CN101167887A - 口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药及其制备方法，它是从植物枸杞中经水提回流、醇沉、有机溶剂脱水、真空干燥获得其有效成分——枸杞粗多糖。经药理实验证明，它具有降糖、降脂、抗氧化和改善肾功能的作用，其疗效持久，无毒副作用，可用于治疗NIDDM及其引起的肾脏并发症。为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)引起的并发症--糖尿病肾病(DN)患者的治疗提供了一种天然药物。

Description

口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM，即II型)并发症-糖尿病肾病(DN)的非合成药物，它是以中草药为原料制备而成的。

背景技术

糖尿病己继肿瘤、心脑血管疾病之后成为第三位危害人类健康的慢性非传染性疾病。世界卫生组织及国际糖尿病联盟资料表明预计到2025年全世界糖尿病患者总人数将达到3.33亿，而根据我国公布的19省市糖尿病普查结果显示随着人群平均寿命延长，经济收入的增加和生活方式的改变(如多食少动、精神紧张、吸烟饮酒等)，糖尿病人总数将以每年至少100万的数量增加，其中NIDDM占全部患者的90％以上。

DN是NIDDM的一种常见而严重的并发症，也是糖尿病患者致死的重要原因。目前对DN的发病机制尚不清楚，亦缺乏有效的治疗手段，DN的防治消耗了大量的医疗资源，给世界各国带来了巨大的医疗压力和沉重的经济负担，医学界对该病的防治也感到非常棘手。目前研究显示，西医药尚缺乏安全有效的手段从各方面改善DN，而且药物种类少，价格昂贵，长期使用效果不佳，或有较严重的副作用。而中医药从辨病辨证论治的角度出发，根据DN的病证特点，从整体水平上加以综合调理，可以使DN症状减轻。因此，从天然药物中筛选和研究有效的方法治疗DN对于延长患者的寿命，提高生活质量也具有重大意义，逐渐受到全世界的普遍关注。

枸杞子(Wolfberry fruit)系茄科植物枸杞的干燥果实，性甘平，其功用补肾养阴，治虚劳消渴，益精明目之功效，是传统名贵中药，素有“红宝”美称，主要生长在中国北方的内蒙、宁夏、河北等省，枸杞多糖(LyciumBarbarum polysaccharides，LBP)是其有效成分之一，它是酸性杂多糖与多肽或蛋白质构成的复合多糖，含有多种营养成分，其药理作用广泛。目前对于LBP的研究较多的是其增强免疫，耐缺氧，延缓衰老等作用，而其对NIDDM及其并发症的防治机制的研究国内外未见有关的报道。为了进一步阐明枸杞子的药理作用，本发明对其多糖进行提取分离，并对其治疗糖尿病肾病效果进行了研究，发现枸杞具有明显的降血糖、降血脂和改善肾功能的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞单方口服治疗糖尿病肾病中药及其制备方法，所述口服治疗糖尿病肾病的单方中药为中药枸杞提取物，中药枸杞经适当的工艺处理得到的提取物，可作为一种非合成的药物用于临床NIDDM及其肾病并发症的治疗。

所述中药枸杞提取物含有枸杞粗多糖成分，通过药理及动物试验证明上述提取物具有降血糖、降血脂及治疗糖尿病肾病等新的医药用途。

枸杞提取物的制备：

(1)将枸杞80℃下烘干，粉碎；

(2)以氯仿∶甲醇体积比为2∶1，50～60℃下回流脱脂2次，每次4～5h，残渣20～60℃下沉淀12～18h；

(3)用80％乙醇60～80℃下回流2次，每次4～5h；

(4)残渣加5～10倍蒸馏水于60～100℃提取3～4次，每次1.5～2h；

(5)合并滤液并用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩；

(6)于浓缩液中加入5倍体积分数为70～95％的乙醇，于冰箱冷藏静置12h后，2000r/min离心5min；

(7)沉淀物加入38％醋酸溶液完全溶解时搅拌提取，滤除不溶物，滤液中加入3倍量的80～95％乙醇沉淀；

(8)沉淀物先后用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得到枸杞粗多糖。

本发明的有益效果：本发明通过多项实验证明中药枸杞提取物具有降低血糖、血脂、改善糖尿病肾功能的损伤，保护机体免受“自由基”的损害等功效。本发明为NIDDM提供一种非合成降糖药，其功能明确、作用持久、无毒副作用，拓宽了枸杞子治疗疾病的范围。

药效实验例：对NIDDM大鼠降糖、降脂及治疗肾病的实验。

实验通过对本发明的药物进行药理学研究，观察其对NIDDM大鼠血糖，血脂及肾功能的影响。

1.实验材料：

1.1动物：清洁级雄性Wistar大鼠，均为50-60天年龄，体重240-250g，由协和医院动物研究所提供。自由饮用自来水，清洁级动物饲养房，温湿度适宜，光照8-10h/d。

