CN115850295B - 一种双酮类化合物八角莲双黄酮a-e的制备方法及其应用 - Google Patents
一种双酮类化合物八角莲双黄酮a-e的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及双酮类化合物八角莲双黄酮A‑E的制备方法及其应用，可有效解决从八角莲中制备双黄酮类化合物八角莲双黄酮A‑E，实现在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用问题。该化合物是从八角莲药材中分离得到，八角莲双黄酮A‑E对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性，实现在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用，本发明原料丰富，制备方法易操作，可有效用于制备抗阿尔茨海默症药物，开拓了八角莲药材的新用途，有显著的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法及其应用。
背景技术
阿尔茨海默症是老年人群中发病率仅次于心脑血管疾病和癌症的常见疾病，以记忆、认知能力和生活自理能力渐行性下降为主要特征。随着中国人口老龄化进程的加快，神经退行性疾病患者人数激增，尤其是阿尔茨海默病和相关痴呆症。2019年，中国阿尔茨海默病和相关痴呆症患者数已超过1300万，占全球的四分之一。阿尔茨海默症的发病率和死亡率稳步上升，目前已成为中国城乡居民的第五大死因，并加重了个人、家庭和社会的经济负担。目前临床上治疗药物仍以乙酰胆碱酯酶抑制剂为主，且存在肝毒性、心血管不良反应、胃肠道反应等缺点。因此寻找结构新颖、高效低毒的乙酰胆碱酯酶抑制剂依然是药学科研工作者迫切解决的技术问题。
八角莲是小檗科八角莲(Dysosma versipellis)的干燥根茎。在我主要分布在浙江、广西、湖北、湖南、四川、贵州等地。具有清热解毒、化痰散结、祛痛消肿之效。临床上常用于治疗跌打损伤、半身不遂、关节酸痛、毒蛇咬伤、疮痈肿毒、尖锐湿疣、流行性出血热、乙型脑炎、淋巴结炎、腮腺炎、乳腺癌、食道癌及其他的炎症疾病等。八角莲中含有大量的芳基萘内酯型木脂素和黄酮类化合物(包括双黄酮类)，且天然来源的双黄酮类化合物具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、镇痛、抗凝血等药理作用。本发明所涉及的双黄酮类化合物制备方法及其生物活性，迄今为止未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法及其应用，可有效解决从八角莲中制备双黄酮类化合物八角莲双黄酮A-E，实现在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，这些化合物是从八角莲药材中分离得到，分子结构式为：
制备方法是：
以八角莲药材20–40kg为原料，加入3–5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92–95℃，每次提取时间为1–1.5小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入3–5倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为92–95℃，提取时间为1–1.5小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物，加入重量体积为提取物重量2倍的无水乙醇溶解，重量体积是指固体以kg计，液体以L计，再加入重量体积为提取物2倍的硅藻土吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入重量体积为提取物3倍的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用30L–60L洗脱液，流速为50–70mL/min，每5L–10L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5经sephadex LH-20柱色谱分离，2.5L–5L甲醇洗脱，流速为5–10mL/min，每100mL–200mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用1.5L–3L洗脱液，流速为15–25mL/min，每250mL–500mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1(化合物2，即八角莲双黄酮B)、亚组份M5–8–5–2、亚组份M5–8–5–3、亚组份M5–8–5–4(化合物3，即八角莲双黄酮C)；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5(即八角莲双黄酮E)和化合物1(即八角莲双黄酮A)；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4(即八角莲双黄酮D)。
本发明方法制备的双黄酮类化合物，即八角莲双黄酮A-E，对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性，实现在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。
本发明原料丰富，制备方法易操作，可有效从八角莲药材中制备八角莲双黄酮A-E。八角莲双黄酮A-E具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，可有效用于制备抗阿尔茨海默症药物，开拓了八角莲药材的新用途，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明的分子结构式图。
图2为本发明八角莲双黄酮A的1H NMR谱图(500MHz)。
图3为本发明八角莲双黄酮A的13C NMR谱图(125MHz)。
图4为本发明八角莲双黄酮A的HR-ESI-MS谱图。
图5为本发明八角莲双黄酮B的1H NMR谱图(500MHz)。
图6为本发明八角莲双黄酮B的13C NMR谱图(125MHz)。
图7为本发明八角莲双黄酮B的HR-ESI-MS谱图。
图8为本发明八角莲双黄酮C的1H NMR谱图(500MHz)。
图9为本发明八角莲双黄酮C的13C NMR谱图(125MHz)。
图10为本发明八角莲双黄酮C的HR-ESI-MS谱图。
图11为本发明八角莲双黄酮D的1H NMR谱图(500MHz)。
图12为本发明八角莲双黄酮D的13C NMR谱图(125MHz)。
