CN113181173B - 药用组合物及其在制备用于预防和/或治疗肝癌的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种药用组合物及其在制备用于预防和/或治疗肝癌的产品中的应用,药用组合物包括单体成分A和B,其中A为葡萄糖二酸盐及其内酯,B为5‑羟甲基糠醛;所述葡萄糖二酸盐及其内酯与5‑羟甲基糠醛的质量为2~10:1;所述葡萄糖二酸盐及其内酯包括葡萄糖二酸盐、葡萄糖二酸1,4内酯和葡萄糖二酸3,6内酯。本申请的药用组合物具有显著的抑制或延缓肝癌的发生发展的效果,且具有成分明确、安全,易得,价格低廉等特点。
Description
技术领域
本发明涉及药用组合物领域,具体涉及一种药用组合物及其在制备用于预防和/或治疗肝癌的产品中的应用。
背景技术
肝癌是一种具有易发生早期转移、隐匿程度高,术后复发率高等倾向的全球恶性疾病,据统计,2012年全世界男性肝癌发病率在全部癌症发病率中位居第五,死亡率高居第二;女性肝癌发病率位居第九,死亡率位居第六;感染是肝癌发生的主要诱导因素,我国又是发展中国家,肝炎病毒感染率较高,估计每年肝癌患者死亡约32万例,占全球肝癌死亡病例的51%,目前肝癌的预防和治疗是世界性医学难题,至今仍缺乏有效防治手段。
尽管在过去几十年中肝癌的诊断和治疗策略取得了显着进展,但是由于其高转移及术后引起的晚期HCC高复发率,使得其目前尚无法得到彻底治愈,且手术,化疗介入等相关治疗伴随着严重的副作用,目前我国肝癌患者的5年生存率仅约为15%。因此寻找一种安全有效可靠的预防或治疗肝癌的手段很有必要。
发明内容
本申请提供一种药用组合物,该药用组合物具有预防和/或治疗肝癌的功效,可将其用于制备预防和/或治疗肝癌产品。
一种药用组合物,包括单体成分A和B,其中A为葡萄糖二酸盐及其内酯,B为5-羟甲基糠醛;所述葡萄糖二酸盐及其内酯与5-羟甲基糠醛的质量比为5~15:1。
可选的,所述葡萄糖二酸盐及其内酯包括葡萄糖二酸盐、葡萄糖二酸1,4内酯和葡萄糖二酸3,6内酯;所述葡萄糖二酸盐、葡萄糖二酸1,4内酯和葡萄糖二酸3,6内酯的质量比为1:1:1。
其中,葡萄糖二酸盐、葡萄糖二酸1,4内酯和葡萄糖二酸3,6内酯的结构式如下:
所述的葡萄糖二酸盐为葡萄糖二酸钾盐或钙盐。
所述的5-羟甲基糠醛的结构式如下:
可选的,所述葡萄糖二酸盐及其内酯与5-羟甲基糠醛的比例为10~15:1。进一步地,所述葡萄糖二酸盐及其内酯与5-羟甲基糠醛的比例为11~12:1。
所述葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)和5-HMF可从至少一种中草药或中成药提取得到的,例如可以来源于中草药地黄、山药等,也可以来源于中成药六味地黄丸等,也可以通过商业购买途径获取,其合成路径已有文献报道。可选的,可从六味地黄丸中提取得到。
本申请还提供一种如所述的药用组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的产品中的应用。
可选的,所述产品为药物或保健品。
可选的,所述药物中含有有效治疗量的所述药用组合物和药学上可接受的载体。有效治疗量的所述萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)和5-HMF可以加入药学上可接受的载体,所述载体可以是稀释剂,黏合剂,崩解剂,润滑剂,矫味剂,芳香剂等。
可选的,所述药物的剂型为口服制剂。所述药物可以制备成口服液、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、滴丸或微丸等制剂但也不仅仅局限于口服制剂,所述剂型的药物均可以用现药学领域制剂学方法制备而得。
