CN104844547B - 一种芦荟苷的高效提取和分级纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种芦荟苷的高效提取和分级纯化方法，属于植物分离提取技术。经乙醇提取得流浸膏、水溶解和沉淀得粗提物、硅胶层析得到精提物、再经结晶得芦荟苷成品。采用乙醇提取、热水溶解、低温沉淀处理、硅胶层析、甲醇结晶等分级纯化技术，在各步骤分别能获得30～40%、70～80%、95%以上等不同纯度的产品，根据需要满足科研、医药、保健食品原料等各种市场需求。本发明提供的方法工艺操作简单、溶剂消耗量小、提取效率和得率高、生产成本低。

Description

一种芦荟苷的高效提取和分级纯化方法

技术领域

本发明涉及一种芦荟苷的高效提取和分级纯化方法，属于植物分离提取技术。

背景技术

芦荟苷，即芦荟大黄素葡萄糖苷，英文名Aloin，CAS#1415-73-2，化学名1,8-二羟基-10-（β-D-吡喃葡萄糖基）-3-羟甲基-9（10H）-蒽酮（1,8-Dihydroxy-10-(beta-D- glucopyranosyl)-3-(hydroxymethyl)-9(10H)-anthracenone），分子式C₂₁H₂₂O₉，分子量418，m.p148～149℃，UVλmaxnm(ε): 354(10715), 297(9333), 269(7943)，IRνmax cmˉ1:3230, 2860, 1610, 1470, 1390, 1300, 1240, 1190, 1020, 910, 860, 830, 780，[α]D+21°(水), [α]D-8.3°，黄色针状晶体，略带沉香气味，味苦，易溶于吡啶、甲醇、乙醇和丙酮、热水，可溶于水、冰醋酸、甲酸、乙酸乙酯等，微溶于氯仿和乙醚，热水中溶解度增大，0.86%水溶液PH4.0～6.5。芦荟苷是芦荟提取物的主要活性成分，具有润肠通便、抗炎、抗肿瘤、降血脂、降血糖、调节免疫等药理作用。

关于芦荟苷提取方法，刘玉魁等（刘玉魁,郭迎霞,赵作连,杨世强. 药用芦荟中芦荟苷的提取分离及含量测定[J]. 医药导报. 2007(04)）采用葡聚糖凝胶分子筛结合层析法提取芦荟中芦荟苷，采用理化和薄层色谱法进行定性鉴别，采用高效液相色谱法进行定量分析，结果表明，库拉索芦荟中芦荟苷含量为25.5%，好望角芦荟中芦荟苷含量为20.1%。张翠利等（张翠利,李锟,李钦.芦荟中芦荟苷提取工艺研究[J]. 亚太传统医药. 2010(08).）进行了单因素试验和L9(34)正交试验，确定芦荟苷提取最佳工艺条件为：乙醇浓度50%、料液比1:15、提取时间60min、提取2次、pH为5。徐文广等（徐文广,林佳,魏艳芬. 芦荟中芦荟苷的提取分离[J]. 企业技术开发. 2011(12) .）比较了酸碱处理结合乙醇提取、乙酸乙酯萃取后异丁醇结晶两种工艺的优劣，但两种方法均只能得到芦荟苷的粗提物。朱亚玲等（朱亚玲,马烽,刘建,宗学刚.微波预处理提取芦荟中芦荟苷的工艺研究[J]. 山东轻工业学院学报(自然科学版). 2010(03).）通过单因素实验，确定了微波预处理技术提取芦荟中芦荟苷的工艺条件：润湿时间30min、乙醇浓度50%、微波功率340W、微波作用时间120s、洗脱温度80℃、洗脱时间30 min、洗脱剂倍量60。马稳等（马稳,宋力.超声提取芦荟中芦荟苷的工艺研究[J]. 食品工业科技. 2008(09).）采用正交设计，确定了利用超声波技术提取芦荟中芦荟苷的最佳提取条件为：超声时间40min、甲醇浓度60%、料液比1∶60（g/ml），得率由1.559%提高到1.792%。

