CN108440619B - 山茱萸提取物制备马钱子苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种山茱萸提取物制备高纯度的马钱子苷的方法。山茱萸提取物经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离后，将含马钱子苷样品经中压反相硅胶色谱柱，流动相为乙醇和水，进行梯度洗脱，将富含马钱子苷的洗脱液减压浓缩得到纯度≧90％的马钱子苷粗品；最后经Sephadex LH‑20凝胶柱色谱进行纯化，采用氯仿和甲醇混合溶剂进行洗脱，洗脱液减压蒸干得到纯度≧98％的马钱子苷。本方法分离效果显著，速度快、效率高，同时操作简单易行，条件温和。

Description

山茱萸提取物制备马钱子苷的方法

技术领域

本发明涉及一种山茱萸提取物制备高纯度马钱子苷的方法，尤其涉及一种对马钱子苷有显著分离纯化效果的中压反相硅胶柱色谱并结合Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)凝胶柱色谱制备高纯度目标化合物的分离方法。

背景技术

山茱萸是山茱萸科山茱萸属植物的干燥成熟果肉，是既可以药用也可以食用的中药材。现代药理研究表明其具有抗老年痴呆、抗肿瘤、保护心血管、免疫调节等药理作用。马钱子苷是山茱萸环烯醚萜总苷中含量较高的一种成分，在心血管保护和免疫调节等方面具有很好的活性，被列为重要的心血管活性物质。截止目前，还没有从山茱萸或其提取物中制备高纯度马钱子苷的方法。

有两篇专利报道了从山茱萸中制备马钱子苷的方法：专利CN 104447910A采用大孔吸附树脂和普通硅胶柱分离，乙酸乙酯重结晶2～3次纯化得到纯度大于95％的马钱子苷，重结晶纯化的方法，费事费力，且能拿到高纯度目标化合物的量也很有限；专利CN106632521A中报道，采用酸反应除杂，有机溶剂提纯，乙醇重结晶得到纯度大于95％的马钱子苷，此方法需要在60-90℃条件下，加酸反应1-4h，反应条件剧烈，且容易造成结构的破坏，同时重结晶的纯化方式拿到高纯度目标化合物的量较少，很难实现目标化合物的大量制备。本专利方法简单易行，且可以大量制备得到含量≧98％的马钱子苷。

发明内容

本发明的目的在于针对现有制备方法和技术中制备纯化马钱子苷存在的不足，提出一种制备方法简单、容易操作，得率高且适合规模化生产制备高纯度马钱子苷的方法。

一种山茱萸提取物制备高纯度马钱子苷的方法，山茱萸提取物经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离后，还包括以下步骤：

(1)中压反相硅胶柱分离：将经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离得到含马钱子苷样品用水溶解，经中压反相硅胶色谱柱，流动相为乙醇和水，进行梯度洗脱，将富含马钱子苷的洗脱液减压浓缩，得到纯度≧90％(质量％，以下相同)的马钱子苷粗品；

(2)凝胶柱纯化：纯度≧90％的马钱子苷粗品经Sephadex LH-20凝胶(羟丙基葡聚糖凝胶)柱进行纯化，采用氯仿和甲醇混合溶剂进行洗脱，洗脱液减压蒸干得到高纯度的马钱子苷。

步骤(1)中，中压反相硅胶柱分离采用仪器为中压色谱仪，压力在0-50MPa之间，使用时压力在5-25MPa之间；用中压反相硅胶柱色谱分离，柱层析为反相硅胶柱，所用反相硅胶填料为C18填料。

中压反相硅胶分离时，反相硅胶柱层析为中压柱层析，采用湿法上样，流动相为乙醇和水的混合溶剂，乙醇与水的体积比为10:90～20:80进行梯度洗脱后，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压浓缩得到纯度≧90％的马钱子苷粗品。中压反相硅胶柱层析(湿法上样)所得马钱子苷除少量样品纯度≧98％外，绝大部分纯度≧90％。

优选的，溶剂洗脱流速为10-50ml/min，每一个梯度洗脱3-5个柱体积。流动相按照乙醇与水的体积比分别为10:90、12:88、15:85、20:80进行梯度洗脱。

步骤(2)中，采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行纯化时，流动相为氯仿和甲醇，氯仿与甲醇的体积比可为0:1～2.5:1之间的任何比值，即氯仿与甲醇的体积比为0:1，0.5:1，1:1，1.5:1，2:1，2.5:1或在此之间的任何比例作溶剂。优选的，氯仿与甲醇的体积比为2.5:1。

Sephadex LH-20凝胶柱色谱根据柱子直径和长短，流速控制在2～20ml/min。

洗脱后根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压蒸干得到纯度≧98％的马钱子苷。

本发明中，山茱萸提取物的制备方法可为：将干燥山茱萸果实粉碎后过20目筛，在筛分的粉末中加入50％乙醇，液料比为10:1(ml/g)，进行超声提取，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到山茱萸提取物粉末。超声提取的工艺条件：室温下进行，超声波的功率为300W，提取时间为每次45min～60min。

