CN113842390A - 一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物及其制备方法与应用，有效解决山橿活性成分组合物对胃溃疡的治疗，并且能够预防和减少胃溃疡的发生问题，从山橿中提取的活性成分银松素‑3,5‑二‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、银松素、3‑甲氧基‑5‑羟基‑反式‑二苯乙烯、3,5‑二甲氧基‑反式‑二苯乙烯、3,5‑二羟基‑4‑[(3”R4”S)‑对薄荷烯基]‑反式‑二苯乙烯、3,5‑二羟基‑2‑[(3”R4”R)‑对薄荷烯基]‑反式‑二苯乙烯、3,5‑二羟基‑2,6‑二‑[(3”R4”R3’’’S4’’’S)‑对薄荷烯基]‑反式‑二苯乙烯和3,5‑二羟基‑2,4‑二‑[(3”R4”S3’’’R4’’’S)‑对薄荷烯基]‑反式‑二苯乙烯混合，甲醇溶解，加水混悬，冷冻干燥；本发明制备方法科学、合理，易操作，提高胃组织的抗氧化应激能力，缓解炎症，促进胃溃疡的修复，具有显著的胃保护和治疗效果。

Description

一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药物技术领域，尤其涉及一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)及其制备方法与应用。
背景技术
胃溃疡是一种临床常见的消化系统疾病，其主要特点是坏死、出血、炎症细胞浸润和血流减少，严重者会发生胃穿孔甚至癌变。胃溃疡的发病机制较为复杂，目前认为主要是由于胃黏膜的防御因子(碳酸氢盐、前列腺素和一氧化氮)和攻击因子(胃酸和胃蛋白酶)失衡所致。此外，长期服用非甾体类抗炎药，过量的饮酒和吸烟，精神压力过大和幽门螺旋杆菌感染也会导致胃溃疡的发生。
临床上治疗胃溃疡常用的药物有质子泵抑制剂(奥美拉唑、兰索拉唑)、H2受体阻断剂(雷尼替丁、西咪替丁)和抗酸剂等，这些药物长期服用会出现阳痿、造血功能改变、心律失常和男性乳房发育等不良反应。因此，研发化学成分明确，治疗效果好，副作用小或无副作用的抗溃疡药物刻不容缓。
山橿系樟科(Lauraceae)山胡椒属植物山橿(Lindera reflexaHemsl.)的干燥根，收载于《河南省中药材标准》(1993年版)，在民间常用于治疗胃炎和胃溃疡等疾病。前期研究发现山橿总黄酮部位的抗溃疡活性较好，但总黄酮部位成分较为复杂，不仅含有黄酮类成分，二苯乙烯类成分也占有较大比例，这对山橿的临床研究和新药开发极为不利。如何从山橿中筛选出一个或一组治疗胃溃疡效果与山橿相同或更好的化合物，创造良好的社会效益和经济效益，是本领域技术人员需要解决的技术问题，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)及其制备方法与应用，可有效解决山橿活性成分组合物(群)对胃溃疡的治疗，并且能够预防和减少胃溃疡的发生，实现山橿活性成分组合物在制备防治胃溃疡药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)，所述的山橿活性成分组合物，是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比3.66-5.48％、23.16-34.74％、6.05-9.07％、4.23-6.35％、8.35-12.53％、23.02-34.54％、7.40-11.10％、4.12-6.18％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥，得山橿活性成分组合物；所述的银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯的分子结构式分别为：
Figure BDA0003321659390000021
所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)的制备方法，山橿总黄酮部位的富集和纯化，然后对山橿总黄酮部位进行定性和定量分析，利用硅胶柱色谱和制备液相对山橿总黄酮部位中的8个二苯乙烯类成分进行富集和纯化，得到相应的单体成分，然后将8个二苯乙烯类成分按照其在山橿总黄酮部位中的含量进行配比，组合后得到山橿活性成分组合物，具体包括以下步骤：
(1)制备山橿总黄酮提取物：用乙醇对山橿进行提取，大孔吸附树脂湿法装柱，山橿乙醇提取物上样吸附，纯水冲洗除去杂质，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得纯化山橿总黄酮；
(2)硅胶柱色谱分离：称取纯化山橿总黄酮，用甲醇进行超声溶解，经硅胶柱色谱，用石油醚-二氯甲烷-甲醇体系进行洗脱，结合薄层色谱对目标化合物进行分离；
(3)目标化合物的纯化：根据化合物在297nm波长下的吸收和出峰时间，定向收集相应的组分，减压回收溶剂，得到银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene C)、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(ReflexanbeneⅠ)、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene B)和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(Reflexanbene A)8个化合物的单体成分；
(4)山橿活性成分组合物的制备：按照8个化合物在山橿总黄酮中的比例进行混合，甲醇溶解后加水制成混悬液，冷冻干燥，得到山橿活性成分组合物(群)。
本发明所制备的山橿活性成分组合物(群)对胃组织有很好的保护作用，可有效用于制备防治胃溃疡的药物，实现山橿活性成分组合物(群)在制备防治胃溃疡药物中的应用。
本发明活性成分组合物(群)是从山橿中提取的8个有效活性成分，制备方法科学、合理，易操作，所得到的8个活性成分制成的山橿活性成分组合物(群)，从宏观上能减少乙醇引起的胃粘膜损伤和出血，显著降低溃疡指数和溃疡率，并且溃疡抑制率能够达到90％以上，其能够调节胃液体积和胃液pH值趋于正常水平。山橿活性成分组合物还能够显著降低无水乙醇诱导胃溃疡大鼠血清中TNF-α和MTL的含量，升高血清中PGE2的水平，提高机体的抗炎能力。在抗氧化能力方面，山橿活性成分组合物能够显著降低大鼠胃组织中MDA和MPO的水平，升高SOD和CAT的水平，提高了机体的抗氧化能力。山橿活性成分组合物通过下调TLR2/MyD88信号通路，抑制了细胞的凋亡，同时激活VEGFR2/ERK信号通路，促进血管修复和细胞增殖，加速溃疡的愈合。说明本发明的山橿活性成分组合物能够提高胃组织的抗氧化应激能力，缓解炎症，促进胃溃疡的修复，具有显著的胃保护和治疗效果，可以作为一种具有良好的预防和治疗胃溃疡的药物。
