CN113387995B - 一种从马桑狗帮中提取分离的三萜化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种从马桑狗帮中提取分离的三萜化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为一种新结构三萜化合物及其制备方法和应用，具体涉及从虎耳草科Saxiffagaceae落新妇属Astilbe植物大落新妇A.grandis Stapf ex Wils.的根中提取分离鉴定出该三萜化合物及其制备方法和应用。本发明提供的化合物结构新颖，化合物为C7位和C27位形成一个五元内酯环结构的新齐墩果烷型三萜，在专利和文献中未见报道。化合物分子式确定为C32H46O5，命名为3β‑acetoxyolean‑12‑en‑6‑oxo‑7α,27α‑olide(astigranlactone)。经研究发现本发明的新化合物具有抗炎和抗肿瘤活性，可作为在制备抗炎和抗肿瘤药物中的应用，并为其制备新型三萜类物质药用研究等方面提供了可靠的依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药的提取、分离领域，尤其涉及从药材马桑狗帮中提取、分离和鉴定出的新化合物及其制备方法，具体为一种从马桑狗帮中提取分离的化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)及其制备方法和应用。
背景内容
马桑狗帮为虎耳草科Saxiffagaceae落新妇属Astilbe植物大落新妇A.grandisStapf ex Wils.的根，其同属植物在我国有7种和2变种，全国大部分地区均有分布。本属植物主要有6种用作民族民间草药，在苗族地区以落新妇(A.chinensis)和大落新妇(A.grandis)最为常用，并把这两种药作为马桑狗帮使用，其中以大落新妇资源最为丰富，在贵州黔东南一带苗族地区主要用以治疗跌打损伤，筋骨疼痛、关节疼痛、风湿病、腰腿痛等，其抗炎、消肿、止痛及活血化瘀方面的功效显著，在苗族治疗跌打损伤疗效显著，素有“打药”之称。该药结合其独特疗法是流行于苗族最为集中分布的贵州黔东南一带用于治疗各种炎症和痛症的有效方法，由于疗效突出而在当地长期使用，广受欢迎。因此，本实验研究苗族地区大落新妇A.grandis根的化学成分及生物活性，从中寻找活性较好的化合物，希望能为该属植物研究的科研工作者提供参考，以便研发出能够用于临床的新药。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种从马桑狗帮中提取分离的新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)及其制备方法和应用，经研究发现本发明的新化合物具有抗炎和抗肿瘤活性。同时提供一种针对本发明新化合物的简便、快速、纯度高的提取分离方法。
本发明提供的所述新化合物分子式为C32H46O5，其化学名称为3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)，化学结构式如下：
上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
A、将干燥马桑狗帮的根粉碎，加90％的甲醇常温浸渍提取。合并提取液，将提取液减压浓缩至无醇味，得马桑狗帮提取物。
B、分液漏斗中将马桑狗帮提取物加水混悬后，经大孔树脂处理，用不同比例的甲醇水系统洗脱，得到不同极性甲醇水洗脱部分。
C、低极性部分采用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏与适量硅胶拌匀，进行硅胶柱层析，采用二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行洗脱，按TLC检测结果将极性相近部分进行分段，共得A、B、C三个流份。
D、A部分静置析出晶体，过滤得粗晶，将粗晶进行重结晶操作得到该化合物。
优选的，步骤A中，所述甲醇的用量与粉碎后的干燥马桑狗帮根的体积比为1：1.5；所述常温浸渍提取周期为90％的甲醇常温浸渍提取3次，每次3天。
优选的，在步骤B中，所述经大孔树脂处理时采用的甲醇水系统分别为纯水、50％甲醇、90％甲醇。
优选的，步骤C中，所述低极性部分采用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏与适量硅胶拌匀，进行硅胶柱层析的低极性部分为90％甲醇洗脱部分。
优选的，在步骤C中，所述硅胶柱层析，采用二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行洗脱，二氯甲烷/甲醇溶剂系统为二氯甲烷/甲醇(100:0、100:1、90:10)。
优选的，在步骤D中，所述将粗晶进行重结晶操作使用溶剂为石油醚。
