TWI442926B - 用於抑制巨噬細胞活化之醫藥組合物及其用途 - Google Patents

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Description

用於抑制巨噬細胞活化之醫藥組合物及其用途
本發明係關於(-)-表兒茶素-3-O-β-D-吡喃阿洛糖苷((-)-Epicatechin-3-O-β-D-allopyranoside)於抑制巨噬細胞活化之應用，尤其是治療巨噬細胞活化綜合症(macrophage activation syndrome，MAS)、治療或抑制發炎、及抑制基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表現之應用。
巨噬細胞是由組織內的單核細胞分化而產生的白血球細胞。巨噬細胞可經由吞噬(phagocytose)病原體或細胞殘餘物而參與先天性免疫反應，或藉由刺激其他免疫細胞(如淋巴球)而協助啟動適應性免疫反應，以對抗病原體。
大部分巨噬細胞會聚集在易於遭受微生物入侵的組織器官中，且根據其存在位置之不同而有各種名稱；舉例言之，位於肝臟的巨噬細胞稱作庫弗細胞(Kupffer cell)；位於脾臟的巨噬細胞稱作竇內襯細胞(Sinusoidal lining cell)；位於骨頭的巨噬細胞稱作破骨細胞(Osteoclast)；位於腎臟的巨噬細胞則稱作系膜細胞(Mesangial cell)。
儘管巨噬細胞可幫助動物體對抗病原體以避免受其感染，然而，過度的巨噬細胞活化(或活性)會造成體內免疫系統失調，而導致各種發炎性疾病(例如關節炎、肝炎或脾臟炎)、甚至癌症(例如肉癌、前列腺癌、神經膠母細胞癌、黑色素癌、肺癌、胰臟癌、或卵巢癌)的產生，例如導致巨噬細胞活化綜合症(macrophage activation syndrome，MAS)。
鑒於巨噬細胞之過度活化會產生上述各種疾病，因此，須要一種可有效抑制巨噬細胞活化之藥物或方法，以治療因巨噬細胞過度活化所衍生之疾病。
本發明即係針對上述需求所為之研究，本案發明人研究後發現，(-)-表兒茶素-3-O-β-D-吡喃阿洛糖苷((-)-Epicatechin-3-O-β-D-allopyranoside)可有效抑制巨噬細胞之活化，故可用於治療與巨噬細胞過度活化相關的疾病。
本發明之一目的在於提供一種用於抑制巨噬細胞活化之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分及一醫藥上可接受之載劑，該活性成分係選自以下群組之至少一者：式(I)化合物、其醫藥上可接受鹽及醫藥上可接受酯：
本發明之另一目的在於提供一種用於抑制巨噬細胞活化之方法，其係包含使一個體施用一有效量之上述醫藥組合物。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
於本文中(尤其後附申請專利範圍中)，除非另外說明，所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
巨噬細胞可受到各種致發炎因子刺激而活化，包括物理性因子(如溫度、紫外線)、化學性因子(如酸、鹼)、機械性因子(如擠壓、碰撞)、生物性因子(如脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)、病毒感染、毒素)、或自體免疫性疾病等。發炎反應會刺激免疫系統製造大量細胞激素，而促使巨噬細胞增生與活化，巨噬細胞會進一步製造出自由基(例如一氧化氮)，以進行後續免疫反應，例如毒殺病毒、細菌或腫瘤細胞等。惟，如上所述，若發炎反應持續發生，則會使巨噬細胞過度活化，造成各種相關疾病。本案發明人研究發現，(-)-表兒茶素-3-O-β-D-吡喃阿洛糖苷((-)-Epicatechin-3-O-β-D-allopyranoside，下文簡稱「ECAP」)可有效抑制巨噬細胞之活化，故可用於治療與巨噬細胞過度活化相關的疾病。
因此，本發明係提供一種用於抑制巨噬細胞活化之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分及一醫藥上可接受之載劑，該活性成分係選自以下群組之至少一者：式(I)化合物、其醫藥上可接受鹽及醫藥上可接受酯：
較佳地，該活性成分係式(I)化合物。