附图说明
图1为本发明8个化合物的分子结构式图。
图2为本发明化合物Ⅰ的核磁共振氢谱图。
图3为本发明化合物Ⅰ的核磁共振碳谱图。
图4为本发明化合物Ⅱ的核磁共振氢谱图。
图5为本发明化合物Ⅱ的核磁共振碳谱图。
图6为本发明化合物Ⅲ的核磁共振氢谱图。
图7为本发明化合物Ⅲ的核磁共振碳谱图。
图8为本发明化合物Ⅳ的核磁共振氢谱图。
图9为本发明化合物Ⅳ的核磁共振碳谱图。
图10为本发明化合物Ⅴ的核磁共振氢谱图。
图11为本发明化合物Ⅴ的核磁共振碳谱图。
图12为本发明化合物Ⅵ的核磁共振氢谱图。
图13为本发明化合物Ⅵ的核磁共振碳谱图。
图14为本发明化合物Ⅶ的核磁共振氢谱图。
图15为本发明化合物Ⅶ的核磁共振碳谱图。
图16为本发明化合物Ⅶ的HMBC谱图。
图17为本发明化合物Ⅷ的核磁共振氢谱图。
图18为本发明化合物Ⅷ的核磁共振碳谱图。
图19为本发明化合物Ⅷ的HMBC谱图。
图20为本发明不同组别药物对乙醇诱导胃溃疡大鼠胃组织VEGFR2/ERK信号通路相关蛋白表达结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)，所述的山橿活性成分组合物，是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比4.57％、28.95％、7.56％、5.29％、10.44％、28.78％、9.25％、5.16％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥，得山橿活性成分组合物；所述的银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯的分子结构式分别为：
Figure BDA0003321659390000051
所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入质量浓度为70％的乙醇超声提取3次，每次提取1小时，每次加入70％乙醇的量为山橿重量的12倍；合并三次的提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得到浓缩液，浓缩液加入水稀释成相当于每1mL含生药0.05mg(0.05mg/mL生药)的山橿提取物溶液，备用；
(2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂用质量浓度95％乙醇浸泡12小时，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
(3)制备纯化山橿总黄酮：将步骤(1)制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1.0mL/min，上样完成后静置2小时，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂4倍量的质量浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得到纯化山橿总黄酮；
(4)制备山橿单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为20mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为100mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比95:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为26.82min的峰，得3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(化合物Ⅷ)；
将组分Fr.2经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为15.37min的峰，得3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯(化合物Ⅳ)；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速15mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90，得到2个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2，将亚组份Fr.3-1回收溶剂，得化合物3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(化合物Ⅴ)；将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为11.70min的峰，得3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(化合物Ⅶ)；
将组分Fr.4经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为7.82min的峰，得3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯(化合物Ⅲ)；
将组分Fr.5经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱纯化，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为18.10min的峰，得3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯(化合物Ⅵ)；
将组分Fr.6经中压ODS柱色谱，用体积比55:45的甲醇水作洗脱液进行洗脱，流速15mL/min，每250mL为一流份，收集24个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比50:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，合并流份3-11，回收溶剂，得银松素(化合物Ⅱ)；
