CN109400566A - 一种从卷柏属植物中提取分离高纯度穗花杉双黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从卷柏属植物中提取分离高纯度穗花杉双黄酮的方法，本发明采用非极性大孔吸附树脂作为分离材料，采用含水乙醇‑pH梯度洗脱工艺，从卷柏属植物醇提液中分离得到穗花杉双黄酮粗品，进一步通过碱性甲醇溶解酸沉及乙醇重结晶工艺分离得到高纯度的穗花杉双黄酮，含量98％以上，工艺转移率50％以上。

Description

一种从卷柏属植物中提取分离高纯度穗花杉双黄酮的方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种从卷柏属植物中分离纯化高纯度穗花杉双黄酮的方法。

背景技术

穗花杉双黄酮(Amentoflavone)又称阿曼托双黄酮，广泛存在于卷柏属(Selaginella)植物中。药理研究表明穗花杉双黄酮具有抗炎、抗病毒、抗癌、降血糖和神经保护等药理活性。穗花杉双黄酮作为药用原料开发与应用具有重要研究价值。卷柏属植物卷柏S.tamariscina、及江南卷柏S.moellendorffii中穗花杉双黄酮含量较大(0.4～1.4％)，结构类似物较为复杂，研究开发一个工业化从卷柏属植物中制备分离高纯度药用原料穗花杉双黄酮的制备工艺具有重要应用价值。

目前，文献报道的提取分离穗花杉双黄酮的方法很多，如，赖红芳等发表的《大孔树脂纯化翠云草中穗花杉双黄酮的工艺》(江苏农业科学，2018，46(7):201-204)比较了8种不同型号的大孔吸附树脂对穗花杉双黄酮的吸附性质，结果表明，极性大孔吸附树脂NKA-9比较适用于穗花杉双黄酮的纯化，最佳纯化工艺为90％(v/v)乙醇洗脱，洗脱7个柱体积，分离纯化后的穗花杉双黄酮的回收率达64.26％。但用该方法并未得到高纯度穗花杉双黄酮单体化合物。

已公开专利“一种穗花杉双黄酮的制备方法”(中国，专利号：CN 101585825 A；公布日：2009.11.25)以卷柏干燥全草为起始原料，用有机溶剂和水进行提取，并且采用硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析分离法进行分离得到纯度在95％以上穗花杉双黄酮，但该方法用到硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析，一方面工艺步骤繁琐，生产周期较长，另一方面生产成本较高，不易于工业化生产。

已公开专利“一种分离纯化穗花杉双黄酮的方法”(中国，专利号：CN 102229590A；公布日：2011.11.02)，将卷柏加水或其他极性溶剂回流提取，所得到的提取物采用石油醚、乙酸乙酯、丙酮和水的混合溶液作为溶剂体系，经制备型高速逆流色谱仪进行分离纯化得到穗花杉双黄酮。该方法能得到高纯度的穗花杉双黄酮产品，但该方法一次只能制备少量穗花杉双黄酮产品，高速逆流设备成本较高，不易工业化生产。

已公开专利“一种穗花杉双黄酮的纯化方法”(中国，专利号：CN 103694212 A；公布日：2014.04.02)，将卷柏加热加水提取，弃去水提液，收集卷柏药材，然后加入甲醇或乙醇，回流提取，收集醇提取液，减压浓缩，浓缩液离心，收集沉淀物，用溶剂油或石油醚搅拌脱脂，过滤，收集滤饼，干燥，得到卷柏总黄酮提取物，用甲醇或乙醇溶解，上样于强极性大孔吸附树脂ADS-7，用0.5～2％(v/v)盐酸洗脱，得到的洗脱液调pH4～6后，浓缩，静置析晶，得到的晶体再用甲醇或乙醇进行重结晶，得到纯度在95％以上的穗花杉双黄酮。该方法得到卷柏总黄酮提取物过程繁琐，且使用易燃易爆有机溶剂。