关于芦荟苷的纯化方法，徐蓉等（徐蓉,李燕. 大孔吸附树脂纯化库拉索芦荟中芦荟苷的研究[J]. 食品科学. 2008(11) .）对6种大孔吸附树脂进行了静态吸附和动态洗脱实验筛选，优化出HZ-801型树脂的最佳工艺参数为：在上样浓度为0.2765mg/ml的条件下，上样体积为520ml、洗脱剂60%乙醇、洗脱速度2ml/min、洗脱体积3BV，纯化倍数为14.72，回收率86.3%。张美玲等（张美玲,钱和,张根义.大孔吸附树脂分离纯化芦荟甙的研究[J]. 河南工业大学学报(自然科学版). 2005(06)）研究了8种大孔树脂对芦荟甙的吸附及解吸性能，选择NKA-Ⅱ大孔树脂对芦荟甙进行分离的最佳条件为：上样量1.5 BV、流速2.0 ml/min、先以1.0BV蒸馏水洗涤、再用2.0BV的60%乙醇溶液洗涤、后用2.5BV的70%乙醇溶液洗涤并收集洗脱液，经浓缩、冷冻干燥成芦荟甙粗品，纯度达到4.9%，纯化倍数达到38倍。晏正（晏正. 芦荟粉提取制备芦荟苷和芦荟大黄素[D]. 河南大学 2010.）以乙酸乙酯作为提取剂，在单因素的基础上采用正交试验法，得出最佳工艺条件为：芦荟粉14g、提取温度为57℃、提取时间为30 min、溶剂用量为300ml、提取次数为4次，在此条件下芦荟苷的提取率可达77.15 %；将粗提物重新溶解在异丁醇中，-5℃冷冻24 h，过滤得到芦荟苷晶体，纯度为80.73%，收率为51.35 %；将芦荟苷晶体加入水中，室温下搅拌30 min，过滤，干燥，得到93.5%纯度的芦荟苷。张琦等（张琦,李燕,党培育,曹君. 应用高速逆流色谱分离纯化芦荟苷[J]. 食品工业科技. 2011(04).）利用高速逆流色谱对芦荟中的蒽醌类活性成分芦荟苷进行了制备型分离研究，溶剂系统：氯仿-正丁醇-甲醇-水(4:0.28:3:2，V/V)、上相为固定相、下相为流动相、转速870r/min、流速2mL/min，经TLC和HPLC分析，分离组分芦荟苷A和B的纯度分别达到96%和93%。李婷等（李婷,钟英,王芝,万金志. 芦荟苷A、B以及异芦荟色苷D的同时分离纯化[J]. 天然产物研究与开发. 2011(05) .）以库拉索芦荟丙酮粗提物为原料，采用中压制备色谱系统：SCO色谱柱（40cm×26cm，30～50um）、流动相甲醇-0.5%乙酸水（33:67，V/V）、等度洗脱流速20ml/min、柱温室温、检测波长254nm、收集波长356nm，一次分离制备得到芦荟苷A、B以及异芦荟色苷D，其纯度分别达到了98.0%,96.0%和98.9%。