本发明内容还包括所述的化合物在制备用于抗炎或抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述化合物可以加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
本发明所述的辅料没有限制，药学上能接受即可。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1、本发明中所述马桑狗帮中新化合物的分离纯化、结构特点和药理活性研究未被现有论文期刊所报道。
2、本发明提供来源于马桑狗帮的新化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离纯化方法，采用醇提取、硅胶柱层析、大孔吸附树脂、重结晶等方法进行分离纯化，成功获得新的化合物，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，此外经研究表明以上化合物具有抗炎和抗肿瘤的活性。
3、该新化合物对K562、HMEC有抑制作用，当该化合物的浓度为100μM时，抑制率分别是53.94％、30.05％。该化合物对BGC-823、MG-63、DU-145、HL-60、BEL-7402、MCF-7有抑制作用，当该化合物的浓度为100μM时，其对应的抑制率分别为21.61％、13.59％、13.18％、35.07％、23.18％、34.22％。该化合物对T-24、SK-OV-3、SH-SY5Y、A549有抑制作用，当该化合物浓度为100μM时，他们抑制率的范围在4.73％～13.36％。
4、该新化合物对K562、HMEC、BGC-823、MG-63、DU-145、HL-60、BEL-7402、MCF-7、T-24、SK-OV-3、SH-SY5Y、A549细胞有抑制作用(当该化合物的浓度为100μM时，其对应的抑制率分别为53.94％、30.05％、21.61％、13.59％、13.18％、35.07％、23.18％、34.22％、11.98％、9.03％、13.36％、8.88％)。
5、该新化合物对巨噬细胞(RAW264.7)活化有抑制作用。化合物在浓度为100μM时，活化抑制率为10.81％；化合物在浓度为10μM时，活化抑制率为6.43％；化合物在浓度为1μM时，活化抑制率为4.48％。
附图说明
图1、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的1H-NMR谱图；
图2、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的13C-NMR谱图；
图3、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的DEPT谱图；
图4、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的HMBC谱图；
图5、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的HSQC谱图；
图6、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的COSY谱图；
图7、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的ROSEY谱图。
图8、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的IR谱图。
图9、新化合物3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide(astigranlactone)的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1新化合物的制备
材料来源：马桑狗帮药材于2013年8月采自贵州六盘水，植物标本存放于贵州中医药大学苗医药重点实验室。
提取分离：将干燥马桑狗帮根12.5kg粉碎，加90％的甲醇(甲醇的用量与马桑狗帮根的体积比为1：1.5)常温浸渍提取3次，每次3天，合并提取液，将提取液减压浓缩至无醇味，得马桑狗帮提取物。在分液漏斗中将大落新妇提取物加水混悬后，经大孔树脂处理，依次用纯水、50％甲醇、90％甲醇洗脱，得三个部分，分别为水部分、50％甲醇部分、90％甲醇部分。90％甲醇部分采用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏659.8g，把浸膏与适量硅胶拌匀，硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇溶剂系统(100:0、100:1、90:10)依次进行洗脱，按TLC检测结果将极性相近部分进行分段分离，共得A(6.3g)、B(7.3g)、C(81.3g)三个部分。A部分静置，瓶中析出晶体，过滤得粗晶，将粗晶用石油醚重结晶操作得到该化合物。
实施例2新化合物的结构鉴定