图13为本发明八角莲双黄酮D的HR-ESI-MS谱图。
图14为本发明八角莲双黄酮E的1H NMR谱图(500MHz)。
图15为本发明八角莲双黄酮E的13C NMR谱图(125MHz)。
图16为本发明八角莲双黄酮E的HR-ESI-MS谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，这些化合物是从八角莲药材中分离得到，分子结构式为：
制备方法是：
以八角莲药材40kg为原料，加入3倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入3倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为95℃，提取时间为1小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物5.4kg，加入无水乙醇10.8L溶解，再硅藻土10.8kg吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入16.2L的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位(3.4kg)经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用60L洗脱液，流速为70mL/min，每10L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5 110.0g经sephadex LH-20柱色谱分离，5L甲醇洗脱，流速为10mL/min，每200mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8(42.5g)经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用3L洗脱液，流速为25mL/min，每500mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5(1.07g)经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1(化合物2，即八角莲双黄酮B，8.5mg)、亚组份M5–8–5–2(78.2mg)、亚组份M5–8–5–3(90.1mg)、亚组份M5–8–5–4(化合物3，即八角莲双黄酮C，12.9mg)；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5(即八角莲双黄酮E，6mg)和化合物1(即八角莲双黄酮A，9.4mg)；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4(即八角莲双黄酮D，5.5mg)。
实施例2
本发明一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，包括以下步骤：
以八角莲药材20kg为原料，加入5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入5倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为92℃，提取时间为1.5小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物2.7kg，加入无水乙醇5.4L溶解，再加入硅藻土5.4kg吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入8.1L的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用30L洗脱液，流速为50mL/min，每5L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5 55.0g经sephadex LH-20柱色谱分离，2.5L甲醇洗脱，流速为5mL/min，每100mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8(21.2g)经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用1.5L洗脱液，流速为15mL/min，每250mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5(5.33g)经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1(化合物2，即八角莲双黄酮B，4.2mg)、亚组份M5–8–5–2(39.1mg)、亚组份M5–8–5–3(45.0mg)、亚组份M5–8–5–4(化合物3，即八角莲双黄酮C，6.4mg)；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5(即八角莲双黄酮E，3mg)和化合物1(即八角莲双黄酮A，4.7mg)；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4(即八角莲双黄酮D，2.7mg)。
实施例3
本发明一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，包括以下步骤：
以八角莲药材30kg为原料，加入4倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，每次提取时间为1.2小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入4倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为93℃，提取时间为1.2小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物4.0kg，加入无水乙醇8.0L溶解，再加入硅藻土8.0kg吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入12L的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位(2.5kg)经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用45L洗脱液，流速为60mL/min，每7.5L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5 