在已公开的专利申请中，“一种新的芦荟苷提取工艺”（CN102070585A），取中药材芦荟10g，蒸馏水洗涤后研磨粉碎至过80目分子筛，用5%醋酸酸化，至表面皿风干，除去多余水分，精密称重。将风干后芦荟粉末在微波加热条件下经乙醇－水溶剂提取，提取液经氢氧化钠碱化、洗涤、冰醋酸酸化、水浴抽虑、醋酸铅固定、硫化铅脱铅等步骤后制得芦荟苷粗品，最后，产品经过凝胶柱层析得芦荟苷晶体。“一种提高芦荟苷提取收率的方法”（CN103694207A），通过加入溶剂、柠檬酸、硫酸铵进行回流提取，使用多孔硅胶色谱柱进行吸附分离，再通过二氧化碳超临界萃取分离进一步纯化，使芦荟原料中的成分析出，收率比传统方法得到提高，产品纯度好，可以达到99%以上。“一种芦荟苷的纯化方法”（CN101979388A），将芦荟制品粉碎，加入5～10醋酸水溶液超声溶解，溶解液加入聚酰胺树脂柱吸附，水洗中性，5～8BV 40～60%乙醇溶液洗脱有效成分，洗脱液减压回收乙醇至密度1.05～1.15，加入乙酸乙酯萃取2～3次，乙酸乙酯层泵入中压硅胶柱，甲醇、乙酸乙酯梯度洗脱，液相监测，收集高浓度流分，冷藏结晶，氯仿乙醚混合溶液重结晶，滤出干燥即得芦荟苷。“一种从芦荟制品中分离高纯度芦荟普的方法”（CN100453548C），将芦荟制品溶解或者稀释于醇的水溶液或者醇中，再通过苯乙烯强碱阴离子交换树脂柱完成脱色，通过大孔吸附树脂柱完成杂质分离，然后再浓缩、结品、过滤、干燥，最终得到含量超过95%的芦荟苷，总收率可达60%以上。“一种异芦荟色苷D和芦荟苷的分离提取方法”（CN101665478），以芦荟为原材料获得初提物，在高速逆流色谱中，以正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮∶水(体积比0.5～0.1∶4～6∶0.5～2∶4～6)构成上相流动相和下相固定相，进行分离提取，在同一分离过程中同时获得高纯度异芦荟色苷D（Isoaloeresin D）和芦荟苷（Aloin）二个单体产品。“制备型高效液相色谱法分离纯化芦荟苷”（CN103788040A），采用乙醇加热回流提取，反相硅胶作为DAC制备柱填料，甲醇和水的混合溶剂为流动相的方法分离纯化了芦荟苷。

综上所述，芦荟苷的提取主要采用溶剂提取，使用溶剂多为乙醇、乙酸乙酯及酸碱溶液，此外，为提高提取效率，常辅以微波预处理、超声提取等方法。芦荟苷的纯化，常采用大孔树脂吸附法、溶剂萃取法、凝胶层析法、HPLC法等，其中，大孔树脂吸附法、溶剂萃取法可实现目标产物的富集，成品纯度往往不能达到标准品要求；凝胶层析法根据目标产物与杂质分子量差异可将不同糖基取代的蒽醌苷分开，HPLC法分离效果最好，成品纯度可达到95%以上，但因成本较高，仅限实验室标准物质制备，难以实现工业化生产。

发明内容

为克服现有技术提取效率和得率低、提取纯化成本高，难以实现规模化生产等问题，本发明提供一种芦荟苷的高效提取和分级纯化方法，采用分级纯化技术，根据需要生产出不同纯度的产品，满足科研、医药、保健食品原料等各种市场需求。

本发明通过下列技术方案实现：一种芦荟苷的高效提取和分级纯化方法，经过下列各步骤：

（1）乙醇提取：取芦荟粉，加入1～2倍质量的浓度为85～100v/v%乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在50～60℃下减压浓缩至呈流浸膏，所得流浸膏中芦荟苷含量为15～25%，目标物质提取率达95%以上；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏4～6倍质量的70～95℃水进行溶解，再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余2～3倍流浸膏质量的水溶液，然后置于0～8℃下放置24～48h，经离心分离得到上清液和沉淀，再将沉淀在60～65℃下减压干燥或冷冻干燥，得粗提物，所得粗提物中芦荟苷含量为30～40%，目标物质提取率达90%以上；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:（5～10），将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:（1.0～1.5）的质量比，将溶液与60～80目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:（8～15）的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查，合并目标产物片段，再回收溶剂后，在50～60℃下进行减压干燥，得到精提物，所得精提物中芦荟苷含量为70～80%，目标物质洗脱率达95%以上；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入4～8倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于0～8℃下放置24～48h进行结晶，得到结晶母液和针状晶体，再将针状晶体于50～60℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品。所得芦荟苷成品的纯度达98%以上，目标物质回收率达95%以上。

所述步骤（2）中的上清液作为70～95℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经2～3次循环后，以副产物作为其它利用。

所述步骤（3）的洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=（8.5:1.5）～（9.5:0.5）体积比的混合物，或者，乙酸乙酯:甲酸=（9:1）～（9.8:0.2）体积比的混合物。

所述步骤（4）中的结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经2～3次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。