本申请还提供一种用于肝癌预防和/或治疗的药物,包含有效治疗量的所述的药用组合物及药学上可接受的载体。
本申请还提供一种所述的药用组合物的制备方法,包括:
从地黄、山药或六味地黄丸的至少一种中分别提取葡萄糖二酸盐及其内酯和5-羟甲基糠醛;
将所述葡萄糖二酸盐及其内酯和5-羟甲基糠醛按配比混合。
与现有技术相比,本申请具有如下有益效果:
本申请的药用组合物干预DEN诱导SD大鼠肝癌的发生发展中,通过大鼠的成活率和致癌率、肝组织病理切片、血清甲胎蛋白AFP的含量、血清和肝组织氨基酸Fisher’ratio值、血清生化指标以及大鼠体内抗氧化酶的活性等,证明本申请的药用组合物具有显著的抑制或延缓肝癌发生发展的效果,由于本申请的药用组合物具有成分明确、安全、易得、价格低廉等特点,因此该药用组合物有望成为一种新的预防或治疗肝癌的有效手段,具有潜在的应用开发前景。
附图说明
图1是实施例2中各实验组大鼠血清AFP和Fisher’ratio;其中:A是大鼠血清中肝癌标志物AFP的含量;B是大鼠血清和肝组织中芳香族氨基酸Fisher’ratio值的水平。
图2是实施例2中大鼠血清中抗氧化物质的水平图;其中A为SOD结果、B为CAT结果、C为GSH结果。
图3是实施例2中大鼠肝组织中抗氧化和抗脂质过氧化物质的水平图;其中A为SOD结果,B为CAT结果、C为GSH结果、D为MDA结果。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。
葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)一类天然存在无毒的有机小分子化合物,广泛存在于水果、蔬菜、药材及中成药中。葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)在预防癌症、调节胆固醇和抗氧化方面发挥着重要作用,在奶粉和乳制品中添加D-葡萄糖二酸钙已用于商业化生产,相关的医疗制剂也处在开发阶段,其愈来愈受到医药界的重视,具有较大的潜在研究价值。
5-羟甲基糠醛(5-HMF)分子式为C6H6O3,是一种呋喃结构的糠醛化合物,主要是由葡萄糖或果糖等单糖在加热或者酸性条件下转化产生,广泛存在于含糖量高的药材和食物中,例如五味子、熟地黄、蜂蜜和啤酒等。近年来关于中药中5-HMF对疾病的治疗和预防有积极影响的报道越来越多,5-HMF具有抗心肌缺血、抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性以及降血糖、抗络氨酸酶和调节Ca+平衡等多种生物活性,另因其弱毒性,安全范围较大,使得5-HMF预防或治疗癌症成为可能。
本申请的药用组合物采用葡萄糖二酸盐及其内酯和5-羟甲基糠醛的药用组合物,主要通过抑制致癌物质诱导肝癌的形成以达到抗肝癌的目的,其中5-羟甲基糠醛可增强葡萄糖二酸盐及其内酯的抗肝癌活性。可选的,葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)和5-HMF的优选配比为10~15:1;葡萄糖二酸盐及其内酯用量为10-80mg/kg,5-HMF的用量为3-8mg/kg。
一种实施方式中,本申请中葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)和5-HMF可从六味地黄丸中提取得到的,提取液经分离提纯及转化后,分别得到葡萄糖二酸、葡萄糖二酸1,4內酯和葡萄糖二酸3,6內酯这三种比例为1:1:1混合物(葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL))以及5-HMF,再将葡萄糖二酸盐及其内酯(GA-GL)与5-HMF按配比混合。
