浸膏加入约200mL水分散，用Diaion大孔树脂柱(90cm*8cm) 进行层析分离，先用2倍柱体积的水洗脱，之后用3倍柱体积的体积浓度为 40％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到女贞子总苷，约 142g。

3)反相高效制备液相色谱纯化

将女贞子总苷用体积浓度为40％的甲醇水溶液溶解，配置成100mg/mL 的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品；

采用反相高效制备液相色谱纯化分离，制备型高效液相柱填料品牌为Chromatorex C18键合相填料；粒径为9μm，柱长20cm、直径7.5cm；进样体积为5mL，以pH＝3(加入甲酸调节)、体积浓度为55％的甲醇水溶液为流动相，流速控制在180mL/min，紫外检测器254nm检测，分别收集收集三个主要色谱峰的流份(保留时间为4.0-4.7min，9.0-9.6min，10.0-10.8min)，分别干燥，得到三种化合物，外观为白色粉末。

对得到的三种化合物测试HPLC分析图谱(254nm)、¹H NMR图谱、¹³C NMR图谱。经测试，三种化合物分别为：特女贞苷，约12.5g；女贞苷Gl3，约4.8g；油女贞苷，约1.2g，纯度均高达98％，均可作为化学对照品。

实施例3

一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，包括以下步骤：

1)女贞子总浸膏提取

取女贞子药材500g，粉碎后过50目筛，用1500mL体积浓度为60％的乙醇水溶液加热回流提取1次，提取时间3小时，减压回收，得到女贞子总浸膏，约130g。

2)提取女贞子总苷

将女贞子总浸膏加入约150mL水分散，用D101大孔树脂柱(90cm*8cm) 层析分离，先用2倍柱体积的水洗脱，之后用3倍柱体积的体积浓度为60％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到女贞子总苷，约110g。

3)反相高效制备液相色谱纯化

将女贞子总苷用体积浓度为60％的甲醇水溶液溶解，配置成200mg/mL 的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品；

采用反相高效制备液相色谱纯化分离，制备型高效液相柱填料品牌为Chromatorex C18键合相填料；粒径为9μm，柱长20cm、直径5cm；进样体积为5mL，以pH＝3(加入甲酸调节)、体积浓度为45％的甲醇水溶液为流动相，流速控制在180mL/min，紫外检测器254nm检测，分别收集三个主要色谱峰的流份(保留时间为6.0-6.5min，12.0-12.8min，13.0-14.0min)，分别干燥，得到三种化合物，外观为白色粉末。

对得到的三种化合物测试HPLC分析图谱(254nm)、¹H NMR图谱、¹³C NMR图谱。经测试，三种化合物分别为：特女贞苷，约11.3g；女贞苷Gl3，约6.2g；油女贞苷，约1.5g，纯度均高达98％，均可作为化学对照品。

对比例

同实施例1，区别在于：不加入甲酸调节pH。

结果发现：峰型拖尾，分离度很差。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取女贞子总浸膏

将女贞子药材粉碎过筛，在体积浓度为40-60%的乙醇水溶液中加热回流提取，过滤，减压浓缩干燥，得到女贞子总浸膏；女贞子药材与乙醇水溶液的用量比为1g：30mL；

2）大孔树脂柱层析分离

将步骤1）得到的女贞子总浸膏用水分散，女贞子总浸膏与分散用水的用量比为1g：0.9-1.15mL；经HPD-100、Diaion或D101树脂柱层析分离，先用水作为洗脱剂，洗脱1-2个柱体积，之后以体积浓度为50-60%的乙醇水溶液作为洗脱剂，洗脱3-5个柱体积，将洗脱液浓缩干燥得女贞子总苷；

3）反相高效制备液相色谱纯化

将步骤2）得到的女贞子总苷用体积浓度为40-60%的甲醇水溶液溶解，微孔滤膜过滤，得到供试品；

将供试品用反相高效制备液相色谱纯化分离，色谱柱的填充填料为C18，柱长20-22cm、直径5-7.5cm，以体积浓度为45-55%的甲醇水溶液为流动相，甲醇水溶液的pH用甲酸调节为3，进样体积为1-5mL，流速为80-180mL/min，紫外检测器254nm监测，分别收集三个主要色谱峰的流份，将三个流份分别浓缩干燥，得到纯度均大于98%的三种环烯醚萜苷类化学对照品特女贞苷、女贞苷Gl3和油女贞苷。

2.根据权利要求1所述的一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，其特征在于，步骤1）中，药材粉碎过筛时，选择筛子的目数为30-50目。

3.根据权利要求1所述的一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，其特征在于，步骤3）中，微孔滤膜为0.45μm微孔滤膜。

4.根据权利要求1所述的一种从女贞子中同时提取三种环烯醚萜苷类化学对照品的方法，其特征在于，步骤3）中，将步骤2）得到的女贞子总苷用甲醇水溶液溶解后，女贞子总苷在甲醇水溶液中的浓度为50-200mg/mL。