所述无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇和甲酸均为市购分析纯。

本发明具备的优点及效果：

本发明根据芦荟苷在不同溶剂和温度条件下溶解度差异，采用乙醇提取、热水溶解、水溶液低温沉淀处理，可得到芦荟苷含量30～40%的粗提物，提取率90%以上，与现有技术相比，溶剂用量降低，工艺步骤减少，引入杂质减少；采用硅胶层析，可将目标物质芦荟苷纯度提高至70～80%，洗脱率95%以上，与现有技术相比，既可规模化生产，又可提高得率；采用甲醇结晶方法，可将芦荟苷提纯至98%以上，达到或高于标准品要求，结晶母液返工处理，目标物质回收率达到95%以上。因目标物质芦荟苷的提取效率和提取得率提高，提取纯化成本大大降低，可实现规模化生产；采用乙醇提取、热水溶解、低温沉淀处理、硅胶层析、甲醇结晶等分级纯化技术，在各步骤分别能获得30～40%、70～80%、95%以上等不同纯度的产品，根据需要满足科研、医药、保健食品原料等各种市场需求。本发明提供的方法工艺操作简单、溶剂消耗量小、提取效率和得率高、生产成本低。

附图说明

图1为本发明的工艺流程示意图；

图2为购自中国药品生物制品检定所（中检院）的芦荟苷标准物质的HPLC图谱（4.6×250mm C₁₈柱，MeOH-H₂O=55:45，流速1ml/min，柱温40℃，波长359nm，RT=16.8min）；标示含量为98%。

图3为实施例2所用库拉索芦荟粉原料（墨绿色粉末）的HPLC图谱，测得芦荟苷（即芦荟苷A）含量18.01%；图谱显示包括大量芦荟苷B（RT=15min）在内的多个杂质峰。

图4为实施例2中步骤（2）所得粗提物（淡黄色至橙黄色无定形粉末）的HPLC图谱，测得芦荟苷（即芦荟苷A）含量39.31%，图谱显示大量芦荟苷B的主要杂质峰及其它3个杂质峰；

图5为实施例2中步骤（3）所得精提物（淡黄色粉末）的HPLC图谱，测得芦荟苷（即芦荟苷A）含量75.61%，图谱显示少量芦荟苷B在内的两个杂质峰；

图6为实施例2中步骤（4）所得芦荟苷成品（黄色针状晶体）的HPLC图谱，芦荟苷含量98.61%。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）乙醇提取：取库拉索芦荟粉100g（测得芦荟苷含量19.17%），加入2倍质量的无水乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在55℃下减压浓缩至呈流浸膏，所得流浸膏中芦荟苷含量为25%，目标物质提取率达95%以上；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏5倍质量的95℃水进行溶解（相当于浓度为6～8wt%的芦荟粉溶液），再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余3倍流浸膏质量的水溶液，然后置于4℃下放置48h，经离心分离得到上清液和橙黄色沉淀，再将沉淀在62℃下冷冻干燥，得粗提物48g，所得粗提物中芦荟苷含量为35.68%，目标物质提取率达90%以上；所得上清液作为95℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经3次循环后，以副产物作为其它利用；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:6，将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:1的质量比，将溶液与80目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:15的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查（展开剂为乙酸乙酯:甲醇:水＝100:17:13的体积比），合并目标产物片段，再回收溶剂后，在60℃下进行减压干燥，得到精提物21.5g，所得精提物中芦荟苷含量为79.32%，目标物质洗脱率达95%以上；其中，洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=9:1体积比的混合物；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入5倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于4℃下放置24h进行结晶，得到结晶母液和橙黄色针状晶体，再将针状晶体于60℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品7.4g；结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经3次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。

经HPLC检测（固定相：C18柱，4.6mm×25cm，流动相：甲醇:水＝55:45，流速1ml/min，柱温40℃，检测波长359nm，理论塔板数按芦荟苷峰计算不低于2000），芦荟苷含量98.27%。目标物质回收率达95%以上。

