CN114956967B - 一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E（3‑甲氧基‑5‑羟基‑4‑[(3’’R4’’S)对薄荷烯基]‑反式‑二苯乙烯）和化合物Reflexanbene F（3‑羟基‑5‑甲氧基‑2‑[(3’’R4’’S)对薄荷烯基]‑反式‑二苯乙烯）的制备方法，包括以下步骤：（1）、制备山橿总黄酮提取物；（2）、硅胶色谱分离；（3）、定向分离目标化合物。所制备的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明提取分离过程简单，易于操作，该化合物具有抑制肿瘤细胞的活性，有效用于制备治疗抗癌药物，开拓山橿的药用新用途，有巨大的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F及其制备方法与应用。
背景技术
山橿系樟科(Lauraceae)山胡椒属植物山橿(Lindera reflexa Hemsl.)的干燥根，在河南主要分布于大别山区，是民间用于治疗慢性胃炎、胃溃疡的常用药。目前报道的山橿的化学成分主要包括挥发油类、生物碱类、黄酮类、二苯乙烯类等。随着山橿化学成分研究的不断深入，发现了银松素、球松素、乔松素和桉油精等活性成分，但如何从山橿中分离出新的化合物，扩大山橿的用药范围，明确山橿发挥药效的物质基础是本领域技术人员所关心的重要问题，而本发明首次从山橿中发现化合物3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(ReflexanbeneE)和3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(ReflexanbeneF)具有抑制肿瘤细胞的活性，迄今为止未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F及其制备方法与应用，可有效解决从山橿中制备新的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F，并用于制备抑制胃癌、肺癌细胞的新药物，开拓山橿药用新用途的问题。
本发明解决的技术方案是，一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E(3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和化合物Reflexanbene F(3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)，分子结构式分别为：
其制备方法，包括以下步骤：
(1)、制备山橿总黄酮提取物：用乙醇对山橿进行提取，大孔吸附树脂湿法装柱，山橿乙醇提取物上样吸附，纯水冲洗除去杂质，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
(2)、硅胶色谱分离：称取纯化山橿总黄酮，用甲醇进行超声溶解，经硅胶柱色谱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇体系进行洗脱，结合薄层色谱合并相同流份，得到7个组分Fr.1-Fr.7；
(3)、定向分离目标化合物：用石油醚-二氯甲烷体系对组份Fr.1和Fr.3进行硅胶柱层析，然后利用MCI中压制备柱和半制备液相进行分离纯化，减压回收溶剂，得到化合物Reflexanbene E(3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和化合物Reflexanbene F(3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)。
本发明所制备的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明提取分离过程简单，易于操作，可有效从山橿中提取化合物3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)和化合物3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)，该化合物具有抑制肿瘤细胞的活性，有效用于制备治疗抗癌药物，开拓山橿的药用新用途，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明提取的山橿化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F分子结构式图。
图2为本发明Reflexanbene E的1H-NMR图。
图3为本发明Reflexanbene E的13C-NMR图。
图4为本发明Reflexanbene E的HSQC图。
图5为本发明Reflexanbene E的HMBC图。
图6为本发明Reflexanbene E的1H-1H COSY图。
图7为本发明Reflexanbene E的NOESY图。
图8为本发明Reflexanbene E的HR-ESI-MS图。
图9为本发明Reflexanbene E的多键碳氢关系图。
图10为本发明Reflexanbene E的ECD图。
图11为本发明Reflexanbene F的1H-NMR图。
图12为本发明Reflexanbene F的13C-NMR图。
图13为本发明Reflexanbene F的HSQC图。
图14为本发明Reflexanbene F的HMBC图。
图15为本发明Reflexanbene F的NOESY图。
图16为本发明Reflexanbene F的HR-ESI-MS图。
图17为本发明Reflexanbene F的多键碳氢关系图。
图18为本发明Reflexanbene F的ECD图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E(3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)和化合物Reflexanbene F(3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)的制备方法，所述的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F的分子结构式分别为：
其制备方法，包括以下步骤：
(1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取3～5次，每次提取0.8～1.2h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的10～14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.04～0.06mg/mL的山橿提取物溶液(相当于每1mL含生药0.04～0.06mg)，备用；
所述的重量体积是指固体以g计，液体以ml计(以下同)；
(2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡10～14h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
(3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的3～5倍，上样流速为0.5-1.5mL/min，上样完成后静置1.9～2.1h，用大孔吸附树脂3～5倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂3～5倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
(4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为18～22mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为90～110mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2～5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速13～17mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2～5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)。
实施例2
本发明一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取3次，每次提取1h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的12倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.05mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
