CN112300185B - 肝毒性降低的生物碱类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肝毒性降低的生物碱类化合物及其制备方法和用途，所述生物碱类化合物为式I所示化合物、其异构体或药学上可接受的盐：

其中，R₁和R₂彼此独立地选自氢、C_1‑5直链或支链烷基、C_1‑5直链或支链烷氧基或羟基。式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐不仅因为环化去除了呋喃环导致肝毒性的不利影响，还具有明显的抗炎作用，从而使得这类化合物有望开发为用于临床的抗炎药物。

Description

肝毒性降低的生物碱类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学和治疗领域，具体涉及一种肝毒性降低的且具有抗炎活性的生物碱类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

白鲜皮是用于治疗皮肤炎症、湿疹、风疹、风湿、妇科炎症等的中药，其主要来源于中国东北和内蒙古地区。以往的植物化学研究表明，白鲜(Dictamnus dasycarpus)中的喹啉类生物碱和柠檬苦素类化合物是其主要特征成分。据报道，这些生物碱具有多种生物活性，如抗炎、抗癌、保肝和神经保护作用。

白鲜碱(dictamine，4-甲氧基呋喃[2,3-b]喹啉，其结构式如下)具有抗血小板聚集、抗细菌、抗真菌、抗癌和血管松弛等作用。然而，现有的研究还表明，作为白鲜皮中最丰富的呋喃喹啉生物碱成分，白鲜碱可以被CYP3A代谢活化成环氧代谢产物，该代谢产物具有通过共价结合蛋白诱导肝毒性的潜力。白鲜碱在小鼠中以时间和剂量依赖性方式引起急性肝损伤，而白鲜碱中的呋喃结构部分对于肝毒性而言是必需的(Fuguo Shi等，“Dictamnine-induced hepatotoxicity in mice:the role of metabolic activationof furan”，Toxicology and Applied Pharmacology，364(2019)，68-76；和Zhuo-Qing Li等，The Modulatory Role of CYP3A in Dictamnine-Induced Hepatotoxicity，Frontiers in Pharmacology，Volume 9，Article 1033，2018年9月)。而且，许多包含呋喃环的异生物素是有毒的和/或致癌的(Lisa A.Peterson等，Reactive Metabolites in theBiotransformation of Molecules Containing a Furan Ring，Chem.Res.Toxicol.2013，26，6-25)。

白鲜碱以及其类似结构的生物碱的肝毒性极大地限制了这类化合物作为药物在临床上的应用和开发。因此，亟需针对此类化合物开发一种既具有生物活性而且肝毒性降低的生物碱类化合物，以满足临床用药和制药工业的需求。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一种肝毒性降低的生物碱类化合物及其制备方法和用途。该生物碱类化合物在保持生物活性的基础上进一步降低了与白鲜碱的呋喃环结构相关的肝毒性，为进一步的药物开发奠定了基础。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐，

其中，R₁和R₂彼此独立地选自氢、C_1-5直链或支链烷基、C_1-5直链或支链烷氧基或羟基；

优选地，R₁和R₂彼此独立地选自氢、甲氧基或羟基。

进一步优选地，R₁为氢且R₂为氢。

进一步优选地，R₁为氢且R₂为羟基。

进一步优选地，R₁为氢且R₂为甲氧基。

进一步优选地，R₁为羟基且R₂为甲氧基。

进一步优选地，R₁为甲氧基且R₂为甲氧基；

最优选地，R₁为氢且R₂为氢。

本发明的式I所示的化合物的两种立体异构体Ia和Ib的结构如下：

其中，R₁和R₂的定义同上。

此外，式I所示的化合物的药学上可接受的盐可以选自盐酸盐、甲酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐等。

本发明还提供了一种式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)采用乙醇或乙醇水溶液加热回流提取白鲜皮，回收溶剂得到总浸膏；

(2)采用有机溶剂萃取步骤(1)得到的总浸膏，得到有机溶剂层；

(3)依次采用硅胶柱色谱和聚苯乙烯反相树脂柱色谱分离步骤(2)得到的有机溶剂层，得到式I所示的化合物。

在上述制备方法的步骤(1)中，优选地，采用体积比为95％的乙醇水溶液加热回流提取白鲜皮；优选地，加热回流提取进行3次，每次1小时。

在上述制备方法的步骤(2)中，优选地，采用乙酸乙酯萃取步骤(1)得到的总浸膏，得到乙酸乙酯层。

在上述制备方法的步骤(3)中，优选地，先后采用硅胶柱色谱以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，聚苯乙烯反相树脂柱色谱以甲醇和水的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱来分离步骤(2)得到的有机溶剂层；优选地，采用两次硅胶柱色谱分离步骤(2)得到的有机溶剂层。

进一步优选地，上述制备方法还包括对得到的式I所示的化合物进行手性分离。

本发明还提供了另一种式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

白鲜碱在有机溶剂中在催化剂的存在下经光照反应得到式I所示的化合物。

在上述制备方法中，优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷；优选地，所述催化剂为三氟甲磺酸亚铜；优选地，所述光照为高压汞灯照射。