实施例2

（1）乙醇提取：取库拉索芦荟粉500g（芦荟苷含量18.01%），加入1倍质量的浓度为85v/v%乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在60℃下减压浓缩至呈流浸膏，所得流浸膏中芦荟苷含量为25%，目标物质提取率达95%以上；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏6倍质量的85℃水进行溶解（相当于浓度为6～8wt%的芦荟粉溶液），再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余2倍流浸膏质量的水溶液，然后置于0℃下放置24h，经离心分离得到上清液和橙黄色沉淀，再将沉淀在60℃下减压干燥，得粗提物206g，所得粗提物中芦荟苷含量为39.31%，目标物质提取率达90%以上；所得上清液作为85℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经2次循环后，以副产物作为其它利用；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:10，将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:1.5的质量比，将溶液与70目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:10的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查，合并目标产物片段，再回收溶剂后，在55℃下进行减压干燥，得到精提物24.5g，所得精提物中芦荟苷含量为75.61%，目标物质洗脱率达95.25%；其中，洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=8.5:1.5体积比的混合物；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入8倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于0℃下放置30h进行结晶，得到结晶母液和橙黄色针状晶体，再将针状晶体于55℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品6g；结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经2次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。

经HPLC检测，所得芦荟苷成品的纯度达98.61%，目标物质回收率达95%以上。

通过图4～图8，说明芦荟苷（即芦荟苷A）含量15～20%的库拉索芦荟粉，经乙醇提取、热水溶解、水溶液低温沉淀处理的简单步骤，可得到芦荟苷（即芦荟苷A）含量为30～40%的粗提物，其中，根据HPLC峰面积计算芦荟苷A、B两种异构体的总含量达到80%以上（作为杂质的芦荟苷B含量为40～50%），该纯度的产品可在保健食品中应用；粗提物经硅胶层析处理，可得到芦荟苷（即芦荟苷A）含量为70～80%的精提物，其中，根据HPLC峰面积计算芦荟苷A、B两种异构体的总含量达到95%以上（作为杂质的芦荟苷B含量降低至20～30%），该纯度的产品可在口服医药制剂中应用；精提物经甲醇结晶，可得到芦荟苷（即芦荟苷A）含量98%以上的成品（作为杂质的芦荟苷B含量低于2%），该纯度的产品可在注射制剂中应用。

实施例3

（1）乙醇提取：取芦荟粉，加入1倍质量的浓度为90v/v%乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在50℃下减压浓缩至呈流浸膏，所得流浸膏中芦荟苷含量为22%，目标物质提取率达95%以上；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏4倍质量的70℃水进行溶解（相当于浓度为6～8wt%的芦荟粉溶液），再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余～3倍流浸膏质量的水溶液，然后置于8℃下放置40h，经离心分离得到上清液和橙黄色沉淀，再将沉淀在65℃下冷冻干燥，得粗提物，所得粗提物中芦荟苷含量为39.56%，目标物质提取率达90%以上；所得上清液作为70℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经3次循环后，以副产物作为其它利用；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:5，将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:1.2的质量比，将溶液与60目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:8的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查，合并目标产物片段，再回收溶剂后，在50℃下进行减压干燥，得到精提物，所得精提物中芦荟苷含量为71.47%，目标物质洗脱率达99.16%；其中，洗脱剂为乙酸乙酯:甲酸=9.8:0.2体积比的混合物；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入4倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于8℃下放置48h进行结晶，得到结晶母液和橙黄色针状晶体，再将针状晶体于50℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品；结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经3次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。

经HPLC检测，所得芦荟苷成品的纯度达99.24%，目标物质回收率达95%以上。

实施例4

（1）乙醇提取：取库拉索芦荟粉100kg（芦荟苷含量14.39%），加入2倍质量的浓度为95v/v%乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在60℃下减压浓缩至呈流浸膏，所得流浸膏中芦荟苷含量为25%，目标物质提取率达95%以上；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏5倍质量的95℃水进行溶解（相当于浓度为6～8wt%的芦荟粉溶液），再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余2倍流浸膏质量的水溶液，然后置于2℃下放置28h，经离心分离得到上清液和橙黄色沉淀，再将沉淀在65℃下冷冻干燥，得粗提物35kg，所得粗提物中芦荟苷含量为37.23%，目标物质提取率达90.51%；所得上清液作为85℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经3次循环后，以副产物作为其它利用；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:6，将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:1的质量比，将溶液与80目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:10的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查，合并目标产物片段，再回收溶剂后，在60℃下进行减压干燥，得到精提物0.97kg，所得精提物中芦荟苷含量为73.54%，目标物质洗脱率达95.80%；其中，洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=9.5:0.5体积比的混合物；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入6倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于4℃下放置30h进行结晶，得到结晶母液和橙黄色针状晶体，再将针状晶体于55℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品260g；结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经2次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。