将组分Fr.7经中压ODS柱色谱，依次用体积比5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、60:40的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用2L洗脱液，收集40:60的甲醇-水洗脱液，得到亚组份Fr.7-1，将亚组份Fr.7-1经半制备液相色谱，用体积比55:45的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱纯化，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为8.37min的峰，得银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷(化合物Ⅰ)；
(5)制备山橿活性成分组合物(群)：将银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比4.57％、28.95％、7.56％、5.29％、10.44％、28.78％、9.25％、5.16％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥，得山橿活性成分组合物。
实施例2
本发明一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)，所述的山橿活性成分组合物是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比3.67％、31.64％、6.06％、5.89％、8.36％、31.12％、7.41％、5.85％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥，得山橿活性成分组合物。
实施例3
本发明一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物(群)，所述的山橿活性成分组合物是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比5.47％、25.69％、9.06％、4.85％、12.52％、26.67％、11.09％、4.65％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥，得山橿活性成分组合物。
本发明是从山橿中提取的8个有效活性成分组合物，制备方法科学、合理，易操作，所得到的8个活性成分制成的山橿活性成分组合物(群)，从宏观上能减少乙醇引起的胃粘膜损伤和出血，显著降低溃疡指数和溃疡率，并且溃疡抑制率能够达到90％以上，其能够调节胃液体积和胃液pH值趋于正常水平。经结构鉴定，8个活性成分分别是银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯，其组合物经实验具有防治胃溃疡之功能，有关鉴定和实验资料如下：
一、结构鉴定。
化合物Ⅰ为淡红棕色粉末，易溶于甲醇，微溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 554.2211[M+NH4]+(calcd for C26H36O12N，554.2237)，确定分子式为C26H32O12。1H-NMR谱显示，δ7.52(2H，d，J＝7.6Hz)，7.33(2H，d，J＝7.5Hz)，7.23(1H，t，J＝8.0，7.5Hz)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.16(2H，dd，J＝16.3，16.3Hz)是反式双键上的氢信号；13C-NMR谱显示，δ127.6，128.7，129.6，138.5是单取代苯环上的碳，δ129.1，130.6是双键上的碳信号，δ110.1，140.8，160.1是苯环上间位取代的碳信号，δ62.7，71.5，74.8，78.1，77.9，102.1是两个对称葡萄糖信号，根据端基氢耦合常数确定为β型，结合文献确定该化合物为银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000081
表1化合物化合物Ⅰ的NMR数据(in MeOD，500Hz)
Figure BDA0003321659390000082
Figure BDA0003321659390000091
化合物Ⅱ为淡红棕色粉末，易溶于甲醇，微溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 213.0903[M+H]+(calcd for C14H13O2，213.0916)，确定分子式为C14H12O2。1H-NMR谱显示，δ7.52(2H，d，J＝7.3Hz),7.36(2H，t，J＝7.5，7.9Hz)，7.25(1H，t，J＝7.4，7.4Hz)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.07(2H，dd，J＝16.4，16.4Hz)是反式双键上的氢信号；δ6.52(2H，dd，J＝3.1，3.1Hz)，6.23(1H，t，J＝2.2，2.2Hz)是苯环上处于间位上的氢信号；13C-NMR谱显示，共有14个碳信号且均在芳香区，确定该结构中存在两个苯环和一个方式双键，δ158.3提示苯环上存在两个对称取代的羟基，结合文献确定该化合物为银松素，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000092
表2化合物化合物Ⅱ的NMR数据(in MeOD，500Hz)
Figure BDA0003321659390000093
化合物Ⅲ为棕色油状物，溶于甲醇，微溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z227.1062[M+H]+(calcd for C15H15O2，227.1072)，确定分子式为C15H14O2。1H-NMR谱显示，δ7.54(2H，d，J＝7.7Hz),7.36(2H，t，J＝7.5，7.9Hz)，7.26(1H，t，J＝7.4，7.3Hz)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.12(2H，dd，J＝16.3，16.3Hz)是反式双键上的氢信号；δ6.62(2H，t，J＝2.7，2.3Hz)，6.31(1H，t，J＝2.2，2.2Hz)是苯环上处于间位上的三个氢信号；δ3.80(3H，s)是一个甲氧基氢信号；13C-NMR谱显示，共有15个碳信号，其中14个碳信号在芳香区，确定该结构中存在两个苯环和一个方式双键，δ158.4提示苯环上存在一个取代羟基，δ54.3是甲氧基上的碳信号；结合文献确定该化合物为3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000101
