CN105362315B - 一种东革阿里提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种东哥阿里提取物的制备方法及其用途，所述制备方法包括以下步骤：选取东哥阿里根药材，采用水进行提取，得提取液；提取液上大孔树脂柱，先用水洗脱，再用20‑50％乙醇洗脱，收集相应乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。所述东哥阿里提取物中含有东革酮、东革醇、东革醇苷、13β，21‑二羟基东革酮和14，15β‑二羟基克莱尼酮等五种主要苦木素类成分，其中东革酮、东革醇、东革醇苷三种成分含量大于20％。本发明所述制备工艺完整保留了东革阿里水提物中的苦木素类有效成分，并具有生产工艺简洁、产品质量可控等显著优点。所述东哥阿里提取物具有优良抗肿瘤、抗炎作用，可应用于制备相关功效的药品或保健食品。
Description
技术领域
本发明涉及一种东哥阿里提取物的制备方法，本发明同时涉及该提取物在抗肿瘤和抗炎功效方面的应用，属保健食品与生物医药领域。
技术背景
东革阿里(Eurycoma longifolia)是生长在东南亚一带的一种灌木植物，主产于马来西亚(称为Tongkat Ali)。在东南亚，东革阿里主要以根入药，长期以来都作为能量滋补药、退热药、催情药和蛇毒解药等药物使用，被誉为马来参、天然伟哥。现代研究表明，东革阿里具有改善男性性功能障碍抗疟疾、抗糖尿病、抗癌和退热等功效，其主要活性成分为苦木素(quassinoid)类二萜，此外还含有生物碱、木脂素、三萜等类成分[(1)RajeevBhat.Tongkat Ali(Eurycoma longifolia Jack)：A review on its ethnobotany andpharmacological importance，Fitoterapia，2010，81：669-679；(2)Lee Suan Chua，LC-MS/MS-based metabolites of Eurycoma longifolia(Tongkat Ali)in Malaysia(Perakand Pahang).Journal of Chromatography B，2011，879：3909-3919]。
现有的东革阿里提取物市售品一般为水提物，其中指标成分东革阿里酮(eurycomanone)含量约为1-3％，但其有效成分含量低，服用剂量相对较大。Kit-Lam Chan等报道，东革阿里根采用甲醇60度浸提5天，提取液浓缩后再采用Diaion HP 20树脂经甲醇-水梯度洗脱，精制获得的苦木素类组分F2中含有东革酮(7.16-7.34％)、东革醇(5.0-5.31％)、东革醇苷(9.08-9.70％)，以及13α，21-环氧东革酮(1.44-1.75％)、13α，21-二氢东革酮(0.45-0.51％)等主成分[Kit-Lam Chan，Developing a validated liquidchromatography-mass spectrometric method for the simultaneous analysis offive bioactive quassinoid markers for the standardization of manufacturedbatches of Eurycoma longifolia Jack extract as antimalarialmedicaments.Journal of Chromatography A，2011，1218；1861-1877]。该工艺可获得富含高纯度苦木素的东革阿里提取物，但选用甲醇有机溶剂浸提，与传统使用的水提物在物质组成方面有一定差异，并存在生产周期长、效率低等不足之处。为此，本发明拟对东革阿里提取物的有效成分进行研究，并在此基础上建立一种生产工艺可行、质量可控的先进制备工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产工艺和质量可控的东革阿里提取物。
本发明提供的东革阿里提取物由以下步骤制备获得：
(1)选取东革阿里根药材，采用水进行提取，提取液合并，得东革阿里提取液；
(2)由(1)所得东革阿里提取液，上大孔树脂柱进行吸附，先用水洗脱，再用20-50％乙醇洗脱，收集20-50％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
所述工艺步骤(1)选用东革阿里根，并可根据需要适当切片；所述水提取温度为60-100度，用量为原药材的20-60倍，提取方式为回流提取或渗漉提取，提取时间为每次1-8小时，共提取2-3次。提取液可根据需要进行适当浓缩，优选方式为不进行浓缩。
所述工艺步骤(2)中所述大孔树脂优选弱极性苯乙烯型大孔树脂；洗脱时先用水洗脱除去杂质，再用20-50％乙醇洗脱，其中优选采用30-40％乙醇进行洗脱。