式(I)化合物即ECAP，其係來自台灣骨碎補(Davallia formosana )。由於ECAP可有效抑制巨噬細胞之活化，故可用於治療巨噬細胞活化綜合症、及治療或抑制發炎或發炎相關疾病。巨噬細胞活化綜合症是兒童風濕病(pediatric rheumatology)之發病及死亡的主要原因，亦與幼年特發性關節炎(systemic juvenile idiopathic arthritis，SJIA)及紅斑性狼瘡(lupus erythematosus)高度相關。巨噬細胞活化綜合症之患者會出現包括發燒、肝脾腫大、淋巴節腫大、嚴重的血球減少、凝血障礙及肝功能障礙等症狀。巨噬細胞活化綜合症之相關致病機制與症狀可參見如Gromet al .,Macrophage activation syndrome: advances towards understanding pathogenesis,Current Opinion in Rheumatology,2010. 22: 561-566，該文獻全文併於此處以供參考。
當肝臟發生發炎反應且持續過久而造成肝臟之巨噬細胞(即庫弗細胞)過度活化時，會惡化成慢性肝炎，約百分之二十的慢性肝炎病患最後會引發肝纖維化(liver fibrosis)或肝硬化(liver cirrhosis)、甚至導致死亡。於一實施態樣中，本發明醫藥組合物可有效抑制肝臟巨噬細胞之活化，進而抑制肝炎，因此，其可用於治療肝炎，包括慢性肝炎、肝纖維化或肝硬化。在關節腔內，嚴重且持續的發炎作用會使巨噬細胞過度活化，進而造成關節炎。關節炎係泛指關節產生發炎病變的疾病統稱，依據臨床症狀表現可區分為各種不同種類，例如骨性關節炎(osteoarthritis)、風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、敗血性關節炎(sepsis arthritis)等。於一實施態樣中，本發明醫藥組合物可有效抑制骨中巨噬細胞(或破骨細胞)之活化，進而抑制關節炎，故可用於治療關節炎，尤其可用於治療風濕性關節炎。
另一方面，發炎作用會使巨噬細胞釋放出基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)。基質金屬蛋白酶-9係屬於基質金屬蛋白酶家族，具有裂解膠原及細胞外基質的能力，且與多種疾病之發生有關。舉例言之，於關節中，嚴重且持續的發炎作用會促使巨噬細胞分化成破骨細胞，破骨細胞則進一步釋放出基質金屬蛋白酶-9，其會分解骨質而造成骨損傷。此外，已知基質金屬蛋白酶-9涉及腫瘤細胞之增生、遷移及侵入之機制，其可透過調控血管新生作用(angiogenesis)及分解細胞外基質而幫助腫瘤細胞向外擴散，亦與骨肉癌(osteosarcoma)、肉癌(sarcoma)、淋巴癌、前列腺癌、神經膠母細胞癌(glioblastoma)、黑色素癌、肺癌、胰臟癌、卵巢癌、乳癌等癌症有關。基質金屬蛋白酶-9涉及腫瘤形成之相關內容，可參見如Deryuginaet al .,Matrix metalloproteinases and tumor metastasis,Cancer Metastasis Rev ,2006,25: 9-34，該文獻全文併於此處以供參考。
如後附實施例所示，本發明醫藥組合物可有效抑制基質金屬蛋白酶-9之表現，因此，其可用於治療或抑制與基質金屬蛋白酶-9有關的疾病，例如抑制腫瘤細胞之增生、遷移及/或侵入，以及治療癌症。本發明醫藥組合物尤其可抑制骨肉瘤細胞、肉瘤細胞、淋巴瘤細胞、前列腺癌細胞、神經膠母細胞瘤細胞、黑色素癌細胞、肺癌細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、乳癌細胞等腫瘤細胞之增生、遷移及/或侵入。
本發明醫藥組合物可使用於獸醫與人類醫藥上，且可呈任何形式，並以任何合宜之方式施用。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組合物可以口服、皮下、靜脈或關節內注射等投藥方式施用之。視使用形式及用途而定，可於本發明醫藥組合物中包含一醫藥上可接受之載劑。
以製備適於口服投藥之藥劑形式為例，可於本發明醫藥組合物中含有不會不利影響ECAP活性之醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該組合物製成適於口服投藥的形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。
至於適於皮下、靜脈或關節內注射之藥劑形式，則可於本發明醫藥組合物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、以及其他載劑等成分，以製成如靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。
