CN101596268B

CN101596268B - 大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物和食品中的应用

Info

Publication number: CN101596268B
Application number: CN2009101042509A
Authority: CN
Inventors: 罗红; 高钰琪
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2029-07-03
Also published as: CN101596268A

Abstract

本发明公开了大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物和食品中的应用，体内外实验结果显示，大蒜总皂苷具有较强的抗氧化应激损伤活性，可以制成抗氧化应激损伤药物，用于预防和治疗氧化应激损伤，还可以作为膳食补充剂，用于制备抗氧化应激损伤食品，适合健康人群抗衰老或心血管疾病、糖尿病等氧化应激损伤相关性疾病患者食用，具有疗效显著、安全无毒、原料来源广泛、成本低廉等优点，应用前景广阔，可以取得很好的社会效益和经济效益。

Description

大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物和食品中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物有效部位的新应用，特别涉及大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物和食品中的应用。

背景技术

氧化应激损伤是指由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)过度产生与抗氧化防御机制减弱两者平衡失调造成的组织损伤。ROS的形成是机体许多生化反应过程中不可避免的副产物，在通常情况下，体内ROS很快被体内的抗氧化防御体系清除，不会在体内蓄积引起组织和细胞的损害，但当ROS产生过多或/和机体抗氧化能力下降时，ROS引起的氧化应激就会发生，可加速人体衰老、增加肿瘤的发生率、加重机体器官如心血管的损伤等。ROS主要包括超氧阴离子(O₂·^-)、羟自由基(HO·)和过氧化氢等。抗氧化防御体系主要包括抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)和小分子抗氧化剂(如维生素E、维生素C等)。氧化应激引起蛋白质氧化损伤即蛋白质羰基化或硝基化，DNA氧化损伤产生8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OH-dG)标志性氧化产物，脂质氧化损伤产生过氧化脂质(LPO)及其降解产物丙二醛(MDA)等，使蛋白质、核酸和脂质的结构和功能遭到破坏，进而导致细胞损伤和功能障碍。近年来的研究表明，氧化应激反应可能是机体许多重要生物学事件的关键环节，人体的衰老和许多疾病的发生均与之相关，最常见疾病有心血管疾病、癌症、骨关节炎、风湿性关节炎、糖尿病以及神经退化性疾病如阿尔兹海默症、帕金森病等，提示抗氧化应激损伤治疗可望成为延缓人体衰老、防治心血管疾病等诸多疾病的新途径。因此，疗效显著且毒副作用小的抗氧化应激损伤药物的研制成为临床的迫切需求。

大蒜为百合科植物大蒜Allium sativum L.的干燥鳞茎，在全世界普遍种植，为药食同源植物，在人们日常膳食中具有重要地位。大蒜不但有抗菌、消炎、杀虫等作用，还有降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗衰老以及增强机体免疫力等多种功效。大蒜总皂苷是大蒜中一类重要活性物质，大量文献报道，其具有抗真菌、抗肿瘤、降低胆固醇和降低血液凝固性等多种活性，但迄今为止，尚未见大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物和食品中的应用报道。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供大蒜总皂苷的新应用。

为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物中的应用。

进一步，所述大蒜总皂苷由以下方法制得：取蒜粉，用体积百分浓度为40％～80％的乙醇提取，离心，上清液回收乙醇并浓缩，浓缩提取液过大孔树脂柱，先用水洗涤除去水溶性成分，再用体积百分浓度为40％～80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，即得大蒜总皂苷；

进一步，所述浓缩提取液先用乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯萃取液，再用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，残余物用水溶解后过大孔树脂柱。

在本发明的第二方面，提供了大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤食品中的应用。

本发明的有益效果在于：体内外实验结果显示，大蒜总皂苷具有较强的抗氧化应激损伤活性，可以作为活性物质，单独使用或与其它药物组成复方使用，并与药学上可接受的载体按照药学领域的常规方法制成各种剂型的抗氧化应激损伤药物，用于预防和治疗氧化应激损伤；还可以作为膳食补充剂，用于制备抗氧化应激损伤食品，适合健康人群抗衰老或心血管疾病、糖尿病等氧化应激损伤相关性疾病患者食用，具有疗效显著、安全无毒、原料来源广泛、成本低廉等优点，应用前景广阔，可以取得很好的社会效益和经济效益。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为Western blot法检测缺氧时分化型PC12细胞SOD2的蛋白表达；