表3化合物化合物Ⅲ的NMR数据(in MeOD，500Hz)
Figure BDA0003321659390000102
化合物Ⅳ为白色杆状结晶，溶于甲醇，微溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z241.1233[M+H]+(calcd for C16H17O2，241.1223)，确定分子式为C16H16O2。1H-NMR谱显示，δ7.51(2H，d，J＝7.9Hz),7.36(2H，t，J＝7.7，7.5Hz)，7.25(1H，m)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.10(2H，dd，J＝16.3，16.3Hz)是反式双键上的氢信号；δ6.67(2H，d，J＝2.0Hz)，6.39(1H，m)是苯环上间位取代的氢信号；13C-NMR谱显示，共有16个碳信号，其中14个芳香碳信号，说明存在一个二苯乙烯结构；δ55.4是对称取代的两个甲氧基碳信号且分别连接在δ161.0的两个碳上；结合文献确定该化合物为3，5-二甲氧基-反式-二苯乙烯(3，5-dimethoxystilbene)，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000111
表4化合物化合物Ⅳ的NMR数据(in CDCl3，500Hz)
Figure BDA0003321659390000112
化合物Ⅴ为红棕色粉末，溶于甲醇，微溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z349.2154[M+H]+(calcd for C24H29O2，349.2162)，确定分子式为C24H28O2。1H-NMR谱显示，δ7.51(2H，d，J＝8.6Hz),7.35(2H，t，J＝7.6，7.8Hz)，7.24(1H，t，J＝7.4，7.4Hz)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.04(1H，d，J＝16.4)，6.96(1H，d，J＝16.3)是反式双键上的氢信号；δ6.15(2H，s)是连接在苯环上对称碳上的两个氢；13C-NMR谱显示，δ134.1，125.7，35.9，42.2，22.6，30.6，22.3，28.1，20.6，15.5是一组对薄荷烯基碳信号，则剩余的14个碳信号均在芳香区，是一个二苯乙烯结构，结合文献确定该化合物为3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯，简称Reflexanbene C，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000121
表5化合物化合物Ⅴ的NMR数据(in MeOD，500Hz)
Position δ<sub>C</sub>，type δ<sub>H</sub>(J in Hz)
1 136.2，C
2 105.2，CH 6.51s
3 156.7，C
4 1117.6，C
5 156.7，C
6 105.1，CH 6.51s
α 128.5，CH 7.04d(16.4)
β 127.2，CH 6.96d(16.3)
1' 137.6，C
2'，6' 126.0，CH 7.31d(7.9)
3'，5' 128.3，CH 7.48t(7.7，7.5)
4' 126.9，CH 7.25m
1” 134.1，C 3.82m
2” 125.7，CH 5.31s
3” 35.9，CH 3.90m
4” 42.2，CH 2.05m
5” 22.6，CH<sub>2</sub> 1.81m，1.41m
6” 30.6，CH<sub>2</sub> 2.16m，2.03s
7” 22.3，CH<sub>3</sub> 1.71s
8” 28.1，CH 1.61m
9” 20.6，CH<sub>3</sub> 0.87d(5.2)
10” 15.5，CH<sub>3</sub> 0.86d(5.0)
化合物Ⅵ为红棕色粉末，溶于甲醇，微溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z349.2159[M+H]+(calcd for C24H29O2，349.2162)，确定分子式为C24H28O2。1H-NMR谱显示，δ7.42(2H，d，J＝7.3Hz),7.34(2H，t，J＝7.6，7.8Hz)，7.24(1H，t，J＝7.3，7.4Hz)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.79(1H，d，J＝16.1)，6.79(1H，d，J＝16.1)是反式双键上的氢信号；δ6.59(1H，s)，6.27(1H，d，J＝2.4)是苯环间位上的两个氢；13C-NMR谱显示，δ132.9，126.1，36.3，45.5，22.8，31.0，22.4，27.5，20.6，15.5是一组对薄荷烯基碳信号，则剩余的14个碳信号均在芳香区，是一个二苯乙烯结构，结合文献确定该化合物为3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯，简称ReflexanbeneⅠ，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000131
表6化合物化合物Ⅵ的NMR数据(in MeOD，500Hz)
Position δ<sub>C</sub>，type δ<sub>H</sub>(J in Hz)
1 138.2，C
2 120.9，C
3 155.5，C
4 101.3，CH 6.27s(2.4)
5 156.7，C
6 104.2，CH 6.59s
α 128.6，CH 6.79d(16.1)
β 126.8，CH 7.79d(16.1)
1' 137.4，C
2'，6' 128.3，CH 7.31t(7.6，7.8)
3'，5' 125.8，CH 7.42d(7.3)
4' 128.4，CH 7.24t(7.3,7.4)
1” 132.9，C
2” 126.1，CH 5.39s
3” 36.3，CH 4.09m