本发明实施例1制备的新化合物为无色透明针状结晶，熔点mp 246.6-248.8℃，旋光[α]21 D+32°(C＝1.23,CHCl3)，根据HRESI[M+Na]+m/z:533.3239(calcd for C32H46O5Na，533.3243)，确定分子式为C32H46O5，不饱和度为10。红外光谱显示了1个羰基(1730cm-1)和1个酯基(1786cm-1)的吸收峰。根据1H-NMR谱信号分析推导出H-12双键上的质子信号为δH5.65(1H,dd,J＝5.4,2.0Hz,H-12)，H-3、H-7次甲基质子信号分别为δH 4.40(1H,dd,J＝11.7,4.1Hz,H-3)和δH 4.18(1H,s,H-7)两个含氧次甲基质子信号，七个甲基信号分别为δH0.84(3H，s，H-28)，0.89(3H，s，H-30)，0.93(3H，s，H-23)，0.96(3H，s，H-29)，0.97(3H，s，H-25)，1.03(3H，s，H-26)，1.29(3H，s，H-24)。结合13C-NMR谱和DEPT谱分析共有32碳，分别为8个甲基、8个亚甲基、6个次甲基、10个季碳，δC 127.4和δC 135.0为C-12、C-13双键上两个碳信号，δC 81.1为C-3的信号。根据已知化合物3β-acetoxyolean-12-en-27-oic acid的1H-NMR谱和13C-NMR谱数据比较，确定该新化合物的基本骨架为齐墩果型三萜化合物类型。
HMBC谱中观察到δH 2.04(3H,s,H-32)和13C-NMR谱δC 21.3(C-32)，170.8(C-31)有远程相关信号，推导出C-3(δC 79.5)连有一个乙酰氧基。H-5(δH 2.80,1H,s)和C-6(δC206.5)、H-7和C-6的远程相关信号，推断有1个羰基连接在C6位。高分辨质谱结果显示该分子具有10个不饱和度，其中分子中的1个双键、3个羰基和5个六元环构成了9个不饱和度，剩余1个不饱和度要求化合物包含一个环状体系。HMBC谱中δH 4.18(1H，s，H-7)和δC 86.1(C-7)，50.9(C-8))，55.3(C-14)，176.7(C-27)有远程相关，H-15(δH 1.48和1.82，2H，m)和C-27远程相关信号，可以推导出C-7和C-27形成了一个内酯环。ROESY谱图中能观察到H-7和H-26(δH 1.03，3H，s)在空间构型上的相关，因此推导出C-7和C-27形成的内酯环为ɑ构型。
综上所述，确定该化合物的结构式如下图，通过Scifinder数据库检索发现该化合物为新化合物，命名为：astigranlactone，化学名3β-acetoxyolean-12-en-6-oxo-7α,27α-olide。该化合物的1H-NMR和13C-NMR数据见如下表。
Data were recorded in 13 CD3OD on a Brucker 150 MHz spectrometer.
astigranlactone的1H-1H COSY
HMBC
和ROESY
实施例3新化合物的抗炎活性测试
筛选模型：巨噬细胞(RAW264.7)活化抑制模型。
筛选方法：采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌表达。
模型原理：巨噬细胞在相关因素刺激下会活化，并分泌表达TFN-α。将样品加入巨噬细胞培养孔中一定时间后，再加入脂多糖(LPS)，孵育培养一定时间后，取细胞上清液测定TFN-α的含量，判断样品对细胞的活化抑制作用。
计算公式：活化抑制率(％)＝[(LPS活化指数-样品活化指数)/LPS活化指数]×100。
以吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)为阳性对照。样品用DMSO溶解，每次筛选平行2次，每次筛选每样品各浓度测试1次，实验结果以M±SD表示。
实验结果显示该新化合物对巨噬细胞(RAW264.7)活化有抑制作用。化合物在浓度为100μM时，活化抑制率为10.81％；化合物在浓度为10μM时，活化抑制率为6.43％；化合物在浓度为1μM时，活化抑制率为4.48％。
化合物的抗炎活性可能与其特殊的结构有关，它结构上的特点是由C27位-COOH和C7位-OH缩合形成一个内酯结构，并在C6为上有一个羰基，这样特殊的结构组成可能是发挥抗炎活性的有效官能团。
实施例4新化合物的抗肿瘤活性测试
筛选模型：抗肿瘤活性物质筛选模型(人肺癌细胞株A549、人白血病细胞株HL-60、人肝癌细胞株BEL-7402、人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株COLO-205、人白血病细胞株K562、人肝癌细胞株BEL-7402、人前列腺癌细胞株DU-145、人卵巢癌细胞株SK-OV-3、人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、人宫颈癌细胞株Hela、人乳腺癌细胞株MCF-7、人微血管内皮细胞HMEC、人成骨肉瘤细胞MG-63、人膀胱癌细胞T-24、胃癌细胞BGC-823)。