1.2试剂：枸杞子，采自宁夏，并经中医专家和《中国常用中草药》、《中国常用中草药彩色图谱》对照鉴定为枸杞子；链脲佐菌素，美国Sigma公司产品；TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA、SOD、MDA、NO试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；尿微量白蛋白试剂盒(ELISA)为上海太阳生物技术公司产品；尿素氮试剂盒、肌酐试剂盒为四川省迈克科技有限责任公司产品。

2.实验方法

2.1非胰岛素依赖型糖尿病大鼠模型的构建：Wistar大鼠予以高糖高热量饮食(10％蔗糖，10％猪油，1％胆固醇)至4周后用0.25％STZ(溶于0.1mol/L、PH4.2柠檬酸缓冲液，现用现配)以50mg/kg剂量一次性腹腔注射1.5m1.其后自由进普通饲料，饮自来水，72h后测空腹血糖。

2.2枸杞粗多糖的制备

(1)将枸杞80℃下烘干，粉碎；

(2)以氯仿∶甲醇(2∶1)60℃下回流脱脂2次，每次4h，残渣60℃沉淀12h；

(3)用80％乙醇80℃下回流2次，每次4h；

(4)残渣加100ml蒸馏水于80℃提取3次，每次1.5h；

(5)合并滤液并减压蒸馏浓缩；

(6)于浓缩液中加入5倍体积分数为90％的乙醇，于冰箱冷藏静置12h后，2000r/min离心5min；

(7)沉淀物加入38％醋酸溶液完全溶解时搅拌提取，滤除不溶物，滤液中加入3倍量的95％乙醇沉淀。

(8)沉淀物先后用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得到枸杞粗多糖。

2.3实验分组

将50只Wistar大鼠随机分为正常对照组(8只)、造模组(40只)。成模后的大鼠随机分为模型对照组、枸杞多糖组(80mg/kg)和罗格列酮组(3mg/kg)，各8只，灌胃4周。

2.4糖耐量的测定

口服糖耐量试验在LBP处理后的第15d和第30d进行。大鼠禁食12h后按2g/kg体重灌胃葡萄糖，尾静脉采血分别测定0min、30min、60min、90min和120min时的血糖。

2.5急性毒理实验

采用最大浓度最大体积(40mL/kg)一次性灌胃昆明小鼠(19-21g)，连续观察7d，记录受试小鼠的行为、活动、摄食量、体重、粪便和死亡等情况，未死亡的小鼠于1周后处死进行尸检。

2.6血脂及尿生化指标测定

禁食12h后，从眼眶取血2ml，取出后立即2000r/min，4℃，离心10min，获得血清用来测定血清胆固醇、三脂酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白水平和肾功能指标，利用试剂盒，在OLYMPUS生化分析仪上测定。尿生化指标测定每个样本取20μl尿液用全自动生化分析仪测定血Scr、Ucr和BUN，并计算内生肌酐清除率。

(1)肾重/体重  根据公式肾重/体重(％)＝[双侧肾脏重量之和(g)/体重(g)]×100进行计算。

(2)肌酐清除率(Clearance Rate of Creatinine，Ccr)  根据公式Ccr＝[尿肌酐浓度×24h尿量(mL)]/(血肌酐浓度×60×60)，并以体重进行矫正，最终结果用mL/(min×kg)表示。

2.7 ELISA法测定各大鼠的尿微量白蛋白

即将不同浓度的标准品(标准品浓度分别为8、16、32、64、128、256、512ng/mL)或待测标本100μl，空白对照孔加入稀释液100μl，分别加入已经白蛋白抗体包被的96孔板各孔中，37℃孵育90min后，弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3s，甩干，反复三次后拍干。每孔加酶标抗体100μl，37℃孵育60min后，弃去反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3s，甩干，反复三次后拍干。每孔加底物液100μl 37℃孵育15-20min后，每孔加终止液50μl终止反应，然后在酶标仪上492nm处，以空白孔调零，测定各孔A值。然后在标准曲线上查出其相应的浓度。根据所测结果再与其尿量相乘，即为其24h的尿微量白蛋白。

2.8肾皮质SOD、MDA、CAT、GPx、GST和GSH的测定

化学比色法检测，都按试剂盒说明书操作。

3本发明的实验结果：

3.1 LBP对NIDDM大鼠糖耐量的影响

LBP处理后第30天，大鼠禁食12h后按2g/kg体重灌胃葡萄糖，尾静脉采血分别测定0min，30min，60min，90min和120min血糖。模型对照组大鼠血糖水平在给予葡萄糖后30min血糖水平达到高峰，尽管此后血糖水平开始下降，但是120min后血糖水平仍然很高。LBP处理组与模型对照组比较，60min和120min后血糖水平降低，并且在120min末，LBP组和罗格列酮组比较血糖接近正常水平。LBP处理组和罗格列酮组比较没有统计学差异(P＞0.05)。