4” 45.5，CH 1.79m
5” 22.8，CH<sub>2</sub> 1.79m，1.42m
6” 31.0，CH<sub>2</sub> 2.19m
7” 22.4，CH<sub>3</sub> 1.76s
8” 27.5，CH 1.52m
9” 20.6，CH<sub>3</sub> 0.77d(7.2)
10” 15.5，CH<sub>3</sub> 0.83d(6.2)
化合物Ⅶ为红棕色粉末，微溶于甲醇，易溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z485.3401[M+H]+(calcd for C34H45O2，485.3414)，确定分子式为C34H44O2。1H-NMR谱显示，δ7.46(2H，d，J＝7.5Hz),7.38(2H，t，J＝7.5，7.5Hz)，7.30(1H，m)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.02(1H，d，J＝16.6)，6.34(1H，d，J＝16.6)是反式双键上的氢信号；δ6.36(1H，s)是苯环上的氢信号；13C-NMR谱显示，δ139.4，125.4，40.3，43.3，22.1，30.7，23.6，27.3，21.8，16.8是一组对薄荷烯基碳信号，结合1H-NMR谱可以推测出应该存在两个化合环境形同的对薄荷烯基片段，则剩余的14个碳信号均在芳香区，是一个二苯乙烯结构，HMBC谱中δ5.64(1H，s)和δ1.72(1H，s，)与δ120.1相关，由此推断，对薄荷烯基片段分别连接在C-2和C-6上。通过实验和计算的CD光谱的比较，确定为3”R4”R3”’S4”’S。结合文献确定该化合物的结构为3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯，简称Reflexanbene B，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000141
表7化合物化合物Ⅶ的NMR数据(in CDCl3，500Hz)
Position δ<sub>C</sub>，type δ<sub>H</sub>(J in Hz)
1 140.6，C
2 120.1，C
3 154.9，C
4 105.2，CH 6.36s
5 154.9，C
6 120.1，C
α 128.6，CH 7.02d(16.6)
β 135.6，CH 6.34d(16.6)
1' 137.1，C
2'，6' 126.3，CH 7.46d(7.5)
3'，5' 128.7，CH 7.38t(7.5，7.5)
4' 127.6，CH 7.30m
1” 139.4，C
2” 125.4，CH 5.64s
3” 40.3，CH 3.72d(8.3)
4” 43.3，CH 1.72s
5” 22.1，CH<sub>2</sub> 1.75m，1.26m
6” 30.7，CH<sub>2</sub> 2.15m
7” 23.6，CH<sub>3</sub> 1.78s
8” 27.3，CH 1.53m
9” 21.8，CH<sub>3</sub> 0.82d(6.9)
10” 16.8，CH<sub>3</sub> 0.63d(6.6)
化合物Ⅷ为红棕色粉末，微溶于甲醇，易溶于氯仿。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z485.3394[M+H]+(calcd for C34H45O2，485.3414)，确定分子式为C34H44O2。1H-NMR谱显示，δ7.49(2H，d，J＝7.6Hz),7.37(2H，t，J＝7.4，8.1Hz)，7.26(1H，d，J＝7.2Hz)是一组苯环上单取代氢信号；δ7.31(1H，s)，6.89(1H，d，J＝15.9)是反式双键上的氢信号；δ6.66(1H，s)是苯环上的氢信号；13C-NMR谱显示，δ140.4,124.9,39.1,43.8,22.5,30.9,23.7,28.1,21.6,16.7和δ139.8,124.9,35.6,42.9,22.4,30.9,23.7,27.4,21.6,16.5是两组对薄荷烯基碳信号，则剩余的14个碳信号均在芳香区，是一个二苯乙烯结构；HMBC谱中δ6.66(1H，s)与δ119.4，δ118.0和δ127.7相关，表明分子中二苯乙烯的3,5位有两个羟基取代，对薄荷烯基分别连接在C-2和C-4上，通过实验和计算的CD光谱的比较，确定为3”R4”S3”’R4”’S。结合文献确定该化合物的结构为3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯，简称Reflexanbene A，分子结构式为：
Figure BDA0003321659390000151
表8化合物化合物Ⅷ的NMR数据(in CDCl3，500Hz)
Figure BDA0003321659390000152
Figure BDA0003321659390000161
二、活性实验
实验动物：Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，200±20g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
实验药物：实施例1中得到的山橿活性成分组合物
阳性对照：奥美拉唑、山橿总黄酮
实验方法和步骤：
将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、奥美拉唑对照组(OME)、山橿总黄酮组(YSYZ)、山橿活性成分组合物低剂量组(LHQ)、山橿活性成分组合物中剂量组(MHQ)和山橿活性成分组合物高剂量组(HHQ)，每组6只。空白对照组和模型对照组给予0.5％羧甲基纤维素钠溶液10mL/kg，奥美拉唑对照组给予20mg/kg的奥美拉唑溶液，山橿总黄酮组给予300mg/kg的山橿总黄酮溶液，山橿活性成分组合物的低、中、高剂量组分别给予54.15mg/kg、108.30mg/kg和216.60mg/kg的山橿活性成分组合物。实验动物2天称重一次，按照体重调整受试样品剂量，连续灌胃7天。
末次给药前禁食12小时，末次给药后1小时后，空白对照组给予生理盐水，其余各组用无水乙醇进行灌胃，给药剂量为1mL/只。无水乙醇刺激1小时后，腹主动脉收集大鼠血样，进行肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、胃动素(MTL)的检测，收集胃内容物进行胃液体积和pH的检测，取大鼠胃组织进行丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的含量检测及病理组织学检查，利用Western blot对胃组织中相关信号蛋白的表达量进行检测。