发明内容

本发明目的是提供一种从卷柏属植物中提取分离高纯度穗花杉双黄酮的方法，药材用含水醇溶液进行提取，提取液浓缩，后续步骤采用大孔吸附树脂柱层析，含水乙醇-pH梯度洗脱及碱性甲醇溶解酸沉和重结晶方法，从卷柏属植物中提取分离得到高纯度穗花杉双黄酮，含量>98％,符合工业化生产技术特点。

本发明采用的技术方案是：

一种从卷柏属植物中提取分离穗花杉双黄酮的方法，所述方法如下：

(1)药材提取：将卷柏属药材，粉碎，加体积百分比70～95％乙醇水溶液回流提取或50～80℃温浸搅拌提取，提取2～3次，每次提取1～3hr，合并醇提液，减压回收溶剂，得卷柏属药材醇提浓缩液；

(2)大孔吸附树脂柱层析：将卷柏属药材醇提浓缩液，过滤，滤液上样于大孔吸附树脂柱，加pH4～5.5,体积百分比30～50％乙醇水溶液洗脱2～4个柱体积后，加pH6～8，体积百分比60～80％乙醇水溶液洗脱3～6个柱体积，收集合并体积百分比为60～80％乙醇水溶液的洗脱流分，减压回收溶剂至干，得到穗花杉双黄酮富集部位，所述大孔吸附树脂为下列型号之一：AB-8、D-101、HPD-100、NKA、X-5。

(3)甲醇重结晶：步骤(2)所得穗花杉双黄酮富集部位加20～50倍重量的甲醇，调pH至7～9使其溶解，滤过，滤液调pH至1～2，静置1-2天，抽滤，所得滤饼即为穗花杉双黄酮粗品；

(4)乙醇重结晶：步骤(3)所得穗花杉双黄酮粗品加10～30倍体积百分比80～100％乙醇，水浴加热使其溶解，滤过，滤液放置1-3天，抽滤，得穗花杉双黄酮。

优选的，上述卷柏属药材为江南卷柏。

优选的，步骤(2)所用大孔吸附树脂为HPD-100型大孔吸附树脂。

优选的，步骤(2)大孔吸附树脂柱层析洗脱方法，加pH为5，40％(v/v)乙醇水溶液，洗脱3个柱体积；加pH为7，70％(v/v)乙醇水溶液，洗脱4个柱体积。

目标分离化合物穗花杉双黄酮含有多个酚羟基，具有酸性，在碱性条件下易解离。除杂洗脱溶剂为40％(v/v)乙醇水溶液，pH优选4～5.5，HPD-100型大孔树脂，在弱酸性条件下对黄酮类化合物吸附力较强，除去水溶性杂质的同时目标化合物不会发生泄露；有效段洗脱剂为70％(v/v)乙醇水溶液，pH优选为6～8，穗花杉双黄酮解吸附能力较强，减少有效段洗脱液体积，又能使穗花杉双黄酮和其他杂质得到有效分离，简化了后续纯化步骤。

优选的，步骤(3)中甲醇加入量为30～40倍。

优选的，步骤(3)中调整pH碱性试剂为氨水，调整pH酸性试剂为1mol/L盐酸。双黄酮类化合物为亲脂性化合物，在水中不溶，含有多个酚羟基，具有酸性，在碱性条件下易解离，传统“碱溶酸沉”工艺中碱性水溶液不溶，故优选溶于碱性甲醇溶液，酸性甲醇溶液条件下易析出，可有效提高目标化合物纯度。碱液浓度不易过高，以免在强碱条件下破坏黄酮母核，在加酸酸化时，酸性条件也不易过强，以免生成盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。