图2为Western blot法检测缺氧时分化型PC12细胞CAT的蛋白表达；

图3为Western blot法检测缺氧时分化型PC12细胞p65核转位；

上述各图中，M泳道为蛋白质分子量标准，H泳道为缺氧对照组，N泳道为常氧对照组，G泳道为样品组。

具体实施方式

下面对大蒜总皂苷的抗氧化应激损伤活性进行详细的描述。

实施例1、大蒜总皂苷的制备

取脱水蒜粉1kg，加入体积百分浓度为70％的乙醇3L，在充分搅拌的条件下浸提72小时，温度10℃离心，取上清液，旋转蒸发除去乙醇并适当浓缩，浓缩提取液过D101型大孔树脂柱，先用8倍以上柱体积的蒸馏水洗柱除去水溶性成分，再用约5倍柱体积的体积百分浓度为70％的乙醇洗脱(用紫外检测仪检测上样和洗脱曲线，恒流泵控制上样和洗脱速度)，收集洗脱液，旋转蒸发回收溶剂，残余物冷冻干燥，即得大蒜总皂苷(淡黄色蓬松细长粉末)7.83g，提取率为0.783％(以脱水蒜粉计)。

实施例2、大蒜总皂苷的制备

取脱水蒜粉1kg，加入体积百分浓度为70％的乙醇3L，在充分搅拌的条件下浸提72小时，温度10℃离心，取上清液，旋转蒸发除去乙醇并适当浓缩，浓缩提取液用乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯萃取液，再用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，旋转蒸发除去正丁醇，残余物用水溶解后过D101型大孔树脂柱，先用8倍以上柱体积的蒸馏水洗柱除去水溶性成分，再用约5倍柱体积的体积百分浓度为70％的乙醇洗脱(用紫外检测仪检测上样和洗脱曲线，恒流泵控制上样和洗脱速度)，收集洗脱液，旋转蒸发回收溶剂，残余物冷冻干燥，即得大蒜总皂苷(淡黄色蓬松细长粉末)1.73g，提取率为0.173％(以脱水蒜粉计)。薄层色谱和含量测定结果显示，本实施例制备的大蒜总皂苷的纯度高于实施例1制备的大蒜总皂苷。

实验例、大蒜总皂苷的抗氧化应激损伤活性检测

1、大蒜总皂苷对低压性缺氧小鼠氧化应激损伤的保护作用

方法：将体重18～20g的SPF级BABL/C雄性小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)随机分成样品组、平原对照组和缺氧对照组(每组6只)，样品组灌胃实施例1制备的大蒜总皂苷200mg/kg(体积10mL/kg)，平原对照组和缺氧对照组分别灌胃等体积蒸馏水，每天1次，连续8天，末次灌胃1小时后，平原对照组小鼠在常规条件下饲养，样品组和缺氧对照组小鼠置低压氧仓中在模拟海拔高度7700米减压7小时，减压完毕后立即断颈处死各组小鼠，迅速取其大脑、心肌和肝脏组织置液氮中保存；将冻存组织解冻后匀浆，采用总抗氧化能力(T-AOC)测试盒、MDA测试盒、SOD测试盒、CAT测试盒和蛋白质羰基试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定各项抗氧化指标。

结果：见表1，样品组大脑、心肌和肝脏组织的T-AOC均较缺氧对照组提高，肝脏的MDA含量较缺氧对照组减少而SOD活性较缺氧对照组显著增加，大脑的蛋白质羰基含量较缺氧对照组显著减少而CAT活性较平原对照组和缺氧对照组显著增加，表明大蒜总皂苷可以明显提高低压性缺氧小鼠的抗氧化应激损伤能力，从而对低压性缺氧损伤起到保护作用。

表1 大蒜总皂苷对低压性缺氧小鼠氧化应激损伤的保护作用(x±sd，n＝6)

注：^*与缺氧对照组相比，p＜0.05；^**与缺氧对照组相比，p＜0.01；^#与平原对照组相比，p＜0.05；^##与平原对照组相比，p＜0.01。

2、大蒜总皂苷对缺氧时分化型PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

方法：用浓度为50ng/μL的神经生长因子(NGF)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12，CRL-1721，购自ATCC公司)分化7～9天，制得分化型PC12细胞；设置样品组、常氧对照组和缺氧对照组，样品组将分化型PC12细胞用含有大蒜总皂苷的低血清DMEM高糖培养基(含有浓度为10ng/mL的实施例2制备的大蒜总皂苷、质量百分浓度为1％的马血清和质量百分浓度为1％的胎牛血清)培养，常氧对照组和缺氧对照组用低血清DMEM高糖培养基(含有质量百分浓度为1％的马血清和质量百分浓度为1％的胎牛血清)培养，2小时后，常氧对照组用无血清DMEM高糖培养基常规培养，样品组和缺氧对照组用无血清DMEM高糖培养基在氧气浓度为20mL/L的条件下缺氧培养，24小时后，分别收集细胞和培养上清，采用MDA测试盒、SOD测试盒和CAT测试盒测定细胞匀浆液的各项抗氧化指标，采用8-OH-dG ELISA试剂盒(Uscnlife Science & TechnologyCompany)测定培养上清内8-OH-dG的含量。