82.5g经sephadex LH-20柱色谱分离，3.75L甲醇洗脱，流速为7mL/min，每150mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8(31.8g)经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用2.25L洗脱液，流速为20mL/min，每375mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5(0.8g)经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1(化合物2，即八角莲双黄酮B，6.3mg)、亚组份M5–8–5–2(58.6mg)、亚组份M5–8–5–3(67.5mg)、亚组份M5–8–5–4(化合物3，即八角莲双黄酮C，9.6mg)；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5(即八角莲双黄酮E，4.5mg)和化合物1(即八角莲双黄酮A，7.0mg)；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4(即八角莲双黄酮D，4.1mg)。
本发明实施例1-3所述方法制备的化合物经IR、UV、核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)、及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术鉴定，化合物1-5分别被鉴定为八角莲双黄酮A[dysosmabiflavonoid A]、八角莲双黄酮B[dysosmabiflavonoid B]、八角莲双黄酮C[dysosmabiflavonoid C]、八角莲双黄酮D[dysosmabiflavonoid D]、八角莲双黄酮E[dysosmabiflavonoid E]。有关图谱见图2-16所示。实验表明，本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用，可有效用于制备抗阿尔茨海默症药物，有关资料如下：
一、化合物的结构鉴定
化合物1为黄色无定形粉末。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:[M+H]+587.0806(计算值为587.0826)，确定其分子式为C30H18O13，不饱和度为12。红外光谱显示存在两个羰基(1726,1635cm-1)、羟基(3374cm-1)、苯环(1607,1512cm-1)，以及叔醇基(1179cm-1)。紫外光谱给出黄酮醇的特征性最大吸收275nm、360nm。1H NMR谱(表1)给出四组芳环偶合系统，包括一个对位二取代苯基δH 8.08(2H,d,J＝8.5Hz)、6.94(2H,d,J＝8.5Hz)，一个五取代苯基δH7.01(1H,s),一个1,3,4-三取代苯基δH 6.89(1H,s)、6.72(1H,d,J＝8.6Hz)、6.75(1H,d,J＝8.6Hz)，以及一个1,2,3,5-四取代苯基δH 5.86(1H,s)、5.78(1H,s)。13C NMR谱(表2)与HSQC谱给出两个羰基δC 176.6(为黄酮醇特征性羰基)、190.1(为二氢黄酮醇特征性羰基)、四个苯环、两个连氧烯碳δC 147.8,136.1、两个脂肪季碳δC 117.6,79.1。由对位取代苯基上的质子δH8.08(2H,d,J＝8.5Hz,H-2″′,6″′)与连氧烯碳C-2″(δC 147.8)的HMBC的远程相关,以及一个五取代苯基氢信号δH 7.01(1H,s)，提示化合物1含有山柰酚结构单元。由1,3,4-三取代苯基的氢信号δH 6.89(1H,s,H-2′)、6.75(1H,d,J＝8.6Hz,H-6′)与连氧脂肪季碳C-2(δC 117.6)的HMBC远程相关，一个1,2,3,5-四取代苯基δH 5.86(1H,s),5.78(1H,s)，以及两个脂肪季碳信号δC 117.6,79.1，提示另一个结构单元为二氢槲皮素结构片段。将化合物1的13C NMR数据与山柰酚的对比发现，山柰酚的C-5、C-6、C-7与化合物1相应位置的13C NMR数据差异明显[化合物1：δC 156.8(C-5″)、110.3(C-6″)、164.3(C-7″)；山柰酚：δC 160.7(C-5)、98.2(C-6)、163.9(C-7)]。由一个二连氧脂肪季碳信号δ117.6(C-2)与一个单连氧脂肪季碳信号δ79.1(C-3)，提示山柰酚结构单元和二氢槲皮素结构单元通过一个醚桥C-2-O-C-7″和一个C-3-C-6″键相连。对化合物1的NMR数据进行归属，具体见表1和2。因此，化合物1的结构确定为3,5,7,3′,4′-pentahydroxyflavanone-(2-O-7″:3-6″)-3″,5″,4″′-trihydroxyflavone,命名为(+)八角莲双黄酮A[dysosmabiflavonoid A]，分子结构式为：
化合物2为黄色无定形粉末。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:[M+H]+587.0824(计算值为587.0826)，确定其分子式为C30H18O13，不饱和度为12。与化合物1相比，它们的1HNMR和13C NMR数据基本相似，不同之处在于化合物2中的槲皮素和二氢山柰酚结构单元代替了化合物1中相应的山柰酚和二氢槲皮素结构单元。这也由1,3,4-三取代苯基氢信号δH7.72(1H,d,J＝1.9Hz,H-2″′)、7.58(1H,dd,J＝8.5,1.9Hz,H-6″′)与连氧烯碳C-2″(δC148.0)的HMBC远程相关，对位取代苯基氢信号δH 7.28(2H,d,J＝8.7Hz,H-2′,6′)与连氧脂肪季碳信号C-2(δC 117.8)的HMBC远程相关所证实。对化合物2的NMR数据进行归属，具体见表1和2。因此，化合物2的结构确定为3,5,7,4′-tetrahydroxyflavanone-(2-O-7″:3-6″)-3″,5″,3″′,4″′-tetrahydroxyflavone，命名为八角莲双黄酮B[dysosmabiflavonoid B]，分子结构式为：