大孔吸附树脂富集：将山茱萸提取物用水溶解后经大孔吸附树脂柱，流动相为水和/或乙醇，进行梯度洗脱，收集富含马钱子苷的洗脱液，减压回收得到干燥洗脱物。

优选的，大孔吸附树脂富集为将山茱萸提取物用水溶解，过滤，除去不溶物，液体经HP-20型大孔吸附树脂柱，分别用水、10％乙醇(体积％，以下相同)、40％乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压回收得到干燥洗脱物。优选的，溶剂洗脱流速为10-50ml/min，每一个梯度洗脱3-5个柱体积。

正相硅胶柱初步分离：将所得洗脱物溶解后，正相硅胶拌样，拌样硅胶干法上样，流动相为氯仿和甲醇，进行梯度洗脱，收集富含马钱子苷的洗脱液，减压浓缩得含马钱子苷样品。

优选的，正相硅胶柱初步分离为将所得洗脱物用甲醇溶解后，正相硅胶拌样，拌样硅胶干法上样，流动相为氯仿：甲醇＝15:1～8:1进行梯度洗脱，合并氯仿：甲醇＝9:1～8:1相同组分，减压浓缩得含马钱子苷样品，所用正相硅胶为160～200目。优选的，溶剂洗脱流速为10-50ml/min，每一个梯度洗脱2-5个柱体积。流动相按照氯仿与甲醇的体积比分别为15:1、10:1、9:1、8:1的梯度进行洗脱。

将得到的单体马钱子苷采用高效液相检测，最终确定马钱子苷的纯度。本发明涉及的HPLC分析方法，液相色谱仪为Waters 2545型2998检测器，色谱柱：Waters sunfireC18Column(4.6*250mm，5μm)，流动相为甲醇：水＝30:70，流速：1mL/min，检测波长：240nm。

山茱萸提取物经大孔吸附树脂和正相硅胶纯化后，仍混有大量类似物，用中压反相硅胶不但分离效果显著，且速度快、效率高。凝胶Sephadex LH-20所用流动相是氯仿和甲醇的不同比例，所用洗脱剂是正相体系，即保证了分离效果，又可保证快速分离和回收。纯度≧90％的马钱子苷粗品，经凝胶柱层析(湿法上样，湿法装柱，填料一次装柱后可反复长期使用)的方法，可得到纯度≧98％的高纯度马钱子苷。本方法操作简单易行，条件温和，反相硅胶柱和凝胶柱都可以反复使用。

本发明方法能够从山茱萸提取物中获得高纯度的马钱子苷。本发明通过多次摸索尝试，最终选出一条最佳的纯化工艺路线，为市场提供一种简单易操作，且高效大量制备含量≧98％高纯度马钱子苷的方法。

附图说明

图1为马钱子苷纯度检查HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明从山茱萸提取物制备高纯度马钱子苷的方法，包括以下具体步骤：

步骤一：将山茱萸干燥果实粉碎过20目筛，溶剂用50％乙醇，液料比用10:1进行超声提取，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到山茱萸粗提物粉末。

步骤二：上述粉末用水溶解，过滤，除去不溶物，滤液上HP-20型大孔吸附树脂柱，流动相依次用水、10％乙醇、40％乙醇、70％乙醇、100％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压蒸馏干燥得到干燥洗脱物。

步骤三：将上述洗脱物采用甲醇溶解，正相硅胶拌样，用常压正相硅胶柱色谱，将拌样硅胶干法上样，干法上柱，流动相用氯仿：甲醇＝15:1～8:1进行梯度洗脱，收集氯仿：甲醇＝9:1～8:1相同组分，合并后减压浓缩得含马钱子苷样品，所用正相硅胶为160～200目。

步骤四：将含马钱子苷样品用纯水溶解，上中压反相C18色谱柱，流动相为乙醇：水＝10:90～20:80梯度洗脱，合并相同组分；得到纯度≧90％的马钱子苷粗品。

步骤五：90％纯度的马钱子苷粗品，用Spehadex LH-20凝胶纯化，流动相为氯仿：甲醇＝2.5:1进行洗脱，合并相同组分，减压浓缩蒸干得到≧98％高纯度的马钱子苷。将得到的单体采用高效液相检测，最终确定马钱子苷的纯度。

本发明中乙醇的浓度均指体积浓度，混合溶剂中溶剂之间的比例均指体积比，马钱子苷的纯度为质量百分比纯度。

实施例1山茱萸果实的提取

将干燥的山茱萸果实10kg粉碎过20目筛，溶剂用50％乙醇，液料比用10:1进行超声提取，超声波的功率为300W，提取时间为60min，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩干燥得到山茱萸提取物。