用于胃液体积和pH测定的样品前处理：收集胃内容物于10mL的离心管中，以2000rpm/min的转速离心15分钟，取上清液待测。
用于检测指标的测定：按照试剂盒的说明书对血清中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、胃动素(MTL)和胃组织中丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的含量进行检测。
用于病理组织学检查前处理：每只动物取一部分胃组织，在预冷的生理盐水中冲洗后，迅速放置到福尔马林溶液中固定，做好标记，留存供病理组织检查。
胃组织中相关蛋白的测定：通过免疫组化检测胃组织中Ki-67的阳性细胞数，通过免疫荧光检测胃组织中TLR2、MyD88的蛋白表达量，各组之间用平均光密度值(IOD value)进行比较。
用于蛋白质印迹法(即免疫印迹试验，Western Blot)检测样品的前处理：称取一定量的胃组织样本，加入10倍量(m/V)的RAPI裂解液后进行组织匀浆，离心后检测蛋白浓度，将各组的蛋白浓度稀释至同一水平，加入上样缓冲液后100℃变性10分钟，冰上迅速降温后-80℃保存待测。
实验结果与讨论：
不同给药组大鼠胃组织的宏观损伤情况：
正常对照组胃组织表面光滑，为浅粉色，乙醇刺激后胃组织出现大面积的出血和炎症反应，山橿活性成分组合物能够减小乙醇诱导的胃出血并缓解炎症反应，山橿总黄酮对乙醇诱导的大鼠胃溃疡也有一定的改善作用。
大鼠胃液体积和胃液pH的测定结果见表9。
表9山橿活性成分组合物对大鼠胃液体积和pH的影响(
Figure BDA0003321659390000171
n＝6)
Figure BDA0003321659390000172
注：##与正常对照组比较P<0.01；**与模型对照组比较P<0.01。
大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、胃动素(MTL)的含量测定结果见表10。
表10山橿活性成分组合物对大鼠血清中TNF-α、PGE2、MTL的影响(
Figure BDA0003321659390000181
n＝6)
Figure BDA0003321659390000182
注：#与正常对照组比较P<0.05；##与正常对照组比较P<0.01；*与模型对照组比较P<0.05；**与模型对照组比较P<0.01。
大鼠胃组织中丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的含量测定结果见表11。
表11山橿活性成分组合物对大鼠胃组织中MDA、MPO、SOD、CAT的影响(
Figure BDA0003321659390000183
n＝6)
Figure BDA0003321659390000184
注：#与正常对照组比较P<0.05；##与正常对照组比较P<0.01；*与模型对照组比较P<0.05；**与模型对照组比较P<0.01。
大鼠胃组织中Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子(MyD88)、增殖细胞核抗原(ki-67)的表达情况见表12。
表12山橿活性成分组合物对大鼠胃组织中ki-67、TLR2、MyD88表达的影响(
Figure BDA0003321659390000185
n＝6)
Figure BDA0003321659390000186
Figure BDA0003321659390000191
注：##与正常对照组比较P<0.01；*与模型对照组比较P<0.05；**与模型对照组比较P<0.01。
正常对照组的病理切片可以看到细胞排列紧密，没有出现上皮细胞脱落和出血的情况，模型组上皮细胞脱落，出血严重，并且出现水肿和炎症细胞浸润的情况，奥美拉唑对照组和山橿活性成分组合物中、高剂量组的胃组织出血、水肿和炎症细胞浸润的程度得到了很大的改善。
不同给药组中大鼠胃组织VEGFR2/ERK信号通路相关蛋白的Western blot结果见图2。
从图20中可以看出，VEGFR2、p-ERK1/2、p-P38、p-AKT蛋白在模型对照组中的表达高于正常对照组，这说明无水乙醇造成的溃疡启动了机体自身的修复程序，而山橿活性成分组合物高、中、低剂量组中的VEGFR2、p-ERK1/2、p-P38、p-AKT蛋白表达进一步的升高，这说明给药山橿活性成分组合物后能够促进机体的自我修复，加速溃疡的愈合。
在对实施例1山橿活性成分组合物实验的同时，对实施例2、3也作出了同样的实验，均取得了相同和相近似的结果，这里不再一一列举。
实验结果表明，山橿活性成分群能减少乙醇引起的胃粘膜损伤和出血，显著降低溃疡指数和溃疡率，并且溃疡抑制率能够达到90％以上，其能够调节胃液体积和胃液pH值趋于正常水平，减少无水乙醇引起的胃出血。胃组织相关指标检测结果显示，本发明产品能显著升高胃组织SOD、CAT含量，显著降低胃组织MDA、MPO含量，减轻胃损伤，提高机体抗氧化能力。进一步对血清相关指标检测，结果显示本发明产品能降低血清中TNF-α和MTL含量，升高PGE2的水平，提高机体的抗炎能力，从而减轻机体的炎症反应，并且降低乙醇引起的胃蠕动次数，有利于胃溃疡的修复。免疫组化和免疫荧光结果显示，本发明产品能升高ki-67的表达水平，下调TLR2和MyD88的表达水平，发挥促增殖可抗凋亡的作用。Western blot结果显示，本发明山橿活性成分组合物能通过激活VEGFR2/ERK信号通路，促进胃溃疡的愈合。在抗氧化能力方面，山橿活性成分组合物能够显著降低大鼠胃组织中MDA和MPO的水平，升高SOD和CAT的水平，提高了机体的抗氧化能力。山橿活性成分组合物通过下调TLR2/MyD88信号通路，抑制了细胞的凋亡，同时激活VEGFR2/ERK信号通路，促进血管修复和细胞增殖，加速溃疡的愈合。说明本发明的山橿活性成分组合物能够提高胃组织的抗氧化应激能力，缓解炎症，促进胃溃疡的修复，具有显著的胃保护和治疗效果，可以作为一种具有良好的预防和治疗胃溃疡的药物。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物，其特征在于，所述的山橿活性成分组合物是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比3.66-5.48％、23.16-34.74％、6.05-9.07％、4.23-6.35％、8.35-12.53％、23.02-34.54％、7.40-11.10％和4.12-6.18％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥制成；所述的银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯的分子结构式分别为：