经HPLC检测，所得芦荟苷成品的纯度达98.47%，目标物质回收率达95%以上。

实施例5

（1）乙醇提取：取芦荟粉，加入1倍质量的浓度为90v/v%乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在50℃下减压浓缩至呈流浸膏，所得流浸膏中芦荟苷含量为24%，目标物质提取率达95%以上；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏4倍质量的70℃水进行溶解（相当于浓度为6～8wt%的芦荟粉溶液），再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余～3倍流浸膏质量的水溶液，然后置于8℃下放置40h，经离心分离得到上清液和橙黄色沉淀，再将沉淀在65℃下冷冻干燥，得粗提物，所得粗提物中芦荟苷含量为39.23%，目标物质提取率达90%以上；所得上清液作为70℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经3次循环后，以副产物作为其它利用；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:5，将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:1.2的质量比，将溶液与60目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:8的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查，合并目标产物片段，再回收溶剂后，在50℃下进行减压干燥，得到精提物，所得精提物中芦荟苷含量为76.42%，目标物质洗脱率达99.32%；其中，洗脱剂为乙酸乙酯:甲酸=9:1体积比的混合物；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入4倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于8℃下放置48h进行结晶，得到结晶母液和橙黄色针状晶体，再将针状晶体于50℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品；结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经3次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。

经HPLC检测，所得芦荟苷成品的纯度达99.98%，目标物质回收率达95%以上。

通过上述实施例，进一步分析本发明与现有技术的相比的优胜点：

传统芦荟苷提取技术，普遍采用有机溶剂提取方法，溶剂多用丙酮、乙酸乙酯、甲醇等，溶剂与物料的体积重量比高达10～20:1，目标物质提取完全，但溶剂用量较大，提取成本较高；为增加目标物质的溶出率，还在提取液中添加酸、碱、重金属盐等溶液，这些物质会大量残留在废渣中，导致废弃物引起的环境污染，并对人体健康造成较大危害；有报道采用微波、超声处理等方法提取芦荟苷，这些处理方式可以提缩短提取周期，但并未从根本上解决提取率的问题。

芦荟苷的纯化，有离子交换、凝胶色谱、液相色谱等技术，离子交换效率较低，即时多次交换也未能达到医药级芦荟苷的纯度要求；凝胶色谱、液相色谱纯化效果好，可以一次处理就达到标准品纯度要求，但是成本很高，仅限于实验室制备，难以实现工业化生产。

本发明根据芦荟苷的物理化学性质，芦荟苷为极性较大的物质，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，所以，在提取步骤中，为安全生产考虑，避免使用对人体伤害较大的甲醇和丙酮，而采用乙醇提取，因芦荟苷在无水乙醇中溶解度非常大，无水乙醇对芦荟苷的提取效率是乙酸乙酯的10倍，溶剂与物料的体积重量比1～2:1即可基本把目标物质提取完全，但为保证提取得率，本发明进行3次提取，使目标物质提取得率在95%以上。

常温条件下，芦荟苷在水中的溶解度为0.86%，而在热水中溶解度高达15%。其它蒽醌类杂质可溶于乙醇，但不溶于热水，利用这一溶解度差异，本发明采用热水溶解无水乙醇提取物，目标物质芦荟苷溶解在热水中，而不溶于热水的杂质另行处理，这样可达到一定纯化效果。溶于热水的部分，经低温处理，因不同温度下溶解度差异，大部分芦荟苷因过饱和而沉淀出来，通过过滤或离心，很容易获得芦荟苷粗提物。该提取物芦荟苷含量可达40%，主要杂质为其旋转异构体芦荟苷B，芦荟苷A、B两个异构体的总含量可达到80%以上，该产品可满足保健食品原料的纯度要求。