优选的，步骤(4)中乙醇为95％(v/v)乙醇，加入量为步骤(3)所得穗花杉双黄酮粗品质量的15～20倍。

与现有技术相比，本发明采用非极性大孔吸附树脂，特别优选HPD-100非极性大孔吸附树脂作为分离材料，采用含水乙醇-pH梯度洗脱工艺，从卷柏属植物醇提液中分离得到穗花杉双黄酮粗品，进一步通过碱性甲醇溶解酸沉及乙醇重结晶工艺分离得到高纯度的穗花杉双黄酮，含量98％以上，工艺转移率50％以上。

实施列1：大孔树脂的筛选试验

树脂预处理：取不同型号的大孔吸附树脂适量(约50g)，分别用95％乙醇浸泡4～8hr，弃去上层破碎树脂，分别装入玻璃色谱柱，95％乙醇洗3～4柱体积(BV)，洗脱至洗脱液加水无浑浊(约250ml)，再用蒸馏水洗至无醇味。预处理后树脂转移至培养皿中，晾干，备用。

卷柏醇提浓缩液制备：按已确定的最佳工艺提取卷柏药材，提取液浓缩，过滤，取滤液，即得(1g生药/ml)。

卷柏醇提浓缩液静态吸附、解吸附实验：分别精密称取以上经过预处理各种型号大孔吸附树脂适量(相当于干树脂0.5g)于100ml三角瓶中，精密移取已制备的卷柏醇提浓缩液25ml于各三角瓶中，密塞，放入恒温摇床中进行吸附，条件：25℃，100rpm，8hr。吸附结束后，减压抽滤，采用HPLC-UV法测定滤液和卷柏醇提浓缩液的穗花杉双黄酮含量，树脂用蒸馏水洗涤3次后全部转移到三角瓶中，精密移取90％(v/v)乙醇25ml于各三角瓶中，密塞，放入恒温摇床中进行解吸附，条件：25℃，100rpm，8hr。解吸附结束后，减压抽滤，HPLC-UV法测定滤液穗花杉双黄酮含量。穗花杉双黄酮大孔吸附树脂静态吸附解吸附实验结果见表1。

表1穗花杉双黄酮大孔吸附树脂静态吸附解析结果

表1结果显示，弱极性HPD-100型大孔吸附树脂的穗花杉双黄酮吸附量、解析量、解析率均较高，故选择HPD-100型大孔吸附树脂用于卷柏醇提浓缩液的柱层析分离。

实施例2：大孔吸附树脂含水乙醇-pH梯度洗脱工艺研究

采用常规大孔吸附树脂柱层析工艺，含水乙醇梯度洗脱，40％(v/v)乙醇洗脱可有效除去上样液的水溶性杂质，但目标化合物穗花杉双黄酮泄漏较为严重；进一步采用70％(v/v)乙醇洗脱时，可洗脱出目标化合物穗花杉双黄酮，洗脱8个柱体积，工艺转移率约60％。穗花杉双黄酮在树脂柱中残留较为严重；提高乙醇浓度进行纯段洗脱，虽能提高工艺转移率，但杂质不能得到有效分离。HPD-100型等大孔吸附树脂在pH弱酸条件对双黄酮类化合物吸附力较强，碱性条件下对黄酮类化合物解吸附能力较强。拟定大孔吸附树脂柱层析工艺中，通过对洗脱溶剂含水乙醇进行pH值调节，使得目标化合物穗花杉双黄酮既能和其他杂质分离又能高收率从树脂柱上洗脱下来，减少洗脱液体积，简化后续纯化步骤。试验时先以不同pH值的卷柏醇提浓缩液为上样液，以HPD-100型大孔吸附树脂对穗花杉双黄酮的吸附量为考察指标，再以不同pH值的70％(v/v)乙醇溶液作为解吸附洗脱溶剂，柱层析洗脱液中穗花杉双黄酮含量及解吸附率为考察指标，进一步采用大孔吸附树脂柱层析验证试验，确定含水乙醇-梯度pH洗脱工艺合理性及工艺参数。