本發明醫藥組合物可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合理用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善所得藥劑的儲存性。
視需要地，可於本發明醫藥組合物中併含一或多種其他活性成分，進一步加強本發明醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度。舉例言之，可於本發明醫藥組合物含有一或多種如下活性成分：類固醇抗發炎藥物、非類固醇抗發炎藥物、葡萄糖胺(glucosamine)、抗癌藥物、以及其他活性成分等，只要該其他活性成分對ECAP之效益沒有不利的影響即可。
可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用本發明醫藥組合物，端視投予標的之需求而異。舉例言之，當使用於人體以治療風濕性關節炎時，藥劑之用量，以式(I)化合物計，為每天約50毫克/公斤體重至約300毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重所須之投藥量。惟，對於急性病患(如痛風病患)而言，其用量可視實際需要而的增至數倍或數十倍。
本發明亦提供一種用於抑制巨噬細胞活化之方法，其係包含於一有需要之個體上施用一有效量之上述醫藥組合物。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該等實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。
[實施例]
[製備例]　製備ECAP(式(I)化合物)
(1)製備台灣骨碎補萃取物
以75體積%乙醇萃取台灣骨碎補(Davallia formosana )根莖二次，接著在50℃下減壓蒸散溶劑。台灣骨碎補之乙醇萃取物的產率為9.5重量%。本實驗所使用之大葉骨碎補乙醇萃取物之劑量係以該萃取物之乾重計。將乙醇萃取物懸浮於水中並以正丁醇分配，濃縮正丁醇分劃，自乙醇萃取物獲得正丁醇分劃之產率為20.2重量%。
(2)純化ECAP
將該正丁醇分劃(10公克)投入一HP-20管柱(Diaion，NIPPO N RESSUI公司，日本)中，以水至甲醇之順序進行沖提，並獲得八個分劃(分劃1至8)。將分劃6(230毫克)以一製備型高性能液相層析儀(high performance liquid chromatograph，HPLC)進行純化，以獲得一純化合物(136毫克)。製備型HPLC(Shimadzu LC-8A，京都，日本)之使用條件如下：流動相甲醇-水(9:1)；管柱，5C18-MS-II(Cosmosil Nacalai Tesque公司，日本)，內徑10毫米，長250毫米。
以核磁共振(NMR)分析該純化合物(1 H，13 C；Bruker ADVANCE DPX-200，德國)，鑑定該化合物為(-)-表兒茶素-3-O-β-D-吡喃阿洛糖苷(ECAP，式(1)化合物)。ECAP之13 C與1 H核磁共振光譜資料(200 MHz，CDCl3 )係如表1所示。
[實施例1]　抑制巨噬細胞發炎反應試驗
在發炎過程中，巨噬細胞扮演重要角色，其可媒介種種免疫病理反應，於受活化後，會產生各種發炎媒介物質，例如一氧化氮(NO)。由於巨噬細胞可受不同致發炎物質(例如脂多醣(LPS))之刺激而活化，故本實驗以脂多醣活化巨噬細胞釋放一氧化氮的實驗模式，以探討ECAP的抗發炎作用。
實驗A、一氧化氮含量測定
分別添加不同濃度的ECAP(0、10、25及50微克/毫升)至含有RAW 264.7巨噬細胞之96孔盤培養皿(含有Dulbecco’s modified eagle’s培養基(DMEM)、10重量%經熱去活性之胎牛血清、100活性單位/毫升之盤尼西林及100微克/毫升之鏈黴素)中，培養1小時後再添加1微莫耳濃度之脂多醣。培養24小時後，收集上清液，使用革利士試劑(Griess reagent)測定一氧化氮之含量，結果顯示於表2。另以MTS(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)(Promega，麥迪遜市，威斯康星州，美國)測量巨噬細胞之存活率，結果顯示，ECAP或其與脂多醣之組合，皆不影響RAW264.7巨噬細胞的存活率。
實驗B、一氧化氮合成酵素之基因表現測定
將RAW 264.7巨噬細胞培養於6公分的細胞培養盤當中(1×106 個/盤)，接著分別加入不同濃度之ECAP(0、10、25及50微克/毫升)，1小時後再加入脂多醣(1微克/毫升)，培養24小時後刮下細胞，萃取mRNA，以RT-PCR法分析一氧化氮合成酵素(iNOS)的基因表現，並以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內在控制組，使用的引子序列如下表3所示。實驗結果顯示於第1圖及表4。