本发明还提供了一种用于抗炎的药物组合物，其包含式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐，和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所示药物组合物除式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐之外还包含其它抗炎活性物质。

本发明还提供了式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐，或包含式I所示的化合物、其异构体或药学上可接受的盐和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的用于抗炎的药物组合物在制备抗炎药物中的用途。

本发明人在研究过程中从白鲜皮中分离得到了多种喹啉类生物碱，其中包括式I所示的化合物，该类化合物是一种罕见的新型呋喃[2+2]环化二聚呋喃喹啉生物碱。经过化合物的分离、结构阐明和抗炎作用的生物学评价，本发明人出人意料地发现式I所示的化合物不仅因为环化消除了呋喃环导致肝毒性的不利影响，而且具有明显的抗炎作用，从而使得这类化合物有望开发为抗炎药物而用于临床应用和制药生产。

附图说明

图1为实施例1分离的化合物Ia-1的H¹NMR图谱。

图2为实施例1分离的化合物Ia-1的C¹³NMR图谱。

图3为实施例1分离的化合物Ib-1的H¹NMR图谱。

图4为实施例1分离的化合物Ib-1的C¹³NMR图谱。

图5显示了白鲜碱、Ia-1和Ib-1在不同浓度不同孵育时间下对HepG2细胞活力的影响(与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01)。

图6显示了白鲜碱、Ia-1和Ib-1在200 0M下对HepG2细胞活力影响的比较(与对照组比较，**p<0.01)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括的定义为准。另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

实施例1本发明的化合物的分离和结构鉴定

白鲜皮共25kg，以95％(体积比)乙醇按8倍量加热回流提取三次，每次1小时，合并滤液，减压回收溶剂，得总浸膏1.3kg。将浸膏悬浮于2L水中，依次用乙酸乙酯2L和正丁醇2L萃取，分别萃取8次，经减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位276g，正丁醇萃取部位230g。

将乙酸乙酯层样品(276g)经硅胶(100-200目，300g)拌样后，首先使用硅胶柱色谱(5kg，100-200目)进行粗分，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯(97:3，95:5，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，30:70，0:100，v/v)以及100％甲醇，每个梯度洗脱3个柱体积，接样体积为1L。通过TLC检测终止色谱，合并流份，回收溶剂，最终得到11个流份(E1-E11)。

流份E10(样品重约5g)，采用硅胶柱色谱分离，选用石油醚-乙酸乙酯系统(9:1，8:2，7:3，1:1，0:10，v/v)进行洗脱，依据其薄层行为合并最终得五个流份(E10-1，E10-2，E10-3，E10-4)；E10-2经聚苯乙烯反相树脂(MCI)柱色谱分离(甲醇:H₂O＝50:50，75:25，100:0，v/v)，得到3个亚流份(E10-2-1，E10-2-2，E10-2-3，E10-2-4)，E10-2-4经半制备液相色谱纯化(乙腈:H₂O＝50:50，v/v)，得到化合物I-1(3mg)。

化合物I-1经手性柱(正己烷:异丙醇＝60:40，v/v)拆分，得到化合物Ia-1和化合物Ib-1。

旋光度测试结果：

Ia-1：[α]²⁵ _D+120.0(c 0.01，甲醇)；Ib-1：[α]²⁵ _D-120.0(c 0.01，甲醇)。

实施例2本发明的化合物的化学合成

(1)将200毫克白鲜碱溶于4毫升二氯甲烷中，加入1毫克三氟甲磺酸亚铜作为催化剂，室温下高压汞灯照射4小时，得粗产物。

(2)粗产物用碳十八烷基键合硅胶色谱柱通过半制备高效液相色谱分离，即得化合物I-1。

(3)化合物I-1经手性柱(正己烷:异丙醇＝60:40，v/v)拆分，得到化合物Ia-1和化合物Ib-1。

实施例3本发明的化合物的抗炎活性测试

抗炎活性筛选采用对LPS诱导的BV2细胞产生NO的抑制活性的测定实验。

1.实验方法

取小鼠小胶质细胞BV-2，采用含有10％牛胎血清、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM培养基。将细胞在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中传代培养，取融合度为80％左右的细胞消化、计数、铺板(40000个/孔)，过夜后进行给药。实验分为空白对照组、LPS组、阳性组和给药组，对照组中只加入培养基，给药组加入LPS和一定浓度的待测样品(给药时改用无血清培养基)，在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h。取上清液50μL，加入Griess试剂，每加完A液、B液后均避光静置5min，用酶标仪在570nm处测定OD值，利用GrapPad软件来计算IC₅₀。

化合物分别配制成100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.7813μM，每个浓度设4个平行。

在测定NO的同时测定MTT，将细胞上清吸走后加入10倍稀释的MTT 100μL，避光静置4h吸走上清，加入100μL DMSO复溶后测定OD值来考察细胞活性。

NO释放抑制率计算：

抑制率＝1-(给药组-空白组)/(LPS组-空白组)