化合物3与4为黄色无定形粉末。根据它们的HR-ESI-MS数据(化合物3：m/z587.0808[M+H]+；化合物4：m/z 587.0800[M+H]+)，确定它们的分子式均为C30H18O13。化合物3与4的1H NMR、13C NMR数据分别化合物1与2相似，不同之处在于一个芳香碳和一个芳香氢的化学位移值有差异[化合物3：δC 94.8(C-6″)、δH 6.71(1H,s,H-6″)，化合物1：δC 91.1(C-8″)、δH 7.01(1H,s,H-8″)；化合物4：δC 94.7(C-6″)、δH 6.69(1H,s,H-6″)，化合物2：δC91.1(C-8″)、δH 7.00(1H,s,H-8″)]。由化合物3的山柰酚结构单元中碳谱数据δC 94.8(C-6″)、164.9(C-7″)、106.3(C-8″)到山柰酚相应位置的碳谱数据δC 98.2(C-6)、163.9(C-7)、93.5(C-8)的变化，以及化合物4的槲皮素结构单元的碳谱数据δC 94.7(C-6″)、164.8(C-7″)、106.1(C-8″)到槲皮素相应位置的碳谱数据δC 98.6(C-6)、164.3(C-7)、93.8(C-8)的变化，说明在化合物3的山柰酚结构单元和化合物4的槲皮素结构单元的C-7、C-8位被取代。对化合物3和4的NMR数据进行归属，具体见表1和2。因此，化合物3和4的结构分别鉴定为3,5,7,3′,4′-pentahydroxyflavanone-(2-O-7″:3-8″)-3″,5″,4″′-trihydroxyflavone、3,5,7,3′,4′-pentahydroxyflavanone-(2-O-7″:3→8″)-3″,5″,4″′-trihydroxyflavone，分别命名为八角莲双黄酮C[dysosmabiflavonoid C]、八角莲双黄酮D[dysosmabiflavonoid D]，分子结构式为：
化合物5为黄色无定形粉末。它的1H NMR与13C NMR数据与化合物4相似，不同之处在于化合物5中的1,3,4-三取代苯基δH 6.89(1H,d,J＝2.0Hz)、6.73(1H,d,J＝8.3Hz)、6.76(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz)代替化合物4中的1,4-二取代苯基。这也被它们的HRESIMS数据所证实，化合物5给出一个[M+H]+准分子离子峰m/z 603.0752(calcd.603.0775)，比化合物4多了16个质量单位。由芳香氢δH 6.89(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′)、6.76(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz,H-6′)与连氧脂肪季碳C-2(δ117.8)的HMBC远程相关，一个1,2,3,5-四取代苯基δH5.76(1H,s),5.73(1H,s),以及两个连氧脂肪季碳信号δC 117.8,79.9，提示化合物5中二氢槲皮素结构单元的存在。对化合物5的NMR数据进行归属，具体见表1和2。因此，化合物5被鉴定为3,5,7,3′,4′-pentahydroxyflavanone-(2-O-7″:3-8″)-3″,5″,3″′,4″′-tetrahydroxyflavone、命名为八角莲双黄酮E[dysosmabiflavonoid E]，分子结构式为：
表1.化合物1–5的1H NMR数据
表2.化合物1–5的13C NMR数据
| NO. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 2 | 117.6C | 117.8C | 117.8C | 117.7C | 117.8C |
| 3 | 79.1C | 79.2C | 79.9C | 79.9C | 79.9C |
| 4 | 190.1C | 190.7C | 191.0C | 190.5C | 191.0C |
| 5 | 163.3C | 163.4C | 163.5C | 163.5C | 163.5C |
| 6 | 97.5CH | 96.9CH | 97.0CH | 97.1CH | 97.0CH |
| 7 | 168.9C | 167.8C | 167.9C | 168.1C | 167.9C |
| 8 | 95.4CH | 95.1CH | 95.3CH | 95.3CH | 95.3CH |
| 9 | 160.4C | 160.4C | 160.6C | 160.3C | 160.6C |
| 10 | 97.8C | 98.4C | 98.6C | 98.3C | 98.6C |
| 1′ | 123.9C | 123.7C | 123.7C | 123.4C | 123.7C |
| 2′ | 114.5CH | 128.8CH | 114.5CH | 128.3CH | 114.5CH |
| 3′ | 144.6C | 115.2CH | 144.7C | 114.8CH | 144.7C |
| 4′ | 146.8C | 159.1C | 146.9C | 158.7C | 146.9C |
| 5′ | 114.9CH | 115.2CH | 115.5CH | 114.8CH | 115.1CH |
| 6′ | 118.1CH | 128.8CH | 118.2CH | 128.3CH | 118.2CH |
| 2″ | 147.8C | 148.0C | 147.5C | 147.5C | 147.5C |
| 3″ | 136.1C | 136.2C | 136.1C | 136.0C | 136.1C |
| 4″ | 176.6C | 176.6C | 176.3C | 176.2C | 176.2C |
| 5″ | 156.8C | 156.9C | 163.9C | 163.8C | 163.8C |
| 6″ | 110.3C | 110.0C | 94.8CH | 94.7CH | 94.7CH |
| 7″ | 164.3C | 164.3C | 164.9C | 164.8C | 164.8C |
| 8″ | 91.1CH | 91.1CH | 106.3C | 106.1C | 106.1C |
| 9″ | 157.2C | 157.2C | 151.2C | 151.5C | 151.2C |
| 10″ | 105.6C | 105.7C | 105.2C | 105.2C | 105.2C |
| 1″′ | 121.3C | 121.6C | 121.4C | 121.7C | 121.7C |
| 2″′ | 129.7CH | 115.3CH | 130.2CH | 116.6CH | 116.2CH |
| 3″′ | 115.5CH | 145.2C | 115.3CH | 145.4C | 144.9C |