Figure FDA0003321659380000011
2.根据权利要求1所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物，其特征在于，所述的山橿活性成分组合物是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比4.57％、28.95％、7.56％、5.29％、10.44％、28.78％、9.25％、5.16％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥制成。
3.根据权利要求1所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物，其特征在于，所述的山橿活性成分组合物是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比3.67％、31.64％、6.06％、5.89％、8.36％、31.12％、7.41％、5.85％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥制成。
4.根据权利要求1所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物，其特征在于，所述的山橿活性成分组合物是由从山橿中提取的活性成分银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比5.47％、25.69％、9.06％、4.85％、12.52％、26.67％、11.09％、4.65％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥制成。
5.权利要求1-4任一项所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备山橿提取物溶液：将山橿药材粉碎成粉，加入质量浓度为70％的乙醇超声提取3次，每次提取1小时，每次加入70％乙醇的量为山橿重量的12倍；合并三次的提取液，减压回收乙醇至提取液无醇味，得到浓缩液，浓缩液加入水稀释成相当于每1mL含生药0.05mg的山橿提取物溶液，备用；
(2)树脂处理及装柱：将大孔吸附树脂用质量浓度95％乙醇浸泡12小时，用95％乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合不呈白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味，按树脂柱子直径与柱高比1:8的比例将大孔吸附树脂湿法装柱；
(3)制备纯化山橿总黄酮：将步骤(1)制备的山橿提取物溶液上样，上样量为大孔吸附树脂重量的4倍，上样流速为1.0mL/min，上样完成后静置2小时，用大孔吸附树脂4倍重量的纯水冲洗杂质，再用大孔吸附树脂4倍量的质量浓度70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得到纯化山橿总黄酮；
(4)制备山橿单体成分：将步骤(3)制备的山橿总黄酮用硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为12.5L、16.8L、20L、28L、100L、70.8L、67.5L和65.5L，流速为20mL/min；然后再用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1、3:1、1:1和0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每个梯度所用的洗脱液体积依次为46L、48.5L、97L、70.5L、71L、69L、38L和49L，流速为100mL/min，每500mL为一流份，共收集1740个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分离，用GF254薄层板，分别以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷、体积比为50:1二氯甲烷-甲醇和体积比为3:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，茴香醛-浓硫酸作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份190-278、流份279-324、流份325-454、流份767-810、流份811-887、流份926-983、流份1316-1428，得到组分Fr.1-Fr.7的7个组分；
将组分Fr.1经半制备液相色谱，用体积比95:5的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为26.82min的峰，得3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯；
将组分Fr.2经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为15.37min的峰，得3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯；
将组分Fr.3经中压MCI柱色谱，依次用体积比为10:90、30:70、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4L洗脱液，流速15mL/min，每250mL为一流份，收集96个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份69-80、流份85-90，得到2个亚组份Fr.3-1、Fr.3-2，将亚组份Fr.3-1回收溶剂，得化合物3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯；将亚组份Fr.3-2经半制备液相色谱，用体积比98:2的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为11.70min的峰，得3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯；