表1 LBP对胰岛素抵抗的NIDDM大鼠糖耐量的影响

组别	0min	30min	60min	90min	120min
						正常对照组模型对照组LBP(80mg/kg)罗格列酮(3mg/kg)	4.29±0.7117.1±1.83★8.03±1.01★7.15±0.90★	8.9±1.0326.11±2.21★10.71±1.12★12.37±1.14★	7.56±0.9623.53±2.09★9.1±1.04★10.51±1.13★	6.35±0.8620.09±1.97★7.27±0.92★9.05±1.02★	5.35±0.8417.96±1.84★6.08±0.89★7.86±0.90★

数值被表示为平均值±S.D.(每组8只大鼠)。数据均米用SPSS13.0统计软件包在微机上进行统计分析。资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05有统计学意义。模型对照和正常对照组比较，LBP和罗格列酮组与模型对照组比较，^▲P＜0.05，^★P＜0.01。

3.2急性毒理试验结果

20只小鼠给药当天毛色光滑，活动、饮食、粪便色泽与质地均正常，观察LBP 24h灌胃后产生的急性毒性和死亡情况。给小鼠灌胃，使药物达到最大浓度(溶液已经非常浓，很难再对其进行浓缩)，1周内无死亡及其它异常现象发生。处死后进行尸检，各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)经肉眼观察未见明显异常改变。说明LBP实际无毒较安全。

3.3 LBP对NIDDM大鼠血脂的影响

LBP对胰岛素抵抗的NIDDM大鼠血脂的影响结果出示在表2.LBP处理4周，HDL-C浓度比模型对照组显著增加，但是TG，TC和LDL-C水平明显降低。与模型对照组比较，HDL-C水平在LBP和罗格列酮组分别增加18.42％(P＜0.01)，14.47％(P＜0.01)，TC水平在LBP和罗格列酮组分别降低28.03％(P＜0.01)，26.99％(P＜0.01)，  LDL-C水平在LBP和罗格列酮组分别降低44.44％(P＜0.01)和41.42％(P＜0.01)。TG水平在LBP和罗格列酮组分别降低17.07，17.08％(P＜0.01)。总之，LBP表现出最佳效果。以上结果表明LBP不仅对NIDDM大鼠具有降低血糖的功能还具有降低血脂的作用。

表2 LBP对胰岛素抵抗的NIDDM大鼠TC，TG，HDL-C和LDL-C水平的影响

组别	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)	HDL-C(mmol/L)	LDL-C(mmol/L)
					正常对照组模型对照组LBP(80mg/kg)罗格列酮(3mg/kg)	2.03±0.162.89±0.17★2.08±0.17★2.11±0.21★	0.85±0.151.23±0.15★1.02±0.14★1.02±0.08★	0.93±0.210.76±0.17▲0.90±0.20★0.87±0.22★	0.50±0.230.99±0.24★0.55±0.09★0.58±0.13★

数值被表示为平均值±S.D.(每组8只大鼠)。数据均采用SPSS13.0统计软件包在微机上进行统计分析。资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05有统计学意义。模型对照和正常对照组比较，LBP和罗格列酮组与模型对照组比较，^▲P＜0.05，^★P＜0.01。

3.4 LBP对NIDDM大鼠尿素氮(BUN)，尿蛋白(urinary albumin)，血肌酐(Scr)，肾重/体重(kidney weight/body weight)，和Ccr的影响

我们检测LBP对MDDM大鼠肾功能的影响，结果出示在表3，模型对照组与正常对照组比BUN，urinary albumin，Scr，肾重/体重，和Ccr水平均显著增高(P＜0.01)。经LBP处理4周后，与模型对照组相比，这些肾功能指标明显降低(P＜0.01)，并且LBP与罗格列酮组比没有统计学差异(P＞0.05)。这表明，LBP能改善NIDDM大鼠的肾损伤。

表3 LBP对胰岛素抵抗的非胰岛素依赖型糖尿病大鼠BUN，urinary albumin，scr，kidney weight/bodyweight，和Ccr的影响

组别	BUN(mmol/L)	Urinary albumin(mg/24h)	Scr(mmol/L)	Kidney weight/body weight(％)	Ccr(ml/min/100g)
						正常对照组模型对照组LBP(80mg/kg)罗格列酮(3m/kg)	3.51±0.3410.53±0.71★5.83±0.35★5.48±0.31★	4.61±1.2115.13±4.16★7.11±1.22★7.04±1.05★	32.16±6.1244.98±8.14★33.31±10.27★33.29±10.24★	5.25±0.2710.86±1.04★5.32±0.68★5.29±0.66★	2.47±0.204.94±0.31★3.08±0.32★3.10±0.34★