实施例2高纯度马钱子苷的制备

1)大孔吸附树脂富集

将山茱萸提取物，加水溶解，过滤，得滤液。将滤液湿法上样到HP-20型大孔吸附树脂柱，使样品完全吸附后，依次用纯水、10％、40％、70％、95％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液。流速为40ml/min，每个梯度洗脱3个柱体积。根据薄层和高效液相色谱检测，目标物全部富集在40％乙醇洗脱部位，将40％乙醇洗脱部位减压浓缩干燥。

2)正相硅胶柱分离

取上述干燥物500g，用5000ml甲醇溶解，正相硅胶(160-200目)拌样；用常压硅胶柱色谱分离，将拌样硅胶干法上样，5000g正相硅胶(160-200目)干法上柱，流动相用氯仿：甲醇＝15:1～8:1，按照氯仿与甲醇的体积比分别为15:1、10:1、9:1、8:1，进行梯度洗脱，流速为30ml/min，每个梯度洗脱3个柱体积。收集氯仿：甲醇＝9:1～8:1流分，合并相同组分；减压回收得到含马钱子苷样品。

3)中压反相硅胶柱分离

取步骤2)中含马钱子苷样品100g用纯水溶解，过滤，滤液上中压(压力在0-50MPa之间，使用时压力在5-25MPa之间)反相C18柱(填料C18，填装量1200g)，流动相用乙醇：水＝10:90～20:80，按照乙醇与水的体积比分别为10:90、12:88、15:85、20:80进行梯度洗脱，流速：30ml/min，每个梯度洗脱5个柱体积，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压浓缩干燥，得到纯度≧90％的马钱子苷粗品。中压反相硅胶柱，一次装柱可以反复使用，且洗脱速度快，时间短，效率高。

4)凝胶柱纯化

取步骤3)纯度≧90％的马钱子苷粗品，用Sephadex LH-20凝胶进行纯化，流动相用氯仿：甲醇＝2.5:1进行洗脱，流速为6ml/min，根据硅胶薄层色谱和高效液相色谱合并相同组分，减压蒸干得到≧98％高含量的马钱子苷。凝胶柱可以反复使用，所用流动相为正相体系，每次柱层析时间短，分离和回收效率高。

实施例3 HPLC检测方法

液相色谱仪：Waters2545型2998型紫外检测器

色谱柱:Waters sunfire C18Column(4.6×250mm，5μm)

流动相：甲醇：水＝30:70

流速：1mL/min

检测波长：240nm

进样量:10μl

出峰时间：20.92min

供试品及对照品配制溶液：色谱级甲醇溶解。

采用上述仪器和方法，对实施例2得到的马钱子苷进行检测，马钱子苷纯度检查HPLC色谱如图1所示，经与对照品图谱对比，确定为马钱子苷单体，且纯度≧98％。

本发明将山茱萸提取物经大孔吸附树脂和正相硅胶初步分离，再用中压反相硅胶分离，流动相用乙醇：水＝10:90～20:80进行梯度洗脱，合并相同组分，减压浓缩得到纯度≧90％的马钱子苷粗品；最后经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，流动相用：氯仿：甲醇＝2.5:1进行洗脱，合并相同洗脱部分，减压蒸干得到纯度在98％以上的马钱子苷。本方法分离效果显著，速度快、效率高，同时操作简单易行，条件温和。

Claims (3)

1.一种山茱萸提取物制备马钱子苷的方法，山茱萸提取物经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离后，还包括以下步骤：

(1)中压反相硅胶分离：将经大孔吸附树脂富集和正相硅胶初步分离得到的含马钱子苷样品用水溶解，经中压反相硅胶色谱柱，采用湿法上样，流动相为乙醇和水的混合溶剂，乙醇与水的体积比为10:90～20:80，梯度洗脱后，合并相同组分，减压浓缩得到马钱子苷粗品；

(2)凝胶柱纯化：将马钱子苷粗品经Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，采用氯仿和甲醇混合溶剂进行洗脱，洗脱的流速为2～20ml/min，流动相中，氯仿与甲醇的体积比为2.5:1，洗脱液减压蒸干得到马钱子苷的纯度≧98质量％。

2.根据权利要求1所述的山茱萸提取物制备马钱子苷的方法，其特征在于：中压反相硅胶分离采用仪器为中压色谱仪，反相硅胶柱采用反相硅胶填料为C18填料。

3.根据权利要求1所述的山茱萸提取物制备马钱子苷的方法，其特征在于：山茱萸提取物的制备方法为：将干燥山茱萸果实粉碎后过20目筛，在筛分的粉末中加入50％乙醇，液料比为10:1ml/g，进行超声提取，连续提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到山茱萸提取物粉末；超声提取在室温下进行，超声波的功率为300W，提取时间为每次45min～60min。

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