采用HPLC分析，所述东革阿里提取物中含有东革酮、东革醇、东革醇苷、13β，21-二羟基东革酮和14，15β-二羟基克莱尼酮等五种主要苦木素类成分。其中，东革酮、东革醇、东革醇苷三种成分含量总和大于20％；13β，21-二羟基东革酮含量大于1％，14，15β-二羟基克莱尼酮含量大于1％。此外，进一步分离鉴定研究结果表明，所述东革阿里提取物中还含有13α，21-二氢东革酮、13β，21-二羟基东革醇、龙革内酯、Δ4，5，14-羟基乐园树醇、Δ4，16，6α-羟基异东革内酯E、13β，18-二氢东革醇等六种成分。
本发明进一步公布一种高纯度东革阿里提取物的制备方法，特征在于所述工艺步骤(2)中东革阿里提取物进一步用10-15％甲醇溶解，上样于反相碳十八柱，依次用10-15％、40-60％甲醇洗脱，收集40-60％甲醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。所述高纯度东革阿里提取物中，东革阿里酮、东革阿里醇、东革阿里醇苷三种成分含量大于40％，13β，21-二羟基东革阿里酮含量大于2％，14，15β-二羟基克莱尼酮含量大于2％。
本发明遵循东革阿里水提取物传统使用工艺，并选用大孔树脂工艺对其苦木素类组分进行精制。研制过程中发现，该类组分水溶性强，在树脂工艺精制中优选低浓度乙醇洗脱，可以除去主要的低级性杂质，提高产品纯度。在此基础上，选用水提取液直接通过大孔树脂柱吸附，从而避免了提取液浓缩工序带来的高能耗、有效成分降解、含量降低等不利因素。通过反相硅胶柱层析等系统分离纯化实验研究，证实本发明工艺获得的东革阿里提取物中含有东革酮、东革醇、东革醇苷、13β，21-二羟基东革酮和14，15β-二羟基克莱尼酮等五种主要苦木素类成分，其中13β，21-二羟基东革酮和14，15β-二羟基克莱尼酮仅在本发明提取物中发现含量较高(大于1％)，同时本发明提取物中还含有13α，21-二氢东革酮等六种成分。需要指出，本发明所述东革阿里提取物中未发现13α，21-环氧东革酮，该成分在东革阿里甲醇提取物中含量较高。这些成分差异表明，不同提取溶剂和工艺对终产品的成分组成有显著影响。综上所述，本发明所述制备工艺完整保留了东革阿里水提物中的苦木素类有效成分，并具有生产工艺简洁、产品质量可控等显著优点。
本发明同时对所述东革阿里提取物(ELQE)的抗肿瘤和抗炎作用进行了考察。研究结果表明，东革阿里提取物中含有α，β不饱和烯酮结构的苦木素类化合物如东革酮、13β，21-二羟基东革酮、14，15β-二羟基克莱尼酮等对A549人非小细胞肺癌细胞等5种人肿瘤细胞株均有显著抑制作用；ELQE(100、200mg/kg)对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症有显著抑制作用。结果表明所述东革阿里提取物具有明确的抗肿瘤、抗炎等作用，因而可以应用于具有抗肿瘤和抗炎功能的相关药物或保健食品中。
本发明内容通过大量实验研究和工艺优化分析完成，并对提取物中主要苦木素类活性成分进行了分离纯化和结构鉴定和定量分析。所述东革阿里提取物具有有效成分含量高、制备工艺容易产业化、产品质量可控等显著优势。以下述具体实施例进行说明。
附图说明
附图为实施例1中东革阿里提取物的液相色谱图。图中，色谱峰1-5依次为13β，21-二羟基东革酮(1)、东革酮(2)、东革醇苷(3)、东革醇(4)和14，15β-二羟基克莱尼酮(5)。
具体实施方式
本发明所述的东革阿里提取物是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。
实施例1：东革阿里提取物的制备
东革阿里根于2014年购自马来西亚(批次EL20141001)，经鉴定为东革阿里(Eurycoma longifolia Jack)干燥根。
东革阿里提取物的制备：
(1)称取15kg东革阿里根药材，切片，加入20倍量水回流提取2次，每次提取时间2h，提取液合并，过滤，得东革阿里提取液；
(2)由(1)所得东革阿里提取液，上AB-8型大孔树脂(柱体积20L/BV)，依次用5BV水、4BV 30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得东革阿里提取物(CLQE)120g。
含量测定：采用Agilent 1260Infinity Series高效液相色谱仪，ELSD检测器；色谱柱为Cosmosil AR-II-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～20min，20％B→40％B；20～25min，40％B→95％B)；流速1mL·min-1，柱温35℃。采用外标两点法，测得CLQE样品中主要成分1-5的含量依次为13β，21-二羟基东革酮(1.47％)、东革酮(14.49％)、东革醇苷(5.98％)、东革醇(17.06％)、14，15β-二羟基克莱尼酮(1.74％)。