1.上样液pH值考察

取5份卷柏药材醇提浓缩液，1mol/L盐酸或氨水调整pH值至4，5，6，7，8。精密称取HPD-100树脂适量(相当于干树脂0.5g)5份至100ml三角瓶中。精密移取上述不同pH值卷柏醇提浓缩液25ml置已称量树脂的三角瓶中，密塞，放入恒温摇床进行吸附，条件：25℃，100rpm，8hr，吸附结束后，减压抽滤，HPLC-UV法测定滤液和卷柏醇提浓缩液中穗花杉双黄酮含量，各pH值上样液下大孔树脂对穗花杉双黄酮的吸附量见表2。

表2不同pH值大孔吸附树脂对穗花杉双黄酮的吸附量

表2结果显示上样液pH为5时，HPD-100大孔吸附树脂对穗花杉双黄酮吸附量最大。故确定上样及除杂洗脱溶剂pH为5，目标化合物穗花杉双黄酮泄漏最少。

2.纯段洗脱溶剂pH值考察

精密称取5份预处理HPD-100大孔吸附树脂适量(相当于干树脂0.5g)于100ml三角瓶中，精密移取已制备的卷柏醇提浓缩液25ml于各三角瓶中，密塞，放入恒温摇床中进行吸附，条件：25℃，100rpm，8hr。吸附结束后，减压抽滤，

HPLC-UV法测定滤液和卷柏醇提浓缩液中穗花杉双黄酮含量，树脂用蒸馏水洗涤3次后全部转移到三角瓶中。精密移取不同pH值70％(v/v)乙醇溶液25ml于各三角瓶中，密塞，放入恒温摇床中进行解吸附，条件：25℃，100rpm，8hr。解吸附结束后抽滤，HPLC-UV法测试滤液中穗花杉双黄酮含量。不同pH值70％

(v/v)乙醇洗脱溶液对穗花杉双黄酮的解析量及解析率结果见表3。

表3不同pH值70％(v/v)乙醇对穗花杉双黄酮的解析量及解析率

表2结果显示，70％乙醇作为穗花杉双黄酮解吸附溶液，pH调整为7，8时，有效成分解吸附能力较强。

3.大孔吸附树脂柱层析验证试验

取已按照实施例制备的卷柏药材醇提浓缩液，各25ml，分别以1BV/h的速度上样于5根HPD-100大孔色谱柱(2cm×20cm，1BV＝25ml)，完全上样后，静置2h，加pH5,40％(v/v)乙醇溶液洗脱，洗脱体积3BV；分别加pH5,6,7,8,9的70％(v/v)乙醇溶液进行洗脱，洗脱体积4BV，采用HPLC-UV法检测不同pH值乙醇洗脱液中穗花杉双黄酮量及计算工艺转移率，结果见表4。

表4不同pH值70％(v/v)乙醇洗脱液中穗花杉双黄酮量及转移率

表4结果显示，纯段洗脱液为70％(v/v)乙醇，pH值7，洗脱体积为4BV,工艺转移率较高。洗脱溶剂调整pH值为8，9，部分杂质未能和有效成分分离。故确定穗花杉双黄酮纯段洗脱溶剂优选为：70％(v/v)乙醇溶液，pH值为7。

实施例3：

1.药材提取：江南卷柏药材粉碎成20目，取1Kg，加入10倍重量的85％(v/v)乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并两次提取液减压回收溶剂，得到药材醇提浓缩液，含穗花杉双黄酮13.5g。

2.大孔吸附树脂柱层析：将药材醇提浓缩液，滤过，滤液上样于HPD-100大孔吸附树脂柱，pH5,40％(v/v)乙醇水溶液洗脱3个柱体积，再用pH7,70％(v/v)乙醇水溶液洗脱4个柱体积，合并70％(v/v)乙醇水溶液洗脱的4个柱体积的流分，减压回收溶剂至干，得到穗花杉双黄酮富集部位14.7g，穗花杉双黄酮含量为70.5％。