2.实验结果

表1化合物对LPS诱导的BV2细胞产生NO的抑制活性

注：

1.化合物2、3和4的结构如下，均为本发明人从白鲜皮分离得到的生物碱类化合物：

2.数值表示为基于三次独立实验的平均值±SD。

3.阳性对照药。

从表1的结果可以看出，化合物2、3和4已经不具有导致肝毒性的呋喃环结构，但它们对LPS诱导的BV2细胞产生NO的抑制活性也很低(IC₅₀>50)，而本发明的化合物Ia-1和Ib-1在去除导致肝毒性的呋喃环部分的同时仍具有较高的对LPS诱导的BV2细胞产生NO的抑制活性，显示出作为抗炎药物的较大潜力。

实施例4化合物Ia-1和Ib-1与白鲜碱的肝毒性比较

肝毒性大小用肝细胞系HepG2细胞的细胞存活率表示。

1.实验方法

取HepG2细胞，采用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM培养基。将细胞在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中传代培养，取融合度为80％左右的细胞消化、计数、铺板(5000个/孔)，过夜后进行给药。实验分为对照组和给药组，对照组中只加入培养基，给药组加入一定浓度的待测样品，在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中分别培养24h、48h和72h，用MTT法测定各时间点的细胞存活率。孵育后的细胞弃去上层培养液，每孔加入5mg/mL的MTT溶液100μL，培养箱中孵育4-6h后，小心弃去上层溶液，每孔加入DMSO 100μL，待完全溶解后用酶标仪测量570nm下的吸光度。

化合物分别配制成200μM、100μM、50μM、25μM，每个浓度设4个平行。

细胞存活率计算：

给药组吸光度/空白对照组吸光度×100％。细胞存活率越小，毒性越大。

2.实验结果

如图5，孵育48h和72h之后，白鲜碱表现出较强的细胞毒性，且呈剂量依赖，而Ia-1和Ib-1在各时间点表现出很小的毒性或是没有毒性。

如图6，200μM时比较白鲜碱、Ia-1和Ib-1三个化合物的细胞毒性，可以看出，Ia-1和Ib-1在各时间点的毒性均小于白鲜碱，且孵育48h和72h之后，Ia-1和Ib-1组的细胞存活率与白鲜碱组有显著性差异。

通过以上实验结果，可以认为，Ia-1和Ib-1的肝毒性均小于白鲜碱。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (21)

1.一种式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中，R₁和R₂彼此独立地选自氢、C_1-5直链或支链烷基、C_1-5直链或支链烷氧基或羟基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁和R₂彼此独立地选自氢、甲氧基或羟基。

3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁为氢且R₂为氢；R₁为氢且R₂为羟基；R₁为氢且R₂为甲氧基；R₁为羟基且R₂为甲氧基；或R₁为甲氧基且R₂为甲氧基。

4.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁为氢且R₂为氢。

5.一种式Ia或Ib所示的化合物或其药学上可接受的盐：

Ia

Ib

其中，R₁和R₂彼此独立地选自氢、C_1-5直链或支链烷基、C_1-5直链或支链烷氧基或羟基。

6.根据权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁和R₂彼此独立地选自氢、甲氧基或羟基。

7.根据权利要求5或6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁为氢且R₂为氢；R₁为氢且R₂为羟基；R₁为氢且R₂为甲氧基；R₁为羟基且R₂为甲氧基；或R₁为甲氧基且R₂为甲氧基。

8.根据权利要求5或6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R₁为氢且R₂为氢。

9.根据权利要求1或5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、甲酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其包括以下步骤：

（1）采用乙醇或乙醇水溶液加热回流提取白鲜皮，回收溶剂得到总浸膏；

（2）采用乙酸乙酯萃取步骤（1）得到的总浸膏，得到乙酸乙酯层；

（3）先后采用硅胶柱色谱以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂，聚苯乙烯反相树脂柱色谱以甲醇和水的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱来分离步骤（2）得到的乙酸乙酯层，得到式I所示的化合物。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，在所述制备方法的步骤（1）中，采用体积比为95%乙醇水溶液加热回流提取白鲜皮。

12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，在所述制备方法的步骤（1）中，加热回流提取进行3次，每次1小时。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其中，在所述制备方法的步骤（3）中，采用两次硅胶柱色谱分离步骤（2）得到的有机溶剂层。

14.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括对得到的式I所示的化合物进行手性分离。

15.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其包括以下步骤：白鲜碱在有机溶剂中在催化剂的存在下经光照反应得到式I所示的化合物。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述有机溶剂为二氯甲烷。

17.根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述催化剂为三氟甲磺酸亚铜。

18.根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述光照为高压汞灯照射。

19.一种用于抗炎的药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其除根据权利要求1至9中任一项所述的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐之外还包含其它抗炎活性物质。

21.根据权利要求1至9中任一项所述的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求19或20所述的用于抗炎的药物组合物在制备抗炎药物中的用途。

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