CN110684001A - 一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素a的方法 - Google Patents

一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素a的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柱色谱‑高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，包括如下步骤：步骤A、取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；步骤B、取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A。本发明提供了的方法不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。

Description

一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A 的方法
技术领域
本发明属于化学领域，涉及天然化合物的制备方法，具体涉及一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法。
背景技术
羊脆木Pittosporum kerrii Craib为海桐花属Pittosporum Bank植物，其根、茎、皮作为民间草药使用已有数千年的历史。有报道从羊脆木的根、茎、皮等部位的提取物中陆续分离出多种化学成分，按结构类型主要有三萜及其苷、倍半萜、类胡萝卜素、甾醇等化合物。这些化学成分具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒和抗微生物等药理活性。
羊脆木素A即为一种从羊脆木根皮中分离得到的异苯并呋喃内脂化合物(化学结构如下)，其对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性，对NB4、SH-SY5Y、PC3、A549和MCF-7细胞的IC50值分别为3.6、5.2、8.8、5.7和6.0μmol/L(文献：羊脆木根皮中1个新的异苯并呋喃内脂类化合物及其细胞毒活性，中草药，第47卷第23期2016年12月)。
Figure BDA0002242624930000011
目前，羊脆木素A的制备方法研究较少。
发明内容
本发明旨在提供一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法。
本发明目的通过以下方案实现：
一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，包括如下步骤：
步骤A、总提取物提取和乙酸乙酯萃取
取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；
步骤B、柱色谱富集羊脆木素A
取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；
步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A
以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂；设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入适量流动相使体系充分平衡；将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成样品溶液，取适量从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。
优选地，步骤A中，羊脆木根皮粉末用体积百分浓度为70～80％的乙醇水溶液热回流提取。
优选地，热回流提取的料液比为1:5。
优选地，热回流提取3次，每次2h。
优选地，步骤A中，乙酸乙酯等体积萃取3次。
优选地，步骤B中，取乙酸乙酯萃取物加适量体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解。
优选地，步骤C中，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱。
优选地，步骤C中，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。
优选地，步骤C中，将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路。
有益效果：
本发明提供了一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。
附图说明
图1为羊脆木素A富集物与羊脆木素A对照品的HPLC色谱图比对；
图2为高速逆流色谱分离色谱图；
图3为高速逆流色谱纯化产物与羊脆木素A对照品的HPLC色谱图比对。
具体实施方式
实施例1：羊脆木素A的制备
一、实验材料
干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。
乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。
二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。
羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。
C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为Agilent TC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。
色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。
水为色谱用水，采用制水机自制。
二、实验方法和结果
1、HPLC分析条件
色谱柱为Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。
2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取
取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为75％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。
3、柱色谱富集羊脆木素A
取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物(HPLC图见图1)。
4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A
以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图(图2)收集羊脆木素A对应的色谱峰(即120～140min)，浓缩干燥。
纯化产物的HPLC图见图3，与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.2％。13C-NMR(125MHz,C5D5N):δ126.2(C-1,s),159.3(C-2,s),111.3(C-3,d),144.8(C-4,s),116.6(C-5,s),130.4(C-6,d),27.3(C-7,t),124.4(C-8,d),133.4(C-9,s),17.7(C-10,q),25.8(C-11,q),69.0(C-1’,t),168.8(C-2’,s).HR-ESI-MS m/z:241.0845[M+Na]+,C13H14NaO3,误差为4ppm.
实施例2：羊脆木素A的制备
一、实验材料
干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。
乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。
二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。
羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。
C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为Agilent TC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。
色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。
水为色谱用水，采用制水机自制。
二、实验方法和结果
1、HPLC分析条件
色谱柱为Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。
2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取
取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为70％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。
3、柱色谱富集羊脆木素A
取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物。
4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A
以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。纯化产物与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.5％。核磁和质谱确证信息与实施例1一致。
实施例3：羊脆木素A的制备
一、实验材料
干燥的羊脆木根皮购自中药材市场，粉碎过40目筛，阴凉处保存备用。
乙醇为工业无水乙醇，根据需要加水制成不同体积百分浓度的乙醇水溶液。
二氯甲烷和乙酸乙酯为化学纯，为南京化学试剂股份有限公司产品。
羊脆木素A对照品由云南民族大学馈赠，纯度≥98％。
C18色谱柱为安捷伦公司产品，型号为Agilent TC-C18，规格为250mm×4.6mm、5μm。
色谱纯乙腈、三氟乙酸为TEDIA公司产品。
水为色谱用水，采用制水机自制。
二、实验方法和结果
1、HPLC分析条件
色谱柱为Agilent TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温25℃；流动相为乙腈(A)-0.05％三氟乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5min，25％A；5～35min，25％～75％A；35～40min，75％～100％A)；流动相流速1mL/min；检测波长272nm；进样量10μL。
2、总提取物提取和乙酸乙酯萃取
取5kg羊脆木根皮粉末，用体积百分浓度为80％的乙醇水溶液按照料液比1:5(1kg:5L)热回流提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。
3、柱色谱富集羊脆木素A
取乙酸乙酯萃取物250g加体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物。
4、高速逆流色谱纯化羊脆木素A
以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂。设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。纯化产物与羊脆木素A对照品具有相同的HPLC保留时间，HPLC归一化纯度为98.0％。核磁和质谱确证信息与实施例1一致。
本发明提供了一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，不依赖于硅胶柱层析和凝胶柱层析，易于操作和工业化应用。

Claims (9)

1.一种柱色谱-高速逆流色谱法从羊脆木根皮中纯化羊脆木素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A、总提取物提取和乙酸乙酯萃取
取适量羊脆木根皮粉末，用乙醇水溶液热回流提取，提取液过滤，浓缩至无醇味，乙酸乙酯等体积萃取，乙酸乙酯部分减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；
步骤B、柱色谱富集羊脆木素A
取乙酸乙酯萃取物加适量乙醇水溶液溶解，脱脂棉过滤，上样于D101大孔吸附树脂柱(柱床高度50cm，柱床直径10cm)，先用10倍柱体积的体积百分浓度为30％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积百分浓度为65％的乙醇水溶液洗脱，收集第6个柱体积的洗脱液，减压回收乙醇后冷冻干燥得到羊脆木素A富集物；
步骤C、高速逆流色谱纯化羊脆木素A
以二氯甲烷:乙酸乙酯:乙醇:水(7:5:6:5，V/V)为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，以等体积上相和下相为样品溶解溶剂；设定水浴温度为30℃，温度稳定后，将固定相泵满色谱柱，打开主机，调节转速为850r/min，洗脱模式为反接正转，转速稳定后以3mL/min的流速泵入流动相，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入适量流动相使体系充分平衡；将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成样品溶液，取适量从进样环注入管路，开启色谱工作站的采集按钮，检测波长272nm，根据色谱图收集羊脆木素A对应的色谱峰，浓缩干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A中，羊脆木根皮粉末用体积百分浓度为70～80％的乙醇水溶液热回流提取。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：热回流提取的料液比为1:5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：热回流提取3次，每次2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A中，乙酸乙酯等体积萃取3次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B中，取乙酸乙酯萃取物加适量体积百分浓度为15％的乙醇水溶液溶解。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中，将固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中，待色谱柱末端有流动相流出时继续泵入20min流动相使体系充分平衡。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中，将羊脆木素A富集物用样品溶解溶剂配制成浓度为10mg/mL的样品溶液，取10mL样品溶液从进样环注入管路。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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