實驗C、一氧化氮合成酵素之蛋白質表現測定
在6公分的細胞培養盤當中，將RAW 264.7巨噬細胞培養至每盤細胞數為1×106 個，接著分別加入不同濃度之ECAP(0、10、25及50微克/毫升)，1小時後再加入脂多醣(1微克/毫升)，培養24小時後刮下細胞，萃取細胞質的蛋白質，以西方點墨法(western blot)分析一氧化氮合成酵素之蛋白質表現。使用的抗體為抗-兔子iNOS(Ab cam Cambridge，美國)，結果顯示於第2圖及表5。
表2、表4、表5、第1圖及第2圖之結果顯示，ECAP可抑制脂多醣對巨噬細胞之活化作用，進而減少巨噬細胞之一氧化氮合成酵素之基因及蛋白質的表現，使一氧化氮之生成量降低。
實驗A至實驗C之結果說明，ECAP可抑制巨噬細胞活化，進而抑制巨噬細胞之發炎作用。
[實施例2]　抑制四氯化碳誘發小鼠慢性肝炎試驗
實驗D、誘發小鼠之慢性肝炎
將36隻ICR(Institute of Cancer Research)小鼠分成四組，其中一組為控制組，其他三組則以四氯化碳(CCl4 )誘發肝損傷及纖維化，且每週兩次經口投予10%四氯化碳(溶於橄欖油，0.1毫升/10公克)，為期8週。另外，三組四氯化碳組亦分別每天經口投予0.5重量%羧甲基纖維素(carboxyl methyl cellulose，CMC)、或ECAP(100、200毫克/公斤)，為期8週。投藥終了，使小鼠在CO2 麻醉下進行腹腔靜脈採血，以測定血漿生化值。接著迅速取下肝臟，以冰冷生理食鹽水洗淨。將肝臟分成四份並分別浸於10體積%中性福馬林中供病理切片用，接著在100℃下烘乾並儲存於-80℃備用。
實驗E、麩氨酸丙氨基轉氨酶及麩氨酸草乙酸轉氨酶活性試驗
將實驗D取得之血液以4700轉/分鐘離心15分鐘，使用自動生化儀(Cobas Mira；Roche，Rotkreuz，瑞士)及市售試劑(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)測定麩氨酸丙氨基轉氨酶(ALT)及血漿麩氨酸草乙酸轉氨酶(AST)之活性，血漿ALT及AST是肝臟發炎的指標。結果顯示於表6。
如表6所示，ECAP能抑制四氯化碳引起之小鼠血漿ALT及AST活性的上升，因此，此結果說明ECAP能減輕由四氯化碳引起之小鼠肝藏的發炎。
實驗F、肝臟纖維化程度測定-組織染色分析
將實驗D之肝臟組織以福馬林固定後，進行石臘包埋及切片，使用蘇木精-伊紅染色染色(Hematoxylin and eosin stain)，結果如第3圖所示，ECAP能減輕四氯化碳引起之嚴重肝細胞壞死情形。
所有慢性肝炎或肝損傷都會引起肝臟纖維化，由於肝臟纖維化主要是來自細胞外基質膠原蛋白的增生，故測定肝臟中膠原蛋白的含量可以推估纖維化的程度。因此，接著進行膠原蛋白的特殊染色，即天狼星紅染色(Sirius Red stain)，並使用影像分析系統(Image-Pro Plus版本5.1；Media Cybernetics，馬里蘭州，美國)分析肝臟纖維化的比例。結果顯示於第4圖及表7。
如第4圖及表7所示，ECAP能減輕肝臟纖維化的程度。
實驗G、肝臟纖維化程度測定-膠原蛋白分析
由於羥脯胺酸(hydroxyproline)是膠原蛋白中特殊的胺基酸，因此測定肝臟中羥脯胺酸的含量可以推估纖維化的程度。肝臟組織之羥脯胺酸含量測定係參照Neuman及Logan之方法(Neuman RE.,Logan MA. The determination of hydroxyproline.J .Biol .Chem . 1950;184:299-306，該文獻全文併於此處以供參考)。肝臟乾組織水解後加入H2 O2 進行氧化，再以對-二甲基胺基苯甲醛(p-dimethylaminobenzoaldehyde)呈色，於540奈米波長下測定吸光值。結果顯示於表8。
表8的結果顯示，ECAP能降低由四氯化碳提升之肝臟羥脯胺酸的含量，說明ECAP能減緩肝臟纖維化。
實驗H、肝臟庫弗細胞活化之測定-免疫染色分析
四氯化碳引起的肝炎可經由脂多醣的產生而活化肝臟的巨噬細胞(即庫弗細胞)，使其產生細胞激素而造成肝損傷。脂多醣可作用於庫弗細胞的CD14而活化庫弗細胞的發炎反應(此可參見如Su,G,L.,2002. Lipopolysaccharides in liver injury: molecular mechanisms of Kupffer cell activation.Am .J .Physiol . 283,G256-G265，該文獻全文併於此處以供參考)。因此進行CD14的免疫染色，由CD14的表現可以判定ECAP是否可經由抑制庫弗細胞的活化，而減輕肝纖維化的產生。