将组分Fr.4经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为7.82min的峰，得3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯；
将组分Fr.5经半制备液相色谱，用体积比85:15的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱纯化，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为18.10min的峰，得3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯；
将组分Fr.6经中压ODS柱色谱，用体积比55:45的甲醇水作洗脱液进行洗脱，流速15mL/min，每250mL为一流份，收集24个流份，各流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比50:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，用茴香醛-浓硫酸溶液作为显色剂，105℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果，合并流份3-11，回收溶剂，得银松素；
将组分Fr.7经中压ODS柱色谱，依次用体积比5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、60:40的甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用2L洗脱液，收集40:60的甲醇-水洗脱液，得到亚组份Fr.7-1，将亚组份Fr.7-1经半制备液相色谱，用体积比55:45的甲醇-水作为洗脱液进行洗脱纯化，流速3mL/min，检测波长297nm，收集洗脱时间为8.37min的峰，得银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷；
(5)制备山橿活性成分组合物：将银松素-3,5-二-O-β-D-葡萄糖苷、银松素、3-甲氧基-5-羟基-反式-二苯乙烯、3,5-二甲氧基-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-4-[(3”R4”S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2-[(3”R4”R)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯、3,5-二羟基-2,6-二-[(3”R4”R3”’S4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯和3,5-二羟基-2,4-二-[(3”R4”S3”’R4”’S)-对薄荷烯基]-反式-二苯乙烯以质量含量百分比3.66-5.48％、23.16-34.74％、6.05-9.07％、4.23-6.35％、8.35-12.53％、23.02-34.54％、7.40-11.10％、4.12-6.18％混合，用甲醇溶解后，加入2倍药物重量的水，成山橿活性成分组合物混悬液，冷冻干燥，得山橿活性成分组合物。
6.权利要求1-4任一项所述的对胃溃疡具有防治作用的山橿活性成分组合物在制备防治胃溃疡药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114956967A (zh) * 2022-04-12 2022-08-30 河南中医药大学 一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F及其制备方法与应用
CN114956965A (zh) * 2022-04-12 2022-08-30 河南中医药大学 一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102349945A (zh) * 2011-10-19 2012-02-15 河南中医学院 大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102349945A (zh) * 2011-10-19 2012-02-15 河南中医学院 大孔吸附树脂提取纯化山橿总黄酮的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUHANG FU 等: "Chemical constituents of the antiulcer purified fractions of Lindera reflexa Hemsl. and its quantitative analysis", FITOTERAPIA, 1 December 2020 (2020-12-01), pages 1 - 8 *
王育伟 等: "脱氧雪腐镰刀菌烯醇对大鼠胃液组成的影响", 南京农业大学学报, vol. 40, no. 2, 31 March 2017 (2017-03-31), pages 320 - 324 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114956967A (zh) * 2022-04-12 2022-08-30 河南中医药大学 一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F及其制备方法与应用
CN114956965A (zh) * 2022-04-12 2022-08-30 河南中医药大学 一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物及其制备方法与应用
CN114956965B (zh) * 2022-04-12 2023-12-12 河南中医药大学 一种从山橿中分离得到的二苯乙烯类化合物及其制备方法与应用
CN114956967B (zh) * 2022-04-12 2024-03-22 河南中医药大学 一种从山橿中提取的化合物Reflexanbene E和F及其制备方法与应用

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