(2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡12h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
(3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1.0mL/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂4倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
(4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为20mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为100mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速15mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)。
实施例3
本发明一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取5次，每次提取0.8h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.06mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
(2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡14h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
(3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的5倍，上样流速为1.5mL/min，上样完成后静置2.1h，用大孔吸附树脂5倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂5倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
(4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为22mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为110mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速17mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)。
实施例4
本发明一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70％的乙醇超声提取4次，每次提取1.2h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的10倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.04mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
(2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95％乙醇浸泡10h，用体积浓度95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
(3)制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的3倍，上样流速为0.5mL/min，上样完成后静置1.9h，用大孔吸附树脂3倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂3倍量的体积浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
(4)制备单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为18mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为90mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速13mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)。
本发明实施例1-4任一所述方法制备的化合物Reflexanbene E和化合物Reflexanbene F，经结构鉴定，化合物Reflexanbene E的结构均是相同的，Reflexanbene F的结构也均是相同的，具有抑制肿瘤细胞的活性，有效用于制备治疗肿瘤药物，并经过多次反复试验均取得了相同或近似的结果，有关资料如下：
一、化合物的结构鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定，其中：
化合物Reflexanbene E(3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)为淡黄色油状物，易溶于氯仿，ESI-MS m/z:363.2318[M+H]+(calculated forC25H31O2，363.2319)，推测其分子式为C25H30O2。紫外光谱UV显示化合物Reflexanbene E在甲醇溶液中的最大吸收波长(λmax)为210nm和317nm。红外光谱IR显示有羟基(3427cm-1)和苯环(1431,1449,1568,1614cm-1)的吸收。
化合物Reflexanbene E的1H-NMR(CDCl3，500MHz)谱显示了3个甲基氢原子信号：δH1.76(3H,s,H-7”)，0.85(6H,dd,J＝4.9,5.1Hz,H-9”和H-10”)；1个甲氧基氢原子信号：δH3.81(3H,s,3-OCH3)；1个苯环单取代的氢信号：δH7.50(2H,d,J＝7.7Hz,H-2’和H-6’)，7.35(2H,t,J＝7.5,7.8Hz，H-3’和H-5’)，7.25(1H,t,J＝7.4,7.3Hz,H-4’)；1对反式烯氢信号：δH7.07(2H,dd,J＝16.3,16.3Hz,H-α和H-β)；1个1,3,4,5位取代的苯环氢信号：δH 6.66(1H,s,H-6)，6.59(1H,s,H-2)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)谱显示共有25个碳信号，结合HSQC谱确定其中12个为苯环上的碳信号：δC136.9(C-1)，100.9(C-2)，158.7(C-3)，118.2(C-4)，156.5(C-5)，108.4(C-6)，137.4(C-1’)，126.6(C-2’和C-6’)，128.7(C-3’和C-5’)，127.6(C-4’)；1个甲氧基碳信号：δC55.6(3-OCH3)；2个反式双键碳信号：δC 128.5(C-α)，128.8(C-β)；3个甲基碳信号：δC 23.7(C-7”)，21.8(C-9”)，16.3(C-10”)；剩余的碳信号为：140.2(C-1”)，124.7(C-2”)，43.7(C-4”)，35.4(C-3”)，30.7(C-6”)，27.9(C-8”)，22.1(C-5”)。以上数据与文献报道中ReflexanbeneⅠ的结构相似，但多了一组-OCH3信号，结合HMBC谱，发现-OCH3上的氢与C-3和C-2存在明显的远程相关，以上证实甲氧基是连接在苯环的3位碳上，H-2和H-6与C-α存在明显远程相关，H-4”和H-2”与C-4存在远程相关，由此说明对薄荷烯基连接在苯环的4位碳上，NOESY谱显示H-3”和H-4”有NOE关系，说明两者处于同侧，通过ECD数据与理论数据进行比对发现该化合物为3”R4”S构型。综合上述数据，鉴定其结构为3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯。通过检索Scifinder数据库，未见有与其相同的文献报道，由此确定该化合物为新化合物，命名为Reflexanbene E，分子结构式为：
表1化合物Reflexanbene E的1H-NMR和13C-NMR数据(inCDCl3)