本實驗將病理切片經脫臘及酒精脫水處理後，以3體積% H2 O2 去除內源性過氧化酶，再加入5體積%牛乳反應30分鐘，以阻斷非特異性的結合，接著加入CD14抗體，於室溫下培養2小時後，以磷酸鹽緩衝液(Phosphate Buffered Saline，PBS)沖洗，再加入二級抗體於室溫下培養30分鐘，接著利用免疫偵測套組及二胺基聯苯胺(diaminobenzidine)呈色，最後以蘇木紫染色，脫水完成後封片。
結果如第5圖所示，ECAP可減少CD14的表現，說明ECAP能抑制庫弗細胞的活化，而減輕肝臟纖維化的產生。
[實施例3]　抑制第二型膠原蛋白誘發小鼠關節炎試驗
實驗I、關節炎症狀檢視評估
風溼性關節炎是一種關節腔的慢性發炎，長期發炎會刺激關節腔中的巨噬細胞分化成破骨細胞，破骨細胞會產生基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)分解骨質造成骨損傷。此外，基質金屬蛋白酶-9亦與腫瘤細胞之增生、遷移及/或侵入有關。
本實驗使用約25公克重之DBA/1J雄性小鼠(The Jackson Laboratory，巴爾港，緬因州，美國)。小鼠飼養於恆溫控制(21-24℃)之動物房，以12小時光照週期(光照時間：早上8點至晚上8點)，並提供標準小鼠飼料食用。將小鼠隨機分成四組，每組各6隻小鼠，其中一組為控制組，其他三組為第二型膠原蛋白(Collagen type II，CII)誘發的關節炎模型組(CIA組)。CII溶於50毫莫耳濃度之醋酸溶液中，置於4℃冰箱隔夜使其充分溶解，再配製成濃度為2毫克/毫升。以100微升CII溶液加上100微升完全佛蘭氏佐劑(complete freund's adjuvant，CFA)的比例進行乳化。乳化完成後，於老鼠尾巴皮下注射(100微克/隻)。21天之後，以等比例之不完全佛蘭氏佐劑(incomplete freund's adjuvant，IFA)與CII進行乳化。乳化完成後，於老鼠尾巴進行皮下注射(100微克/隻)。三組致敏後的CIA小鼠分成H2 O對照組(10毫升/公斤)，及ECAP組(50、100毫克/公斤)組。於CII追加注射後隔天開始投予藥物，持續投予20天。CIA小鼠於第21天犧牲、採血，並取下脾臟、腹股溝淋巴節、及兩隻後腳踝供後續分析。
將老鼠進行致敏後後，參考Thorbecke等人的實驗方法(Thorbeckeet al . Modulation by cytokines of induction of oral tolerance to type II collagen.Arthritis Rheum ,1999,42(1): 110-8，該文獻全文併於此處以供參考)，每5天觀察1次，以下列五種程度區別作為檢視評分之依據，紀錄其四肢關節的紅腫、脹大等變化情形：
0：未呈現任何關節炎症狀。
1：腳掌及足付部(tarsus)呈紅色，且輕微腫。
2：足付部及踝部中度紅腫。
3：足付部及踝部嚴重紅腫。
4：關節僵硬、骨頭變形。
實驗結果顯示於第6A圖及第6B圖。
實驗J、病理組織切片分析
實驗I之CIA小鼠犧牲後，將右腳掌連接到脛骨部分切除，並浸泡在10體積%福馬林中固定，隔天將腳掌取出剔除週遭的肌肉及毛皮，更換10體積%福馬林浸泡一週，再更換15重量%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，2天更換一次脫鈣液，兩週後進行石蠟包埋切片。使用一般的蘇木精及伊紅染色，結果顯示於第7圖。
接著進行免疫組織染色，以抗-兔子MMP-9(Millipore，麻薩諸塞州，美國)及3,3'-二胺基聯苯胺免疫偵測套組(Sigma-Aldrich t. Louis，密蘇裡州，美國)反應呈色，並以光學顯微鏡觀察。結果顯示於第8圖。
實 驗K、腳掌組織RT-PCR分析
以液態氮將小鼠腳掌冷凍並磨碎，抽取RNA後轉成cDNA，以RT-PCR分析細胞激素IL-1β(介白素-1β)及基質金屬蛋白酶-9的mRNA含量，使用的引子序列如下表9所示。實驗結果顯示於第9A至9C圖及表10。
實驗I至實驗K的結果(第6A至9C圖及表10)顯示，ECAP能明顯抑制第二型膠原蛋白誘發之DBA/1J小鼠的關節炎，且除了抑制發炎外，骨頭的損傷也較輕。此外，ECAP也能抑制基質金屬蛋白酶-9及IL-1β的基因表現，基質金屬蛋白酶-9具有分解骨質的作用，是關節炎引起骨質損傷的主要因素。以下以細胞實驗探討ECAP抑制基質金屬蛋白酶-9之表現的相關機轉。