CLQE的HPLC色谱图参见附图。
实施例2：东革阿里提取物的制备
选用药材来源同实施例1。东革阿里提取物的制备：
(1)称取15kg东革阿里根药材，切片，分别加入20、20、15倍量水于60度提取3次，每次提取时间8h，提取液合并，过滤，得东革阿里提取液；
(2)由(1)所得东革阿里提取液，上HPD-450型大孔树脂(柱体积20L/BV)，依次用5BV水、3BV 50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得东革阿里提取物155g。
含量测定：采用实施例1方法，测得本批次东革阿里提取物样品中主要成分1-5的含量依次为13β，21-二羟基东革酮(1.14％)、东革酮(13.05％)、东革醇苷(4.53％)、东革醇(13.18％)、14，15β-二羟基克莱尼酮(1.32％)。
实施例3：东革阿里提取物的制备
高纯度东革阿里提取物的制备：选取实施例1中CLQE样品10g，用10％甲醇50ml溶解，上Daisogel RP-18柱(40-60μm，柱体积500ml)，用10％甲醇1.5L洗脱，再用60％甲醇1.5L洗脱，收集60％甲醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得高纯度东革阿里提取物6.4g。
含量测定：采用实施例1方法，测得本批次东革阿里提取物样品中主要成分1-5的含量依次为13β，21-二羟基东革酮(2.06％)、东革酮(20.71％)、东革醇苷(9.15％)、东革醇(23.69％)、14，15β-二羟基克莱尼酮(2.44％)。
实施例4：东革阿里提取物中的化合物分离鉴定
选取实施例1中CLQE样品70g，用15％甲醇500ml溶解，上Daisogel RP-18柱(40-60μm，柱体积4L)中压制备色谱，用15％→40％甲醇梯度洗脱240min，流速100ml/min。采用HPLC分析，相同流分合并，得到18个流分(EL1-22)。
(1)EL8分离纯化：EL8用RP-18中压制备色谱分离，18％甲醇等度洗脱60min；所得EL8.1再用硅胶柱层析分离纯化，CH2Cl2∶CH3OH(10∶0至9∶1)梯度洗脱，得到化合物1(74mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为13β，21-二羟基东革酮(13β，21-dihydroxyeurycomanone)。
(2)EL10分离纯化：EL10通过Sephadex LH20分离，20％甲醇洗脱，得到EL10.1-10.7。EL10.2经重结晶得到化合物2(612mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为东革酮(eurycomanone)。EL10.3用硅胶柱层析，CH2Cl2∶CH3OH(10∶0至9∶1)梯度洗脱，得到EL10.3(15mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为13α，21-二氢东革酮(13α，21-Dihydroeurycomanone)。
(3)EL12分离纯化：EL12用RP-18中压制备色谱分离，20％甲醇等度洗脱100min，分别得到EL12.1-12.2。EL12.1反复重结晶，Sephadex LH20纯化得到化合物3(434mg)，经ESIMS、 NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为东革醇苷(eurycomanonol-2-O-β-D-glucopyranoside)。EL12.2用硅胶柱层析，CH2Cl2∶CH3OH(10∶0至9∶1)梯度洗脱，得到EL12.2(12mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为13β，21-二羟基东革醇(13β，21-Dihydroxyeurycomanol)。
(4)EL13分离纯化：EL13用RP-18中压制备色谱分离，20％甲醇等度洗脱130min，得到EL13.1，经反复重结晶，Sephadex LH20纯化得到化合物4(1021mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为东革醇(eurycomanol)。