化合物Reflexanbene F(3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯)为淡黄色油状物，易溶于氯仿，ESI-MS m/z:363.2324[M+H]+(calculated forC25H31O2，363.2319)，推测其分子式为C25H30O2。紫外光谱UV显示化合物Reflexanbene F在甲醇溶液中的最大吸收波长(λmax)为212nm和300nm。红外光谱IR显示有羟基(3409cm-1)和苯环(1431,1578,1608cm-1)的吸收。
化合物Reflexanbene F的1H-NMR(CDCl3，500MHz)显示了3个甲基氢信号：δH1.78(3H,s,H-7”)，0.82(3H,d,J＝6.8Hz,H-9”)，0.77(3H,d,J＝6.7Hz,H-10”)；1个甲氧基氢信号：δH3.80(3H,s,5-OCH3)；1个单取代苯环上的5个氢信号δH7.47(2H,d,J＝7.6Hz,H-2’和H-6’)，7.36(2H,t,J＝7.5,7.7Hz,H-3’和H-5’)，7.25(1H,t,J＝7.3,6.4Hz,H-4’)；1对反式双键上的氢信号：7.31(1H,m,H-α)，6.87(1H,d,J＝15.9Hz,H-β)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)谱显示共有25个碳信号，结合HSQC谱确定δC 139.7(C-1’),128.7(C-3’和C-5’)，126.5(C-2’和C-6’)，127.7(C-4’)是单取代苯环上的碳信号；δC 131.8(C-β)和128.0(C-α)是反式双键上的碳信号；δC140.3(C-1”)，124.9(C-2”)，38.7(C-3”)，43.4(C-4”)，23.7(C-5”)，30.7(C-6”)，22.2(C-7”)，27.3(C-8”)，21.8(C-9”)，16.7(C-10”)是一组对薄荷烯基上的碳信号；δC55.3(5-OCH3)是甲氧基上的碳信号；剩余的6个碳δC137.5(C-1)，120.4(C-2)，156.6(C-3)，102.7(C-4)，159.0(C-5)，104.9(C-6)是一组苯环上的碳信号。以上数据与化合物Reflexanbene E结构相似，但是化合物Reflexanbene F的HMBC谱显示，H-6与C-5和C-α存在远程相关，H-4”和H-2”与C-2存在远程相关，这说明对薄荷烯基片段连接在苯环的2位碳上，-OCH3上的氢信号与C-5存在远程相关，说明-OCH3连接在苯环的5位碳上，NOESY谱显示H-3”和H-4”有NOE关系，说明两者处于同侧，通过ECD数据与理论数据进行比对发现该化合物为3”R4”S构型。综合上述数据，鉴定其结构为3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯。通过检索Scifinder数据库，未见有与其结构相同的文献报道，由此确定该化合物为新化合物，命名为Reflexanbene F，分子结构式为：
表1-4化合物Reflexanbene F的1H-NMR和13C-NMR数据(inCDCl3)
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二、活性实验：
本发明制备的化合物Reflexanbene E和Reflexanbene F，经实验，对人胃癌细胞(MGC803)和人肺癌细胞(A549)具有细胞毒性，有关实验资料如下：
1.实验材料
人胃癌细胞株(MGC803)和人肺癌细胞(A549)由河南中医药大学药理实验室提供，胎牛血清购买自Gibco公司。
2.细胞培养
MGC803细胞和A549细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养皿置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1-2天换培养液一次，当细胞融合度达到80％以上时，用胰蛋白酶进行消化传代。
3.MTT法
取对数生长期细胞培养于96孔板内，每孔100μL(含5000个肿瘤细胞)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，小心移除培养基，然后加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设置5-6个剂量组，每组设置五个复孔，每孔100μL。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每孔加入20μL(1mg/mL)MTT溶液。37℃、5％CO2培养箱中孵育4h，弃去上清液，每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒颗粒，轻度振荡溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞作为对照，按照下面的公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度结果，通过GraphPad Prism 8软件处理，得到半数抑制浓度(IC50)。
4.实验结果
通过MTT法采用人胃癌细胞株(MGC803)和人肺癌细胞株(A549)对3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)和3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)进行细胞毒活性测试，结果见表3。
表3化合物细胞毒活性测试结果
通过实验结果可以看出，3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)和3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)因取代基的不同，导致两者在细胞毒活性中存在差异，本发明制备出的3-甲氧基-5-羟基-4-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene E)和3-羟基-5-甲氧基-2-[(3”R4”S)对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene F)对人胃癌细胞(MGC803)和人肺癌细胞(A549)有细胞毒活性，具有制备临床抗癌药的应用价值，开拓了山橿药材的新用途，并为制备抗癌药物提供了技术支持，特别是实现制备抗人胃癌细胞(MGC803)和人肺癌细胞(A549)药物中的应用。
本发明原料丰富，制备方法易操作，易于推广应用，开拓了山橿的药物价值和商业价值，是制备治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益显著。
Claims (6)
1. 一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F，其特征在于，分子结构式分别为：
。
2. 权利要求1所述的从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70%的乙醇超声提取3~5次，每次提取0.8~1.2h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的10~14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.04~0.06mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
所述的重量体积是指固体以g计，液体以ml计；
（2）树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95%乙醇浸泡10~14h，用体积浓度95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
（3）制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的3~5倍，上样流速为0.5~1.5mL/min，上样完成后静置1.9~2.1h，用大孔吸附树脂3~5倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂3~5倍量的体积浓度70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
（4）制备单体成分：将步骤（3）制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为18~22mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为90~110mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2-5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得化合物Reflexanbene E；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速13-17mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、 Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2-5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得化合物Reflexanbene F。