[實施例4]　抑制RANKL刺激巨噬細胞釋放MMP-9試驗
實驗L、RT-PCR分析
分別添加不同濃度的ECAP(0、10、25及50微克/毫升)至含有RAW 264.7巨噬細胞之培養皿(包含α-MEM(α-minimum essential medium)、10重量%經熱去活性之胎牛血清、1重量% PSA(含盤尼西林、鏈黴素、兩性黴素(Amphotericin))，1小時後再添加50奈克/毫升核因子κB受體活化因子配基(receptor for activation of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)。培養24小時後，收集細胞，抽取RNA進行RT-PCR分析，使用的引子與實施例3之表9所使用的引子相同。
結果顯示於第10圖及表11。
實驗M、酶譜試驗分析
由於基質金屬蛋白酶-9具有分解明膠的功能，因此藉由酶譜分析(zymography assay)可檢視基質金屬蛋白酶-9的含量。首先收集前述細胞培養液，並於1000×g、4℃下離心10分鐘，取上清液進行酶譜試驗：取30微克培養液加上4倍的追蹤染劑(loading dye)反應10分鐘，以10體積%之SDS-PAGE進行電泳，其中解析凝膠(resolving gel)含0.1體積%明膠(gelatin)，之後將電泳膠片以清洗緩衝液(3體積% Triton X-100)浸泡30分鐘2次，然後加入顯影(developing)緩衝液(50毫莫耳濃度Tris鹼、40毫莫耳濃度HCl、200毫莫耳濃度NaCl、5毫莫耳濃度CaCl2 、0.2重量/體積%之NaN3 )搖晃30分鐘，洗掉再加入顯影緩衝液，於37℃下反應16小時，最後將膠片以考馬斯亮藍(Coomassie blue)(0.2重量/體積%考馬斯亮藍R-250、50體積%甲醇、10體積%醋酸)染色30分鐘，再以褪色液(10體積%醋酸及30體積%甲醇)退染，每15分鐘換一次褪色液。待退染完成後，先將膠片浸泡於乾膠液(50體積%去離子水、50體積%甲醇、及0.33體積%甘油)30分鐘，再以玻璃紙及壓克力板將膠片製成乾膠觀察。結果顯示於第11圖及表12。
實驗N、螢光素酶試驗分析
將Raw 264.7巨噬細胞隔夜培養於24孔培養盤中(5×104 個/孔)，再將pGL3.0-MMP-9啟動子以轉染方式送到細胞內，16小時後先加入ECAP(10、25、50毫克/毫升)再加入RANKL(50奈克/毫升)刺激24小時後，檢測報導基因(reporter gene)的表現。方法如下：
(1)製備質體DNA
將含有重組質體的DH5α大腸桿菌菌株隔夜培養在含有50微克/毫升安比西林(ampicillin)的LB培養液中，再以Midi kit(QIAGEN，瓦倫西亞，加利福尼亞州，美國)抽取質體DNA備用。其方法簡述如下：菌液於4℃下以6,000×g離心30分鐘，倒掉上清液，加入4.5毫升緩衝液S1，使之與細菌混合均勻。接著加入4.5毫升緩衝液S2並輕微搖晃4至6次後，靜置室溫5分鐘，再加入4.5毫升緩衝液S3K並立刻混合均勻，靜置室溫5分鐘，再加入4.5毫升緩衝液B並輕微搖晃4至6次後，於4℃下以5000×g離心30分鐘。再將上個步驟得到的上清液利用重力通過Midiprep注射過濾器過濾雜質，再將清澈過濾液利用重力通過Midiprep管柱。加入7毫升W1緩衝液沖洗管柱，再加入8毫升緩衝液W2沖洗管柱。將底部的Midiprep管柱取出放置在2毫升微量離心管上，於4℃下以12000×g離心2分鐘，去除殘餘的緩衝液W2，再以預熱(65℃)之沖提緩衝液(elution buffer)使質體DNA溶離出來。使用分光光度計檢測260奈米及280奈米波長之吸光值，以定量DNA之濃度及純度，並將DNA置於-80℃備用。
(2)轉染
將Raw 264.7巨噬細胞隔夜培養於24孔培養盤中(5×104 個/孔)。隔日，將0.5微克質體DNA與200微升不含FBS的培養液混合後短暫離心(spin down)後，再加入1微升jetPRIMETM 混合後短暫離心，接著置於室溫10分鐘。將0.5微克質體DNA分別含有0.4微克pNF-κB-Luc，再加上0.1微克pRL-TKY載體。不含FBS的培養液沖洗細胞二次後，於每孔中加入200微升不含FBS的培養液，再加入200微升前述已混合好之含有質體DNA/jetPRIMETM 的培養液。4小時後加入含有20重量% FBS、2重量% PSA的培養液。隔日，以PBS沖洗細胞二次並加入1毫升新鮮的培養液。接著以ECAP前處理pNF-κB-Luc轉染的細胞1小時，再以RANKL(50奈克/毫升)處理24小時。
(3)檢測報導基因表現