| 4″′ | 159.6C | 148.2C | 159.6C | 148.1C | 148.1C |
| 5″′ | 115.5CH | 115.7CH | 115.3CH | 115.3CH | 115.3CH |
| 6″′ | 129.7CH | 120.2CH | 130.2CH | 120.5CH | 120.5CH |
二、乙酰胆碱酯酶抑制活性试验(以实施例3为例)
(一)实验方法
1.用磷酸盐缓冲液(每100mL磷酸盐缓冲液中含0.1M Na2HPO4溶液94.7mL；0.1MNaH2PO4溶液5.3mL，调pH至8.0)将AChE稀释成0.1U/mL工作液；
2.碘化硫代乙酰胆碱和DTNB用磷酸盐缓冲液配成6.25mM的溶液(工作液)；
3.化合物用DMSO稀释成浓度梯度。阳性对照药为他克林，用DMSO稀释成浓度梯度；阴性对照组(NC组)为2％ DMSO溶剂对照。
4.反应在96孔板中进行，铺板按200uL/体系，每个样品做3个重复；
(1)化合物和他克林浓度梯度的设定(用1％ DMSO稀释)：
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(2)铺板：200uL/体系，每孔内DMSO的终浓度均为0.1％，每个样本做3个复孔。
5.加入显色剂和底物后1小时内，每30秒钟检测一次405nm吸光值。
6.选择NC组吸光值平均值约为1时的样品吸光值，计算化合物吸光值平均值(化合物测定值-背景值)，并按照(NC-化合物吸光值平均值)/NC*100％来计算化合物AChE抑制率。
在对实施例3实验的同时，对其它实施例也作了相同的实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。
(二)实验结果
八角莲双黄酮A-E(1-5)对乙酰胆碱酯酶具有较强的抑制活性，具体见表3。
表3.所有分离化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
本发明通过反复大量的实验证实，双黄酮类化合物由于母核及其所连接取代基的位置、数目、种类、以及黄酮结构单元连接方式的不同，其乙酰胆碱酯酶的抑制活性会存在很大的差异，本发明方法制备出的八角莲双黄酮A-E(化合物1-5)对乙酰胆碱酯酶具有较强的抑制活性，具有制备临床上抗阿尔茨海默症药物的前景，开拓了八角莲的药用价值，并为制备抗阿尔茨海默症药物提供了技术支持，是制备抗阿尔茨海默症药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
Claims (5)
1.一种双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，其特征在于，该化合物是从八角莲药材中分离得到，分子结构式为：
制备方法是：
以八角莲药材20–40kg为原料，加入3–5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92–95℃，每次提取时间为1–1.5小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入3–5倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为92–95℃，提取时间为1–1.5小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物，加入重量体积为提取物重量2倍的无水乙醇溶解，重量体积是指固体以kg计，液体以L计，再加入重量体积为提取物2倍的硅藻土吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入重量体积为提取物3倍的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用30L–60L洗脱液，流速为50–70mL/min，每5L–10L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5经sephadex LH-20柱色谱分离，2.5L–5L甲醇洗脱，流速为5–10mL/min，每100mL–200mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用1.5L–3L洗脱液，流速为15–25mL/min，每250mL–500mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1即八角莲双黄酮B、亚组份M5–8–5–2、亚组份M5–8–5–3、亚组份M5–8–5–4即八角莲双黄酮C；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5，即八角莲双黄酮E和化合物1，即八角莲双黄酮A；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4，即八角莲双黄酮D。
2.根据权利要求1所述的双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，其特征在于，以八角莲药材40kg为原料，加入3倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入3倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为95℃，提取时间为1小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物5.4kg，加入无水乙醇10.8L溶解，再硅藻土10.8kg吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入16.2L的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用60L洗脱液，流速为70mL/min，每10L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5 110.0g经sephadex LH-20柱色谱分离，5L甲醇洗脱，流速为10mL/min，每200mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用3L洗脱液，流速为25mL/min，每500mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1即八角莲双黄酮B、亚组份M5–8–5–2、亚组份M5–8–5–3、亚组份M5–8–5–4即八角莲双黄酮C；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5，即八角莲双黄酮E和化合物1，即八角莲双黄酮A；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4，即八角莲双黄酮D。