前期研究发现，芦荟苷在丙酮、吡啶中不易形成晶体，在甲醇、乙醇中均可结晶，但在甲醇中的晶型更好、纯度更高，因此，在最后纯化的最后一个步骤中，采用甲醇中结晶的办法，更容易获得纯度98%以上的成品，该步骤使用的溶剂量较小，并且主要在低温下进行，甲醇对生产安全和人体健康的影响不大。

但是，经热水溶解、低温沉淀的芦荟苷粗提物，因杂质含量较高，尤其是受异构体芦荟苷B的影响，很难直接进行结晶处理，因此，必须经过进一步的纯化处理，将芦荟苷的含量提高至70%以上，方能在甲醇结晶时获得芦荟苷晶体。现有技术采用的离子交换、凝胶色谱、液相色谱等方法均不能满足本发明技术和规模生产的要求，所以，为降低生产成本、保证生产效率，本发明采用硅胶层析技术，将40%芦荟苷粗提物的含量提高至70%以上，该产品既可满足口服医药级芦荟苷原料的纯度要求，又可用于后续结晶处理获得98%以上的高纯度芦荟苷成品。

硅胶层析技术在植物提取领域应用较为广泛，但未见在芦荟苷提取纯化中应用的报道，本发明经过多次试验发现，采用硅胶层析技术分离纯化芦荟苷，采用物料:硅胶=1:（8～15）的比例，即可在保证分离效果的基础上，层析硅胶的用量最低；采用乙酸乙酯:甲醇=（8.5:1.5）～（9.5:0.5）或者乙酸乙酯:甲酸=（9:1）～（9.8:0.2）体积比的混合物，作为洗脱剂，目标物质的分离效果最好、溶剂用量最低、生产成本最低。

综上所述，本发明提供的方法工艺操作简单、溶剂消耗量小、提取效率和得率高、生产成本低。

Claims (2)

1.一种芦荟苷的提取和分级纯化方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）乙醇提取：取芦荟粉，加入1～2倍质量的浓度为85～100v/v%乙醇提取3次，再对提取液进行过滤，去除醇不溶物，过滤所得滤液在50～60℃下减压浓缩至呈流浸膏；

（2）水溶解和沉淀：在步骤（1）所得流浸膏中加入流浸膏4～6倍质量的70～95℃水进行溶解，再经过滤，去除水不溶物，过滤所得滤液减压浓缩至仅余2～3倍流浸膏质量的水溶液，然后置于0～8℃下放置24～48h，经离心分离得到上清液和沉淀，再将沉淀在60～65℃下减压干燥或冷冻干燥，得粗提物；

（3）硅胶层析：按固液比kg/L计为1:5～10，将步骤（2）所得粗提物用无水乙醇进行溶解得溶液，再按所得溶液:层析硅胶=1:1.0～1.5的质量比，将溶液与60～80目层析硅胶进行混合，然后经减压抽干回收乙醇得到剩余物料，按剩余物料:硅胶=1:8～15的质量比混合得到混合物，再将混合物干法上样装填硅胶层析柱，然后以洗脱剂进行洗脱，并按15等份体积分段收集洗脱液，经TLC检查，合并目标产物片段，再回收溶剂后，在50～60℃下进行减压干燥，得到精提物；

（4）结晶：在步骤（3）所得精提物中加入4～8倍质量的甲醇进行溶解，再经过滤，过滤所得滤液于0～8℃下放置24～48h进行结晶，得到结晶母液和针状晶体，再将针状晶体于50～60℃下进行减压干燥，即得芦荟苷成品。

2.根据权利要求1所述的高效提取和分级纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中的上清液作为70～95℃的水溶解步骤（1）所得流浸膏，经2～3次循环后，以副产物作为其它利用。

3. 根据权利要求1所述的高效提取和分级纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）的洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=8.5:1.5～9.5:0.5体积比的混合物，或者，乙酸乙酯:甲酸=9:1～9.8:0.2体积比的混合物。

4. 根据权利要求1所述的高效提取和分级纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中的结晶母液作为甲醇溶解步骤（3）所得精提物，经2～3次循环后，返回至步骤（3）作为溶液与层析硅胶混合，继续后续操作。