前述反應結束後，以冰的PBS沖洗細胞二次，再加入100微升被動溶菌緩衝液(passive lysis buffer，Promega，麥迪遜，威斯康辛，美國)，接著刮下細胞並移至離心管中，置於-80℃與室溫之間反覆解凍3遍後，於4℃下以12,000×g離心1分鐘後取出上清液。接著以Dual-Luciferase reporter assay kit(Promega，麥迪遜，威斯康辛，美國)檢測螢火蟲螢光酵素(firefly luciferase)活性及水母螢光酵素(renilla luciferase)活性(作為轉染效率對照用)。試驗步驟如下：取出50微升上一步驟得到的上清液至試管中，將試管放入冷光儀(TD-20/20 Luminometer)，量測背景值5秒，接著注入100微升螢光酵素分析試劑(luciferase assay reagent II)，混合均勻，連續記錄生物冷光(bioluminescence)10秒鐘，最後再加入100微升之試劑(Stop and Glo reagent)混合均勻，記錄生物冷光10秒鐘。結果如第12圖及表13所示。
由實驗L至實驗N之試驗結果(第10圖至第12圖及表11至表13)可看出ECAP具有抑制RANKL刺激巨噬細胞之基質金屬蛋白酶-9之基因及蛋白質表現的功效。
[實施例5]　經由NF-κB途徑抑制MMP-9表現試驗
實驗O、電泳移動偏移試驗
NF-κB(核因子-κB)是調節多種基因轉錄的核因子，正常情況下存在細胞質中以p65/p50二聚體形式與IκB(inhibitory protein of NF-κB)蛋白質結合。當受到刺激時，IκB會經由IκB激酶之作用而受到磷酸化，經磷酸化的IκB(p-IκB)會被降解而使NF-κB活化而進入細胞核內參與基因轉錄，影響NFATc1(Nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1)等轉錄調節蛋白質的表現，進而影響基質金屬蛋白酶-9之表現。
利用電泳移動偏移試驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)測試ECAP是否可經由抑制NF-κB進入巨噬細胞之細胞核的量，而抑制基質金屬蛋白酶-9之表現。
本實驗分別添加不同濃度的ECAP(0、10、25及50微克/毫升)至含有RAW 264.7巨噬細胞之培養皿，培養1小時後再加入RANKL(50奈克/毫升)培養60分鐘後，分別萃取出細胞核中的蛋白質，進行EMSA分析，所使用之DNA序列如下：
cy5-5'-TCGACCAACTGGGGACTCTCCCTTTGGGAACA-3'(SEQ ID NO. 11)
cy5-5'-TCGATGTTCCCAAAGGGAGAGTCCCCAGTTGG-3'(SEQ ID NO. 12)。
結果顯示於第13A圖、第13B圖及表14。
第13A圖、第13B圖及表14之試驗結果顯示，ECAP可抑制經RANKL刺激之巨噬細胞中NF-κB的轉移作用。
實驗P、西方點墨法分析
本實驗添加分化劑RANKL(50奈克/毫升)至含有RAW 264.7巨噬細胞之培養皿中，再分別添加不同濃度的ECAP(0、10、25及50微克/毫升)進行試驗。將RAW 264.7巨噬細胞培養60分鐘後，取出細胞核及細胞質中的蛋白質，以西方點墨法分別分析細胞核內p65及細胞質p-IκBα蛋白質表現，並抽出全細胞的蛋白質，以西方點墨法分析NFATc1蛋白質表現，結果顯示於第14圖、第15圖及表15。
第14圖、第15圖及表15之結果顯示，ECAP可抑制p65及p-IκBα蛋白質表現，並減少NF-κB進入細胞核的量，進而降低基質金屬蛋白酶-9蛋白質表現。因此，ECAP可透過減少巨噬細胞之NF-κB進入其細胞核的量，從而抑制基質金屬蛋白酶-9的表現。
由實施例3至5可知，ECAP可抑制基質金屬蛋白酶-9之表現，故可用於治療與基質金屬蛋白酶-9有關之疾病，例如用於抑制腫瘤細胞之增生、遷移及/或侵入。
<110> 中國醫藥大學
<120> 用於抑制巨噬細胞活化之醫藥組合物及其用途
<130> 無
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> iNOS之正向引子
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> iNOS之反向引子
<400> 2
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GAPDH之正向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> GAPDH之反向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> IL-1 β之反向引子