数值被表示为平均值±S.D.(每组8只大鼠)。数据均采用SPSS13.0统计软件包在微机上进行统计分析。资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05有统计学意义。模型对照和正常对照组比较，LBP和罗格列酮组与模型对照组比较，^▲P＜0.05，^★P＜0.01。

3.5LBP对NIDDM大鼠肾皮质的抗氧化作用的影响

活性氧是糖尿病及其血管并发症的重要病理因素之一。为了研究LBP对NIDDM大鼠肾脏活性氧的影响，我们进行了大鼠肾皮质SOD、CAT、GPx、GST活性、MDA水平和降低的GSH的浓度的检测。表6显示，与正常对照组比，模型组大鼠肾皮质的SOD、CAT、GPx、GST活性和GSH浓度显著降低，但是MDA水平增高(P＜0.01)。这进一步证实了活性氧在DN的发病机制中起到了重要作用。经LBP和罗格列酮处理4w后，糖尿病大鼠肾皮质的SOD、CAT、GPx、GST活性和GSH浓度升高，MDA水平降低，而且这些效果在LBP组表现更为显著。以上结果表明，LBP对NIDDM大鼠的肾脏具有抗氧化功能，这种功能与增强肾脏的抗氧化酶的活性有关。

表6 LBP对NIDDM大鼠肾皮质抗氧化作用的影响

组别	CAT	SOD	GPx	GST	GSH(mg/100mg tissue)	MDA(nmol/mg·prot)
							正常对照组模型对照组	38.54±3.8121.35±1.81★	13.31±0.287.19±0.37★	7.69±0.114.88±0.23★	6.98±0.433.37±0.15★	36.28±1.7722.66±1.23★	2.48±0.735.14±0.61★

LBP(80mg/kg)罗格列酮(3mg/kg)

32.47±3.11★28.83±1.47★

11.17±0.3★9.13±0.22★

7.25±0.43★6.56±0.15●△

6.30±0.37★5.75±0.46★

32.78±1.74★28.19±1.41★

3.61±1.02★3.69±1.05★

数值被表示为平均值±S.D.(每组8只大鼠)。数据均米用SPSS13.0统计软件包在微机上进行统计分析。资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05有统计学意义。模型对照和正常对照组比较，LBP和罗格列酮组与模型对照组比较，^★P＜0.01。

3.讨论

本动物实验经重复实验证明效果可靠，同时该动物停药后三个月，再测血糖，血糖仍维持在正常水平，精神状态很好。本研究中NIDDM模型大鼠血糖，血脂升高，肾功能异常，LBP能使血糖、血脂降低，肾功能改善，说明该药物可用于NIDDM及其糖尿病肾病的治疗。

此外，本发明可根据实际情况制备成胶囊剂、散剂、颗粒剂或片剂提供临床应用，在制备上述制剂时可加入适量淀粉或其它辅料作为添加剂。

Claims (4)

1.一种口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药，其特征是：所述口服治疗糖尿病肾病的单方中药为枸杞提取物，所述枸杞提取物含有枸杞粗多糖成分；通过药理及动物试验证明上述提取物具有降血糖、降血脂及治疗糖尿病肾病等新的医药用途。

2.一种制备权利要求1所述的口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药的方法，其特征是：所述枸杞提取物的制备方法是：

(1)提取：将枸杞子80℃烘干后粉碎，以氯仿∶甲醇体积比为2∶1，50～60℃下回流脱脂2次，每次4～5小时，残渣20～60℃下沉淀12～18h；用80％乙醇60～80℃下回流2次，每次4～5小时；残渣加5～10倍蒸馏水，60～100℃回流提取3～4次，每次1.5～2小时，合并滤液；

(2)浓缩：利用旋转蒸发仪减压浓缩；

(3)醇沉：于浓缩液中加入5倍体积浓度70～95％的乙醇；

(4)离心：醇沉后放入冰箱冷藏静置12h后，2000转/分离心5分钟；离心后沉淀物加入38％醋酸溶液完全溶解时搅拌提取，滤除不溶物，滤液中加入3倍量的80～95％乙醇沉淀；

(5)脱水：沉淀物先后用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤；

(6)真空干燥，获得枸杞提取物。

3.根据权利要求2所述的口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药的方法，，其特征是：上述提取物可制备成胶囊剂、散剂、颗粒剂或片剂在临床应用。

4.根据权利要求3所述的口服治疗糖尿病肾病的枸杞单方中药的方法，，其特征是：可加入适量淀粉或其它辅料作为添加剂。