3.根据权利要求1所述的双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，其特征在于，以八角莲药材20kg为原料，加入5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入5倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为92℃，提取时间为1.5小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物2.7kg，加入无水乙醇5.4L溶解，再加入硅藻土5.4kg吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入8.1L的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用30L洗脱液，流速为50mL/min，每5L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5 55.0g经sephadex LH-20柱色谱分离，2.5L甲醇洗脱，流速为5mL/min，每100mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用1.5L洗脱液，流速为15mL/min，每250mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1八角莲双黄酮B、亚组份M5–8–5–2、亚组份M5–8–5–3、亚组份M5–8–5–4八角莲双黄酮C；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5，八角莲双黄酮E和化合物1，八角莲双黄酮A；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4，八角莲双黄酮D。
4.根据权利要求1所述的双酮类化合物八角莲双黄酮A-E的制备方法，其特征在于，以八角莲药材30kg为原料，加入4倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，每次提取时间为1.2小时，减压回收95％乙醇，得浸膏状95％乙醇提取物；药渣加入4倍原料重量、体积浓度为50％的乙醇加热回流提取1次，提取温度为93℃，提取时间为1.2小时，减压回收50％乙醇，得浸膏状50％乙醇提取物；合并95％乙醇提取物和50％乙醇提取物4.0kg，加入无水乙醇8.0L溶解，再加入硅藻土8.0kg吸附，回收溶剂后，将载有提取物的硅藻土装入玻璃柱，依次加入12L的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脱，回收溶剂，得二氯甲烷洗脱部位、乙酸乙酯洗脱部位、甲醇洗脱部位；将甲醇洗脱部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用45L洗脱液，流速为60mL/min，每7.5L为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比4:5的石油醚-丙酮和体积比5:2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–12、流份13–24、流份25–30、流份31–36、流份37–38、流份39–42、流份43–44、流份45–48、流份49–54，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8、Fr.9；
组份Fr.5 82.5g经sephadex LH-20柱色谱分离，3.75L甲醇洗脱，流速为7mL/min，每150mL为一流份，收集25个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–3、流份4–5、流份6–7、流份8–10、流份11–13、流份14–17、流份19–21、流份22–25，得到亚组份M5–1～M5–8；亚组份M5–8经硅胶柱色谱分离，石油醚–丙酮混合溶剂系统梯度洗脱，体积比为100:10、100:20、100:30、100:40、100:50、100:70、1:1、1:2、1:3，每一梯度用2.25L洗脱液，流速为20mL/min，每375mL为一流份，收集54个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，分别合并流份1–6、流份7–12、流份13–18、流份19–25、流份26–30、流份31–36、流份37–42、流份43–48、流份49–54，得到亚组份M5–8–1～M5–8–9；亚组份M5–8–5经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为55:35的甲醇-水混合溶剂洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为37.4min、46.0min、72.2min、77.0min的色谱峰，得到亚组份M5–8–5–1八角莲双黄酮B、亚组份M5–8–5–2、亚组份M5–8–5–3、亚组份M5–8–5–4八角莲双黄酮C；
亚组份M5–8–5–2经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为45:55的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，分别收集保留时间为25.7min、29.1min的色谱峰、得到化合物5，即八角莲双黄酮E和化合物1，即八角莲双黄酮A；
亚组份M5–8–5–3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为43:57的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，流速为3mL/min，收集保留时间为26.9min的色谱峰，得到化合物4，即八角莲双黄酮D。
5.权利要求1-4任一项所述方法制备的八角莲双黄酮A-E在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。
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