(5)EL14分离纯化：EL14用RP-18中压制备色谱分离，20％-40％甲醇梯度400min，得到EL14.1-EL14.12。EL14.4用硅胶柱层析，CH2Cl2∶CH3OH(10∶0至9∶1)梯度洗脱，分别得到化合物EL14-1(18mg)、EL14-2(79mg)。EL14.5用硅胶柱层析，CH2Cl2∶CH3OH(10∶0至9∶1)梯度洗脱，分别得到化合物EL14-3(26mg)、EL14-4(10mg)。经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定EL14-1为龙革内酯(Longilactone)，EL14-2为Δ4，5，14-羟基乐园树醇(Δ4，5，14-hydroxyglaucarubol)，EL14-3为Δ4，16，6α-羟基异东革内酯E(Δ4，16，6α-hydroxy-isoeurycolactone E，参见Hideji Itokawa报道化合物4，J Nat Product 1993，56，1766-1771)，EL14-4为13β，18-二氢东革醇(13β，18-dihydroeurycomanol)。
(6)EL16分离纯化：EL16用RP-18中压制备色谱分离，27％甲醇等度80min，得到EL16.1经Sephadex分离得到化合物5(303mg)，经ESIMS、NMR波谱分析并和文献数据比较，鉴定为14，15β-二羟基克莱尼酮(14，15β-dihydroxyklaineanone)。
其中，化合物1-5的结构见下式，其13C-NMR数据参见表1。
表1 化合物1-5的13C-NMR数据归属(600M Hz，d5-吡啶)
实验例1：东革阿里提取物中化合物的体外抗肿瘤作用考察
采用MTT法，测试实施例4中分离获得各化合物的抗肿瘤活性；5种人肿瘤细胞株包括A549人非小细胞肺癌细胞，HepG2人肝癌细胞，PC3人前列腺癌细胞，SW620人大肠癌细胞，SKOV-3人卵巢癌细胞，均购于上海中国科学院细胞生物研究所。各化合物均配制为100、50、25、12.5、6.25μg/L。取对数生长期细胞株细胞，用胰酶消化后配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板中，每孔100μl。48h后加含不同药物及相应溶媒对照的新鲜培养液，对照组以等体积溶媒替代样品的培养液，空白组加等体积的不含细胞的培养液，每孔100μl，每组设5个平行孔。在上述条件下培养24、48、72h，其后每孔加入5mg/mL MTT10μl，继续培养1-2h，每孔加50μl DMSO溶解，于酶标仪上测定OD值，实验重复3次，取平均值，计算抑制率。
抑制率(％)＝[(1-样品组OD值/对照组OD值)]×100％
结果：采用MTT法对实施例4中分离获得的11个化合物进行了抗肿瘤活性筛选，结果显示含有A环α，β不饱和烯酮结构的化合物对5种人肿瘤细胞株均有一定程度抑制作用；化合物1、2、5在72h的IC50范围依次为9.6-28.7、8.5-23.7、2.9-10.3μmol/L。结果提示含有该类有效成分的东革阿里提取物具有抗肿瘤作用。
实验例2：东革阿里提取物的抗炎作用考察
选用实施例1东革阿里提取物(ELQE)进行抗炎实验。取20-25g小鼠80只，雌雄各半，分为ELQE低/中/高剂量组(50、100、200mg/kg)、吲哚美辛对照组(20mg/kg)和模型组5组，预灌胃给药一周。最后一次灌药2小时后，用二甲苯25微升均匀涂于小鼠右耳，半小时后处死小鼠，用直径6mm打孔器，取小鼠的左右耳相同部位，用分析天平称重。取下的右耳减去左耳重量为肿胀度，计算对照组和给药组的均值与标准差，t检验比较组间差异显著性。按下式求出肿胀抑制率：
肿胀抑制率(％)＝[1-给药组平均肿胀度/模型组平均肿胀度]×100％
结果：ELQE中/高剂量(100、200mg/kg)组对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症均有抑制作用，肿胀抑制率依次为56..3、74.5(％)。
Claims (1)
1. 一种东革阿里提取物的制备方法，其特征在于，所述东革阿里提取物中含有东革酮、东革醇、 东革醇苷、13β，21-二羟基东革酮和14，15β-二羟基克莱尼酮五种成分；所述东革阿里提取物由以下步骤制备获得：
(1)取15kg东革阿里根药材，切片，加入20倍量水回流提取2次，每次提取时间2h，提取液合并，过滤，得东革阿里提取液；
(2)由(1)所得东革阿里提取液，上AB-8型大孔树脂柱进行吸附, 柱体积20L/BV，依次用5BV水、4BV30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得东革阿里提取物；
（3）取(2)中东革阿里提取物10g，用10％甲醇50ml溶解，上40-60μm、柱体积500ml的DaisogelRP-18柱，用10％甲醇1.5L洗脱，再用60％甲醇1.5L洗脱，收集60％甲醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得高纯度东革阿里提取物。
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