3. 根据权利要求2所述的从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70%的乙醇超声提取3次，每次提取1h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的12倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.05mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
（2）树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95%乙醇浸泡12h，用体积浓度95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
（3）制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1.0mL/min，上样完成后静置2h，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂4倍量的体积浓度70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
（4）制备单体成分：将步骤（3）制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为20mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为100mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得化合物Reflexanbene E；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速15mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、 Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得化合物Reflexanbene F。
4. 根据权利要求2所述的从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70%的乙醇超声提取5次，每次提取0.8h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的14倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.06mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
（2）树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95%乙醇浸泡14h，用体积浓度95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
（3）制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的5倍，上样流速为1.5mL/min，上样完成后静置2.1h，用大孔吸附树脂5倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂5倍量的体积浓度70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
（4）制备单体成分：将步骤（3）制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为22mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为110mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得化合物Reflexanbene E；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速17mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、 Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速5mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得化合物Reflexanbene F。
5. 根据权利要求2所述的从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入体积浓度为70%的乙醇超声提取4次，每次提取1.2h，每次加入乙醇的量为山橿重量体积的10倍；合并提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得浓缩液，浓缩液中加入水，稀释成质量浓度为0.04mg/mL的山橿提取物溶液，备用；
（2）树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂先用体积浓度95%乙醇浸泡10h，用体积浓度95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
（3）制备纯化山橿总黄酮：取步骤1制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的3倍，上样流速为0.5mL/min，上样完成后静置1.9h，用大孔吸附树脂3倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂3倍量的体积浓度70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
（4）制备单体成分：将步骤（3）制备的山橿总黄酮500g用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为18mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为90mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为10.02min的峰，得化合物Reflexanbene E；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速13mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90、流份91-96，得到3个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2、 Fr.3-3，将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速2mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为13.31min的峰，得化合物Reflexanbene F。
6. 权利要求2-5任一项所述方法制备的从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F在制备抗人胃癌细胞MGC803和人肺癌细胞A549药物中的应用。
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| CN113842390A (zh) * | 2021-10-26 | 2021-12-28 | 河南中医药大学 | 一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Secondary metabolites from the root of Lindera reflexa Hemsl;Suiqing Chen，等;Fitoterapia;第105卷;摘要、第223页Fig. 1 * |
| 山橿乙醇提取物中总黄酮与二苯乙烯类化合物分离工艺研究;高丹丹，等;中医学报;第30卷(第7期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114956967A (zh) | 2022-08-30 |
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