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> IL-1 β之正向引子
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> IL-1 β之反向引子
<400> 7
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> IL-1 β之反向引子
<400> 8
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> MMP-9之正向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> MMP-9之反向引子
<400> 10
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 進行NF-κ B之電泳移動偏移試驗的序列
<400> 11
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 進行NF-κ B之電泳移動偏移試驗的序列
<400> 12
第1圖所示為ECAP抑制巨噬細胞一氧化氮合成酵素(iNOS)mRNA表現的電泳圖及統計直條圖；
第2圖所示為ECAP抑制巨噬細胞一氧化氮合成酵素蛋白質表現的電泳圖及統計直條圖；
第3圖所示為四氯化碳引起小鼠肝藏發炎之蘇木精-伊紅染色圖；
第4圖所示為四氯化碳引起小鼠肝藏發炎之天狼星紅染色圖；
第5圖所示為四氯化碳引起小鼠肝藏發炎之CD14免疫染色圖；
第6A及6B圖所示為ECAP抑制第二型膠原蛋白誘發小鼠關節炎之照片及評分曲線圖；
第7圖所示為ECAP抑制第二型膠原蛋白誘發小鼠關節炎之蘇木精-伊紅染色圖；
第8圖所示為ECAP抑制第二型膠原蛋白誘發小鼠關節炎之基質金屬蛋白酶-9表現的免疫組織染色圖；
第9A至9C圖所示為ECAP抑制第二型膠原蛋白誘發小鼠關節炎之基質金屬蛋白酶-9及IL-1β之mRNA表現的電泳圖及統計直條圖；
第10圖所示為ECAP抑制經RANKL刺激之巨噬細胞之基質金屬蛋白酶-9基因表現的電泳圖及統計直條圖；
第11圖所示為ECAP抑制經RANKL刺激之巨噬細胞之基質金屬蛋白酶-9蛋白質表現的電泳圖及統計直條圖；
第12圖所示為ECAP抑制經RANKL刺激之巨噬細胞之基質金屬蛋白酶-9蛋白質表現的統計直條圖；
第13A及13B圖所示為ECAP抑制經RANKL刺激之巨噬細胞之細胞核內NF-κB蛋白質的EMSA電泳圖及統計直條圖；
第14圖所示為ECAP抑制經RANKL刺激之巨噬細胞之p65及p-IκBα蛋白質表現的電泳圖；以及
第15圖所示為ECAP抑制經RANKL刺激之巨噬細胞之NFATc-1表現的蛋白質電泳圖及mRNA統計直條圖；

Claims (8)

  1. 一種使用一活性成分在製造抑制巨噬細胞活化之藥物的用途，其中該活性成分係選自以下群組之至少一者：式(I)化合物及其醫藥上可接受鹽：
  2. 如請求項1之用途，其中該活性成分係式(I)化合物。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該藥物係用於選自以下群組之至少一者：治療巨噬細胞活化綜合症(macrophage activation syndrome，MAS)、治療或抑制發炎、及抑制基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)之表現。
  4. 如請求項3之用途，其中該藥物係用於抑制基質金屬蛋白酶-9之表現。
  5. 如請求項3之用途，其中該藥物係用於治療關節炎及肝炎之至少一者。
  6. 如請求項5之用途，其中該藥物係用於治療風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)。
  7. 如請求項4之用途，其中該藥物係用於抑制選自以下群組之至少一者：腫瘤細胞之增生、腫瘤細胞之遷移、及腫瘤細胞之侵入。
  8. 如請求項7之用途，其中該腫瘤細胞係選自以下群組：骨肉瘤細胞、肉瘤細胞、淋巴瘤細胞、前列腺癌細胞、神經膠母細胞瘤細胞、黑色素癌細胞、肺癌細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、乳癌細胞、及其組合。
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