本申请对比了用葡萄糖二酸1,4-内酯(sigma公司对照品)和本申请的药用组合物干预DEN诱导SD大鼠形成肝癌后大鼠体重、肝组织病理切片、血清生化指标、抗氧化等指标后,发现本申请药用组合物与1,4-GL均具有缓解和延缓肝癌形成的作用,其中药用组合物的血清GSH指标组优于1,4-GL。相对标准品1,4-GL,本申请药用组合物的原料可从中药中提取,成本低廉,组成明确有望成为新的预防肝癌的一种有效手段。
以下以具体的实施例进行说明:
实施例1药用组合物的制备
1)葡萄糖二酸盐及其内酯和5-HMF的提取
将六味地黄丸粉碎,添加蒸馏水,加入适量氢氧化钠,超声,得提取液,提取液以硅藻土助滤或过半制备色谱柱,分别收集GA-GL和5-HMF组分,滤液,冷冻干燥后保存。
2)复溶提取物主药含量测定。
上述两个组分分别保存,使用时分别用蒸馏水溶解,按一定的比例配制成溶液型制剂。
各成分含量测定方法,分析条件:采用ACOQUITYBEH C18色谱柱分离柱;流动相的组成为:0.01%甲酸水溶液(A)-甲醇(B);流速为0.25mL/min;进样体积为2.0μL;分析总时间为8.0min;使用以下梯度洗脱:0-1.0min,90.0%A;1.0-4.0min,90.0%-10.0%A;4.0-5.0min,10.0%A;5.0-5.5min,10.0%-90.0%A;5.5-8.0min,90.0%A;色谱柱温度设置为40℃;
质谱条件:在多重反应监测模式(MRM)下进行定量分析化合物,电喷雾离子源采用正离子检测;电喷雾毛细管电压设定为3.0kV,氮气用作溶剂蒸发的干燥气体,流速为50L/h;离子源温度为100℃。各化合物的母离子分子量用于定性,子离子分子量用于定量。
根据标曲算出上述溶液型制剂中葡萄糖二酸盐及其内酯和5-HMF的浓度,结果为:
葡萄糖二酸的浓度为3.0mg/mL;葡萄糖二酸1,4內酯的浓度为:3.0mg/mL葡萄糖二酸3,6內酯的浓度为3.0mg/mL;5-HMF的浓度为0.8mg/mL。
实施例2
1.实验动物和分组给药
实验选用雄性SD大鼠作为实验对象,用DEN(二乙基亚硝胺)诱导大鼠肝癌模型,DEN一种良好的环境型肝癌造模剂,能模拟肝癌形成过程,即:肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌。周龄接近,体重180-200g SD大鼠,实验室适应性饲养一周后随机分组,分为:
a)正常对照组(Control组,注射剂量腹腔注射生理盐水)。
b)1,4-GL组(50mg/kg,标准品)。
c)DEN腹腔注射诱导肝癌模型组(DEN组,60.0mg/kg注射剂量腹腔注射给予DEN溶液)。
d)DEN+1,4-GL共干预组(50mg/kg剂量灌胃量给予1,4-GL和60.0mg/kg剂量腹腔注射给DEN溶液)。
e)DEN+中药提取液(实施例1制备的溶液型制剂)干预组(按GA-GL 45.0mg/kg(其中含1,4-GL 15.0mg/kg)、5-HMF 4.0mg/kg中药提取液灌胃和60.0mg/kg剂量腹腔注射给DEN溶液)。
2.样品收集
血清样品收集:各组SD大鼠均在饲养至第10周时眼眶取血约1.0mL/只;待第14周时,再次眼眶取血,每只大鼠取全血约5.0mL,血液室温静置、离心后取上层血清转移分装至新的1.5mL EP管中,于-80℃冰箱保存,待用。
肝组织样本收集:各组SD大鼠饲养至第14周后,取完血液样本后以颈椎脱臼法全部处死,立即进行生理学解剖,取出完整肝脏,一叶浸泡在福尔马林液中进行病理学检查;其余肝脏剪碎装入EP管中,于-80℃冰箱保存,用于下一步实验。
3.大鼠体重变化及大鼠存活率和致癌率
体重测定:在实验过程中,分别在药物干预前,药物干预第三周,药物干预第十周及第十四周处死动物前称量记录各组大鼠体重。