结果：见表2，大蒜总皂苷可以显著降低细胞MDA和8-OH-dG的产量，显著增加SOD和CAT的活性(p＜0.01)，表明大蒜总皂苷可以明显提高缺氧时分化型PC12细胞的抗氧化应激损伤能力。

表2 大蒜总皂苷对缺氧时分化型PC12细胞氧化应激损伤的保护作用(x±sd，n＝3)

注：^*与常氧对照组相比，p＜0.01；^#与缺氧对照组相比，p＜0.01。

3、大蒜总皂苷对缺氧时分化型PC12细胞氧化应激相关基因表达的影响

方法：用浓度为50ng/μL的NGF诱导PC12细胞分化7～9天，制得分化型PC12细胞；设置样品组、常氧对照组和缺氧对照组，样品组将分化型PC12细胞用含有大蒜总皂苷的低血清DMEM高糖培养基(含有浓度为10ng/mL的实施例2制备的大蒜总皂苷、质量百分浓度为1％的马血清和质量百分浓度为1％的胎牛血清)培养，常氧对照组和缺氧对照组用低血清DMEM高糖培养基(含有质量百分浓度为1％的马血清和质量百分浓度为1％的胎牛血清)培养，2小时后常氧对照组用无血清DMEM高糖培养基常规培养，样品组和缺氧对照组用无血清DMEM高糖培养基在氧气浓度为20mL/L的条件下缺氧培养，24小时后，收集细胞，裂解，分别提取细胞总蛋白、核蛋白和胞浆蛋白，用Western blot法检测SOD2和CAT的蛋白表达以及p65核转位，以β-actin为内参照，阳性条带以Gel pro4.0凝胶光密度分析软件进行分析，测定IOD值(积分光密度值)。

结果：见表3～4及图1～3，大蒜总皂苷可以显著提高缺氧时分化型PC12细胞SOD2和CAT的蛋白表达水平，可以降低p65核转位。

表3 大蒜总皂苷对缺氧时分化型PC12细胞SOD2和CAT蛋白表达的影响(x±sd，n＝3)

注：^*与常氧对照组相比，p＜0.05；^#与缺氧对照组相比，p＜0.05；&与常氧对照组或缺氧对照组相比，p＜0.01。

表4 大蒜总皂苷对缺氧时分化型PC12细胞p65核转位的影响

注：^*与同组的胞浆值相比，p＜0.01；^#与缺氧对照组的胞核值相比，p＜0.01。

上述实验结果显示，大蒜总皂苷具有显著的抗氧化应激损伤活性，可以作为活性物质，单独使用或与其它药物组成复方使用，并与药学上可接受的载体按照药学领域的常规方法制成各种剂型的抗氧化应激损伤药物，用于预防和治疗氧化应激损伤；还可以作为膳食补充剂，用于制备抗氧化应激损伤食品。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物中的应用，所述大蒜总皂苷由以下方法制得：取蒜粉，用体积百分浓度为40％～80％的乙醇提取，离心，上清液回收乙醇并浓缩，浓缩提取液过大孔树脂柱，先用水洗涤除去水溶性成分，再用体积百分浓度为40％～80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，即得大蒜总皂苷。

2.大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤药物中的应用，所述大蒜总皂苷由以下方法制得：取蒜粉，用体积百分浓度为40％～80％的乙醇提取，离心，上清液回收乙醇并浓缩，浓缩提取液先用乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯萃取液，再用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，残余物用水溶解后过大孔树脂柱，先用水洗涤除去水溶性成分，再用体积百分浓度为40％～80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，即得大蒜总皂苷。

3.大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤食品中的应用，所述大蒜总皂苷由以下方法制得：取蒜粉，用体积百分浓度为40％～80％的乙醇提取，离心，上清液回收乙醇并浓缩，浓缩提取液过大孔树脂柱，先用水洗涤除去水溶性成分，再用体积百分浓度为40％～80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，即得大蒜总皂苷。

4.大蒜总皂苷在制备抗氧化应激损伤食品中的应用，所述大蒜总皂苷由以下方法制得：取蒜粉，用体积百分浓度为40％～80％的乙醇提取，离心，上清液回收乙醇并浓缩，浓缩提取液先用乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯萃取液，再用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，回收正丁醇，残余物用水溶解后过大孔树脂柱，先用水洗涤除去水溶性成分，再用体积百分浓度为40％～80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，即得大蒜总皂苷。