3.甲醇重结晶：步骤(2)所得穗花杉双黄酮富集部位加穗花杉双黄酮富集部位35倍重量的甲醇，氨水调pH至7使其溶解，滤过，滤液调pH至2，静置1天，抽滤，得穗花杉双黄酮粗品10.3g，纯度89.6％。

4.乙醇重结晶：步骤(3)所得穗花杉双黄酮粗品加穗花杉双黄酮粗品15倍重量的95％(v/v)乙醇，水浴加热使其溶解，滤过，滤液放置3天，抽滤，得穗花杉双黄酮7.8g，纯度98.6％。

实施例4：

1.药材提取：江南卷柏药材粉碎成20目，取1Kg，加入8倍重量的95％(v/v)乙醇回流提取2次，每次1h，滤过，合并两次提取液减压回收溶剂，得到药材醇提浓缩液，含穗花杉双黄酮6.98g。

2.大孔吸附树脂柱层析：将药材醇提浓缩液，滤过，滤液上样于HPD-100大孔吸附树脂柱，pH5,40％(v/v)乙醇水溶液洗脱3个柱体积，再用pH7，70％(v/v)乙醇水溶液洗脱4个柱体积，合并70％(v/v)乙醇水溶液洗脱的4个柱体积的流分，减压回收溶剂至干，得到穗花杉双黄酮富集部位7.1g，穗花杉双黄酮含量为69.8％。

3.甲醇重结晶：步骤(2)所得穗花杉双黄酮富集部位加穗花杉双黄酮富集部位40倍重量的甲醇，氨水调pH至7使其溶解，抽滤，滤液调pH至2，静置1天，抽滤，得穗花杉双黄酮粗品4.9g，纯度88.5％。

4.乙醇重结晶：步骤(3)所得穗花杉双黄酮粗品加20倍重量的85％乙醇，水浴加热使其溶解，抽滤，滤液放置3天，抽滤，得穗花杉双黄酮3.6g，纯度98.2％。

Claims (7)

1.一种从卷柏属植物中提取分离穗花杉双黄酮的方法，所述方法如下：

（1）药材提取：将卷柏属药材，粉碎，加体积百分比70~95 %乙醇水溶液回流提取或50~80℃温浸搅拌提取，提取2~3次，每次提取1~3 hr，合并醇提液，减压回收溶剂，得卷柏属药材醇提浓缩液；

（2）大孔吸附树脂柱层析：将卷柏属药材醇提浓缩液，过滤，滤液上样于大孔吸附树脂柱，加pH4~5.5，体积百分比30~50%乙醇水溶液洗脱2~4个柱体积后，加pH6~8，体积百分比60~80%乙醇水溶液洗脱3~6个柱体积，收集合并体积百分比为60~80%乙醇水溶液的洗脱流分，减压回收溶剂至干，得到穗花杉双黄酮富集部位，所述大孔吸附树脂为下列之一：AB-8、D-101、HPD-100、NKA、X-5；

（3）甲醇重结晶：步骤（2）所得穗花杉双黄酮富集部位加20~50倍甲醇，调pH至7~9使其溶解，滤过，滤液调pH至1~2，静置1-2天，抽滤，所得滤饼即为穗花杉双黄酮粗品；

（4）乙醇重结晶：步骤（3）所得穗花杉双黄酮粗品加10~30倍体积百分比80~100%乙醇，水浴加热使其溶解，滤过，滤液放置1-3天，抽滤，得穗花杉双黄酮。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所用大孔吸附树脂为HPD-100型大孔吸附树脂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）大孔吸附树脂柱柱层析洗脱方法，加pH为5，40% (v/v)乙醇水溶液，洗脱3个柱体积后加pH为7，70% (v/v)乙醇水溶液，洗脱4个柱体积。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中调整PH碱性试剂为氨水，调整pH酸性试剂为1mol/L盐酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中甲醇加入量为30~40倍。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中乙醇为体积浓度为95%的乙醇，加入量为15~20倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述卷柏属药材为江南卷柏。