存活率和致癌率:实验结束后,统计各组存活大鼠的数量和DEN组成癌大鼠的数量;存活率=各组最终存货大鼠数量/各组实验前数量*100%;致癌率=DEN组成癌大鼠数量/实验前数量*100%。
4.HE染色
将泡在福尔马林液中肝组织,按照常规石蜡切片过程进行乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,3-5um厚度切片,苏木素,伊红染色。显微镜下细胞核被染成蓝紫色,细胞质和非细胞成分被染成不同程度的红色。
5.AFP的测定
将大鼠血清复溶,涡旋混匀,离心后取上清。使用鼠源AFP酶联免疫检测试剂盒(ELISA)检测各组大鼠血清中AFP的浓度,具体操作方法和结果计算参照南京建成科技有限公司试剂盒说明书。
6.芳香族氨基酸和Fisher’ratio值的计算
1)氨基酸浓度的测定
血清样本处理:将大鼠血清复溶,涡旋混匀,离心后取上清,用于衍生化检测。
肝脏组织样本处理:将肝脏组织取出解冻,称重后置于匀浆器中,分次将5.0mL80%甲醇加入进行匀浆,收集匀浆液,超声,离心后取上清液用于衍生化检测。
混合标准品的稀释:精密称量亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸标准品,配置成混合溶液,用80%乙腈依次稀释为浓度为100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01μg/mL 13个梯度稀释液。
取50.0μL已处理的样本上清液和相应浓度标准品混合溶液,加入50.0μL内标溶液,加入100.0μL三乙胺乙腈溶液,再加入100.0μL PITC乙腈溶液,涡旋混匀,室温静置1.0h后,加入正己烷800.0μL混匀,静置10.0min,此时溶液分为上下两层,取下层溶液50.0μL,加入450.0μL 20%乙腈-0.1%甲酸溶液,涡旋混匀,12000rpm离心10.0min,取上清200.0μL,进行UPLC-C18-QTOF-MS/MS检测分析,以内标的峰面积校准后比值计算各氨基酸浓度和Fisher’ratio。
计算公式:Fisher’ratio=BCAA/AAA=(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)/(苯丙氨酸+酪氨酸)
7.血清生化指标的测定
采用眼眶取血的方式,取完血后,在室温下静置30min,3000rpm离心15min,取上清液300.0μL,用装入冰袋的保温泡沫盒运送到江西省儿童医院,采用多功能生化仪测定血清中AST、ALT、ALP和γ-GGT含量。
8.氧化还原酶活性和组织MDA水平的测定
将血清复溶,涡旋混匀,离心后取上清;将肝脏组织取出解冻,称重后置于匀浆器中,以1:10(w/v)的比例加入无菌0.9%氯化钠溶液进行匀浆,收集匀浆液,超声,离心后取上清液,T-SOD,CAT,GSH活性和MDA水平测定用EnSpireTM多功能酶标仪(PerkinElmer),具体操作方法和结果计算参照南京建成科技有限公司试剂盒说明书。
实验结果:
1.大鼠存活率和致癌率及体重变化
本实验根据肝组织形态和组织切片来确定肝癌的发生,各组大鼠成癌率及生存率如表1所示,混合组大鼠生存率较单一组高15%。DEN组大鼠肝脏组织可见大量癌结节,其病理切片结果显示肝脏失去了正常的结构形态,异型性细胞多,形态不规则,核质分离严重,周围被粗大的纤维结缔组织包裹,大量炎症因子浸润;说明DEN诱导SD大鼠肝癌模型成功。
实验结束时,各组大鼠状态体重差异较大,DEN组大鼠,因为肝癌导致大鼠消化代谢功能紊乱,食欲减退,疾病累及全身各个脏器,体形消瘦实验结束时大鼠平均体重155±12g;反观DEN+1,4-GL和DEN+中药提取液干预组大鼠,相比DEN组体重均上升,DEN+1,4-GL组平均体重201±15g,DEN+中药提取液组平均体重212±23g,病理切片结果显示中药提取液干预后肝脏病变程度较低;说明1,4-GL和中药提取液对DEN所诱导大鼠肝癌具有一定的抵抗能力。