筛选方法：四氢唑盐还原法(MTT法)。
模型原理：活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色Formanzan，死细胞此酶消失，MTT不被还原，本模型根据MTT的还原程度来检测样品对肿瘤细胞的作用情况。
计算公式：抑制率(％)＝[(对照组OD值-样品组OD值)/对照组OD值]×100。
以阿霉素为阳性对照。样品用DMSO溶解，样品共进行2次筛选，每次筛选每样品每浓度设置3复孔，实验结果以M±SD表示。
实验结果显示该新化合物对K562、HMEC有抑制作用，当该化合物的浓度为100μM时，抑制率分别是53.94％、30.05％。该化合物对BGC-823、MG-63、DU-145、HL-60、BEL-7402、MCF-7有抑制作用，当该化合物的浓度为100μM时，其对应的抑制率分别为21.61％、13.59％、13.18％、35.07％、23.18％、34.22％。该化合物对T-24、SK-OV-3、SH-SY5Y、A549有抑制作用，当该化合物浓度为100μM时，他们抑制率的范围在4.73％～13.36％。
该化合物对K562、HMEC、BGC-823、MG-63、DU-145、HL-60、BEL-7402、MCF-7、T-24、SK-OV-3、SH-SY5Y、A549细胞有抑制作用(当该化合物的浓度为100μM时，其对应的抑制率分别为53.94％、30.05％、21.61％、13.59％、13.18％、35.07％、23.18％、34.22％、11.98％、9.03％、13.36％、8.88％)。可见，该化合物对多数肿瘤细胞有抑制作用，联系它结构上的特点是由C27位-COOH和C7位-OH缩合形成一个内酯结构，并在C6为上有一个羰基，这样特殊的结构组成可能是发挥抗肿瘤活性的有效官能团。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种从马桑狗帮中提取分离的三萜类化合物，其特征在于，分子式为C32H46O5，化学结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的三萜类化合物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
A、将干燥马桑狗帮的根粉碎，加90％的甲醇常温浸渍提取，合并提取液，将提取液减压浓缩至无醇味，得马桑狗帮提取物；
B、分液漏斗中将马桑狗帮提取物加水混悬后，经大孔树脂处理，用不同比例甲醇水系统洗脱，得到不同极性甲醇水洗脱部分；
C、低极性洗脱部分采用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏与硅胶等量拌匀，进行硅胶柱层析，采用二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行洗脱，按TLC检测结果将极性相近部分进行分段，共得A、B、C三个流份；
D、A部分常温静置析出晶体，过滤得粗晶，将粗晶进行重结晶操作得到该化合物。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：在步骤A中，所述甲醇的用量与粉碎后的干燥马桑狗帮根的体积比为1：1.5；所述常温浸渍提取周期为90％的甲醇常温浸渍提取3次，每次3天。
4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：在步骤B中，所述经大孔树脂处理时采用的甲醇水系统分别为纯水、50％甲醇、90％甲醇。
5.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：在步骤C中，所述低极性部分采用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏与硅胶等量拌匀，进行硅胶柱层析的低极性部分为90％甲醇洗脱部分。
6.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：在步骤C中，所述硅胶柱层析，采用二氯甲烷/甲醇溶剂系统进行洗脱，二氯甲烷/甲醇溶剂系统为二氯甲烷/甲醇，比例为：100:0、100:1、90:10。
7.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：在步骤D中，所述将粗晶进行重结晶操作使用溶剂为石油醚。
8.一种如权利要求1所述化合物在制备抗炎和抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述化合物加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
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