表1.DEN诱导肝癌大鼠成癌率和生存率
2.各组血清AFP的含量
AFP(血清甲胎蛋白)现已成为临床诊断肝癌的重要生物标志物,在肝癌患者体内会显著升高,本实验研究结果趋势与之一致,如图1中A所示,DEN组大鼠血清AFP含量上升,达到36.2±3.9ng/ml,1,4-GL共干预后AFP下调到25.7±3.3ng/ml,中药提取液共干预后AFP下调到27.1±2.8ng/ml,明显低于DEN组,均有正常水平21.3±2.4ng/ml的趋势,说明1,4-GL与中药提取液均具有一定的抗癌作用。
3.DEN诱导大鼠干预后血清Fisher’ratio
芳香族氨基酸代谢情况在一定程度上反应肝脏代谢能力,氨基酸Fisher’ratio值结果显示(图1中B),DEN组Fisher’ratio值显著下降,1,4-GL及中药提取物干预后血清Fisher’ratio显著上调,肝脏Fisher’ratio略微上调,有回归正常的趋势,说明1,4-GL及中药提取物均能恢复肝脏的氨基酸的代谢能力。
4.调节抗氧化酶活性和脂质过氧化提高机体抗氧化能力
抗氧化自由基反应在机体发生氧化应激时发挥着重要作用,能使组织器官免受一些毒性物质所致的不良反应。SOD(超氧化物歧化酶)是生物体组织中广泛分布,能将自由基转化为过氧化物和分子氧,再通过CAT(过氧化氢酶)将H2O2解离成水达到抗氧化自由基作用,GSH(谷胱甘肽)也是机体抗氧化系统的组成,参与对H2O2的还原反应,清除自由基;结果如图2,DEN组大鼠血清抗氧化酶SOD、CAT、GSH显著下降(P<0.05),1,4-GL或中药提取液干预后,SOD、CAT、GSH活性显著增强(P<0.05),其中中药提取液干预后,升高GSH的能力优于1,4-GL。
图3结果显示,肝组织SOD各组无显著变化;DEN组大鼠肝组织中CAT、GSH活性显著下降(P<0.05),1,4-GL及中药提取液干预后,CAT、GSH活性均有明显上升,中药提取液干预后,升高GSH的能力优于1,4-GL。
肝组织中脂质过氧化终产物之一MDA水平显著上升,1,4-GL或中药提取物干预后,MDA水平显著下调(P<0.05),表明1,4-GL和中药提取物可以通过提高机体抗氧化能力和抗脂质过氧化来发挥预防肝癌的作用。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.用于预防和/或治疗肝癌的药用组合物,其特征在于,包括单体成分A和B,其中A为葡萄糖二酸盐及其内酯,所述葡萄糖二酸盐及其内酯包括葡萄糖二酸盐、葡萄糖二酸1,4内酯和葡萄糖二酸3,6内酯,所述葡萄糖二酸盐、葡萄糖二酸1,4内酯和葡萄糖二酸3,6内酯的质量比为1:1:1;B为5-羟甲基糠醛;所述葡萄糖二酸盐及其内酯与5-羟甲基糠醛的质量比为10~15:1。
2.如权利要求1所述的药用组合物在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述药物中含有有效治疗量的所述药用组合物和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为口服制剂。
5.一种用于肝癌预防和/或治疗的药物,其特征在于,包含有效治疗量的如权利要求1所述的药用组合物及药学上可接受的载体。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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